周茂旗 李興明 王憲剛 陳皓楠 張 永

1.成都醫(yī)學院，四川成都 610500；2.四川省內江市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，四川內江 641000

宏基因二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是臨床上一種新興的病原檢測方式，其采用的是半導體芯片測序技術，將堿基對合成核酸鏈的過程轉化為數字信息，將待測的DNA鏈固定在半導體芯片微孔中的微球上，隨后依次摻入ACGT 堿基，符合配對的堿基與待測DNA 鏈形成化學鍵，釋放出氫離子，通過檢測H信號的變化獲得序列堿基信息，將生成序列堿基信息連接到精確的參考基因組數據庫，以識別檢出病原體。

PDC-seq病原微生物宏基因組檢測是通過對生物樣本中提取的核酸進行高通量測序，利用生物信息學進行比對分析，獲取樣本中包含的微生物種類和豐度信息，檢測全面覆蓋16000 多種病原體，包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲等?；?Illumina 測序平臺和 PCR-free 建庫技術，可避免聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引入的擴增偏向性和氣溶膠污染，同時優(yōu)化核酸提取，解決真菌和分支桿菌破壁難、檢出率低等問題，在疑難危重感染病例中有較高的臨床應用價值。

1 mNGS發(fā)展史

臨床應用的元基因組學起源于2000 年初的微陣列，微陣列是一組微觀特征（最常見的是DNA），用目標分子進行探測，以產生定量（基因表達）或定性（診斷）數據。隨著微陣列技術在效率、識別力、敏感度和特異性方面的不斷提高，已被應用于各種病原微生物的檢測、鑒定、新病原體的發(fā)現、抗菌素耐藥性監(jiān)測和菌株分型，而后有學者在Affymetrix基因芯片平臺上開發(fā)了重測序微陣列，應用于呼吸道病原體檢測，可以同時檢測和區(qū)分大量微生物病原體。直至2005 年二代測序技術的出現正式啟動了元基因組學領域，此后，隨著臨床病原微生物檢測的需求越來越大，mNGS 技術逐漸從實驗室步入臨床實踐應用中。近年來mNGS 技術已成功應用于臨床診斷新發(fā)病原體感染，如2013 年Wilson 等應用mNGS 技術在1 例不明原因發(fā)熱、頭痛的聯合免疫缺陷男孩的腦脊液中首次檢測出了神經型鉤端螺旋體感染；2014 年Knittler 等研究者應用mNGS技術診斷了1 例由鸚鵡螺桿菌（傳統(tǒng)常規(guī)微生物檢測難以識別）引起的嚴重肺炎和多器官衰竭病例；2021 年四川省人民醫(yī)院黃曉波團隊用mNGS 診斷了1 例在感染早期迅速發(fā)展為嚴重急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的患者，接受了體外膜氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治療后，并發(fā)軍團菌感染繼發(fā)曲霉菌感染的病原體，目前為止，mNGS 技術在臨床上的應用越來越廣泛。

2 mNGS在病原學檢測中的優(yōu)勢

肺部感染是一個全球性的健康問題，與高發(fā)病率、高死亡率以及不斷增加的住院率相關。目前對于肺部感染的治療多以經驗性抗菌治療為主，然而由于經驗性治存在抗菌藥物濫用、藥物不良反應以及未能覆蓋所有病原菌等風險，治療不當易導致病情惡化，增加患者的死亡風險。由于不能快速診斷和區(qū)分呼吸道感染的病原體，抗生素的過度使用仍然是一個長期問題，因此快速準確識別病原體是合理治療肺部感染的必要條件。我國肺炎患者并未常規(guī)進行呼吸道病毒篩查，在某些病毒感染病例中，mNGS 技術明確了其診斷，并進行了有效診治。對于肺部感染患者，早期實施針對性的治療，對提高患者生存率、改善患者預后尤為重要。臨床上傳統(tǒng)病原學微生物檢測方法包括痰涂片及培養(yǎng)、血培養(yǎng)、PCR、抗原抗體檢測等，痰培養(yǎng)是目前臨床最常用的檢測手段，然而痰培養(yǎng)存在陽性率低、培養(yǎng)周期長、部分病原體培養(yǎng)困難等局限，因此痰培養(yǎng)不能快速提供準確的病原體報告來指導臨床科學合理的用藥。mNGS 技術在病原微生物檢測方面，以高效、快速、準確著稱，其能快速提供呼吸道所有病原微生物檢測報告，覆蓋數據庫中絕大部分病原微生物，尤其是對罕見和新生的微生物的檢測 有著較高的效能，能很大程度上彌補傳統(tǒng)檢測的 不足。

2.1 mNGS 病原檢測陽性率

mNGS 技術在肺部感染患者病原體檢測的陽性檢出率方面顯著高于傳統(tǒng)病原學檢測方法。Wu 等進行的一項前瞻性研究中，納入329 例成人重癥社區(qū)獲得性肺炎患者，完善支氣管鏡檢測，獲取等量肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）同時進行mNGS 檢測和傳統(tǒng)方法檢測病原體，結果發(fā)現mNGS 檢測組中304 例（99.24%）確定了病原體，mNGS 的總微生物檢出率為90.3%，而傳統(tǒng)檢測方法病原檢出率為39.5%（＜0.05）。另外Shi 等對110 例疑似肺結核患者的BALF 標本進行mNGS檢測，并與BALF 或痰標本的常規(guī)微生物檢測進行比較，結果mNGS 的敏感度（67.23%）明顯高于培養(yǎng)（36.36%）、結核分枝桿菌PCR 檢測（45.83%）、抗酸桿菌染色法（29.17%）；有研究發(fā)現，mNGS 測試的敏感度和特異性分別為79.2%（95.0%73.5%～85.2%）和90.6%（95%：87.3%～93.8%），這些研究結果充分證實了mNGS 技術在病原體檢測陽性率方面較傳統(tǒng)檢測法的顯著優(yōu)勢。

