付尚辰雷穎虎趙鵬鵬張丹輝沈潔娜劉永峰

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,西安 710100;2.秦嶺大熊貓研究中心(陜西省珍稀野生動物救護(hù)基地),西安 710032)

母乳是哺乳動物幼崽的理想食物,它含有多種酶,其中一部分與乳腺中乳汁分泌有關(guān),一部分與新生幼崽對母乳中蛋白質(zhì)、脂肪或碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收有關(guān),還有少部分參與新生幼崽免疫系統(tǒng)的形成[1-2]。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)是母乳中兩類重要的氧化還原酶,在新生幼崽腸道中發(fā)揮一定的抗菌免疫作用[3-4]。XO 在乳中主要存在于乳脂球膜中,可以氧化黃嘌呤或次黃嘌呤,產(chǎn)生尿酸以及能殺死微生物的活性氧[5]。Ozturk 等[6]通過模擬口腔環(huán)境檢測牛乳中XO 的抗菌活性,發(fā)現(xiàn)牛乳中的XO 可通過氧化次黃嘌呤和(或)黃嘌呤產(chǎn)生H2O2,有效抑制幾種革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌病原體的生長。此外,乳汁是新生幼崽外源性多胺的第一來源,其中PAO 是調(diào)節(jié)機(jī)體多胺代謝的重要氧化還原酶之一,它可以催化精胺和亞精胺氧化脫氨,產(chǎn)生腐胺、氨和H2O2,參與新生兒腸道成熟過程[7-8]。Bjelakovic等[9]通過測定人乳多胺代謝過程中的PAO 和二胺氧化酶活性,發(fā)現(xiàn)人乳中PAO 的活性產(chǎn)物可能具有潛在的抗菌作用,從而對嬰兒具有一定的保護(hù)作用。

新生大熊貓幼崽體質(zhì)量約為100 g,生長發(fā)育水平很低且高度依賴初乳[10]。Griffiths等[11]通過蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究表明,大熊貓乳的初乳期約為30 d。初乳對大熊貓新生幼崽的存活具有決定性作用,沒有吃到初乳的幼崽均會死亡[12],1 m L大熊貓初乳可能挽救1只熊貓幼崽;并且大熊貓幼崽在斷乳后抵抗力明顯減弱,極易感染胃腸道和呼吸道相關(guān)疾病[13]。目前,大熊貓乳汁與新生幼崽免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系已經(jīng)受到研究人員的關(guān)注。王成東等[14]發(fā)現(xiàn)大熊貓初乳中免疫球蛋白主要為Ig A,其含量低于人乳,高于牛羊乳。Ma等[15]發(fā)現(xiàn)母乳能促進(jìn)大熊貓幼崽對母體miRNA 的攝入,可調(diào)節(jié)幼崽產(chǎn)后免疫和發(fā)育。另外,隨著大熊貓人工繁殖技術(shù)的日益成熟,大熊貓產(chǎn)雙胞胎的概率也隨之提高,其產(chǎn)后泌乳量難以同時滿足兩只幼崽成長的需要[16],且絕大多數(shù)大熊貓在初乳期結(jié)束后會敏感易怒、極易傷人,因此大熊貓常乳難以采集,飼養(yǎng)人員通常會將大熊貓初乳冷凍保存,用于大熊貓產(chǎn)后缺乳、產(chǎn)多胎等情況的應(yīng)急。截止目前,珍貴的大熊貓初乳中具有抗菌免疫作用的XO 和PAO 兩類氧化還原酶的活性研究尚無報道,因此本研究圍繞此問題開展試驗(yàn),以利于大熊貓初乳免疫作用的明晰。

綜上,乳中XO 和PAO 與新生幼崽良好腸道環(huán)境的形成和免疫系統(tǒng)的構(gòu)建密切相關(guān)。本研究采用冷凍牛、羊乳和新鮮牛、羊乳建立XO 和PAO 活性的Amplex Red熒光法檢測方法,再檢測冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO 活性,并與新鮮和冷凍牛、羊乳中XO、PAO 活性進(jìn)行對比,以期為大熊貓乳汁中XO 和PAO 活性及其協(xié)同抗菌免疫機(jī)制的明晰奠定理論基礎(chǔ),對人工大熊貓育幼具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳樣及來源 大熊貓初乳采集于陜西省林業(yè)科學(xué)院秦嶺大熊貓繁育研究中心(陜西,樓觀臺)飼養(yǎng)的一只產(chǎn)后17 d的健康大熊貓,用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室儲存于-80 ℃冰箱,備用;牛、山羊乳采集于陜西省西安市長安區(qū)奶牛和奶山羊養(yǎng)殖大戶,新鮮乳樣品采集后用低溫冰盒快速帶回放入普通冰箱冷藏室,備用。冷凍乳樣品儲存于-80 ℃超低溫冰箱,備用。

1.1.2 主要試劑及儀器 體積分?jǐn)?shù)30% H2O2、次黃嘌呤、精胺、辣根過氧化物酶(HRP)、10-乙酰基-3,7-二羥基吩嗪(ADHP,AR)、二甲基亞砜、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,p H=7),所有試劑均為分析純;200μL 黑色96孔酶標(biāo)板購于西安晶博有限公司;多功能酶標(biāo)儀(Synergy H1,Gene Company Limited,美國)、普通冰箱(578WPU9C,美菱,合肥)、超低溫冷凍冰箱(LOW-HL388,美菱,合肥)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取10μL乳樣與990μL去離子水充分震蕩混合,配置1%乳樣;取50μL、40 μL、25μL、13μL、5μL 1%乳樣分別與450μL、534μL、475μL、507μL、495μL 去離子水混合,配置0.10%、0.075%、0.05%、0.025%、0.01%的梯度稀釋乳樣。

1.2.2 H2O2標(biāo)曲繪制 參照Zou等[17-18]方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。用30%的H2O2溶液與去離子水混合分別配置濃度為1、2、4、6、8μmol/L 的H2O2工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。將976 μL 100 mmol/L PBS(p H=7)、4μL 200 U/m L HRP和20μL 10 mmol/L ADHP 混合均勻配置“H2O2反應(yīng)混合物”工作液。分別將50μL 不同濃度的H2O2工作液與50μL“H2O2反應(yīng)混合物”工作液添加到96孔不透明微量滴定板的每個孔中,使用多功能酶標(biāo)儀37 ℃溫育3 min后(發(fā)射波長590 nm,激發(fā)波長544 nm)進(jìn)行吸光度測定。

以H2O2的濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y=61 717x-3 140,R2=0.995 7。

1.2.3 XO 活性檢測 根據(jù)Zou等[17]的試驗(yàn)結(jié)果選取最佳XO 反應(yīng)條件。將956 μL 100 mmol/L PBS(p H=7)、20μL 10 mmol/L次黃嘌呤、4μL 200 U/m L HRP 和20μL 10 mmol/L ADHP混合均勻配置“XO 檢測混合物”工作液。將936μL 100 mmol/L PBS(p H=7)、40μL 