2.2 mNGS 病原體檢測準確性

mNGS 技術應用于肺部感染患者能檢測出標本中所有的病原微生物，相比傳統(tǒng)檢測方法檢測范圍更加廣泛，對臨床的診斷也更加準確、全面。有研究發(fā)現，mNGS 技術與結核分枝桿菌PCR 檢測（Xpert）和培養(yǎng)法對結核分枝桿菌的檢測結果的一致性較高，Kappa一致性分析的Kappa值分別為0.702（Xpert 法）和0.809（培養(yǎng)法）；mNGS 技術、Xpert法和培養(yǎng)法的特異性分別為 98.39%、98.39%和100%。Zhou 等進行了一項mNGS 技術檢測肺炎患者BALF 病原體對肺炎的診斷和治療的臨床意義的多中心前瞻性觀察研究，結果表明mNGS 檢測結果與標準檢測結果完全一致的有85 例（一致性為53.5%），64 例患者根據mNGS 結果調整了治療方案（64 例積極影響病例）且明確診斷?？傊琺NGS技術進行病原體檢測的準確性方面較傳統(tǒng)檢測方法更高。

2.3 mNGS 病原體檢測時效性

mNGS 技術應用于肺部感染患者病原體檢測方面，相比傳統(tǒng)檢測方法耗時較少，能快速提供病原體報告，普通細菌培養(yǎng)一般需要48～72h，結核桿菌的培養(yǎng)至少需要4 周，支原體培養(yǎng)至少需要6 周。有研究顯示，mNGS 在3d 內鑒定了119 例感染病例中的80 例（67.23%）病原微生物，這是外送檢測的情況下。若在醫(yī)院應用測序平臺，檢測時間將可能縮短到24h；而常規(guī)方法90d 的檢出率為49.58%（59/119）；常規(guī)檢測方法的平均反饋時間從1d 到60d 不等，Xpert 需要1d 左右，抗酸桿菌染色至少需要3d，真菌血清學試驗通常需要5～7d，病原體培養(yǎng)平均反饋時間中細菌≥3d，真菌≥7d，分枝桿菌為42～60d。臨床上大多數mNGS 檢測報告時間為1～2d，甚至更快，充分證明了mNGS 技術在檢測肺部感染患者病原體方面較傳統(tǒng)檢測方法耗時更少、更加快速。

3 mNGS病原學檢測中的局限性

3.1 假陽性

mNGS 檢測的多數讀數（＞99%）來自人類宿主，因此限制了病原體檢測的總靈敏度。宿主耗竭方法的使用與靶向測序不同，宿主耗竭方法旨在降低mNGS 讀數中人類宿主背景序列的相對比例，而不是利用已知的病原體序列作為靶標，這種方法保留了宏基因組測序無偏見的優(yōu)點，能檢測出樣本中所有的微生物，但不能分辨致病與否、污染與否，在樣本采集過程中、檢測樣品、用于加工的試劑或實驗室環(huán)境中均存在微生物的污染，因此檢測結果存在假陽性可能，假陽性mNGS 結果可能會導致診斷錯誤和治療無效。Zhou 等的研究中，mNGS 檢測出1 例奇異變形桿菌感染，但該標準檢測結果均為陰性，該患者接受了奇異變形桿菌肺炎的針對性治療后療效不佳，最終該病例被診斷為隱源性機化性肺炎，其是一種罕見的間質性肺部疾病，研究結果說明在臨床上不能完全依靠mNGS 檢測結果來作出診斷與治療，還應參考患者其他輔助檢查，結合患者臨床表現與體征進行診治。

3.2 mNGS 檢測結果解釋沒有明確標準

目前許多檢測公司對mNGS 檢測結果的解釋，并沒有一個明確的標準。即使大家基本參照的是微生物基因數據庫，然而不同機構的數據分析人員可能存在主觀偏倚；微生物參考數據庫也存在一些局限：①稀有病原體或新出現的不可知的病原體菌株的參考數據庫不完整。②參考數據庫偏向于某些臨床常規(guī)的微生物。③某些重要的病原體核酸序列可能在遺傳上相似（如分枝桿菌的種類）而難以區(qū)分。④受到正常定植微生物和引入試劑的核酸序列影響，使讀數混；不同平臺在處理數據時存在差異，在檢測過程中的質量控制亦各有千秋。目前臨床上尚無統(tǒng)一的標準流程，因此，不同平臺的檢測結果可能存在些許差異，臨床醫(yī)生在面對該檢測報告時應謹慎思考，給予正確的診治。

4 展望

mNGS 技術應用于肺部感染性疾病的病原體檢測方面既有優(yōu)勢同時也存在局限。目前國內大部分醫(yī)院尚未在院內開展mNGS 檢測實驗室，患者需檢測mNGS，則需將樣本外送基因公司或各大檢測平臺進行檢測，這不僅加大了該項檢測的經濟成本，也增加了樣本污染的機會，限制了該項技術的推廣。然而即使存在局限，在臨床上也應權衡利弊后做出科學合理的抉擇，以免貽誤患者病情。總之，mNGS技術在檢測感染性疾病病原微生物方面的影響是積極的，總體發(fā)展趨勢是向上的，相信在未來的不斷發(fā)展中，mNGS 技術能造福于越來越多的患者，為醫(yī)學發(fā)展做出顯著貢獻。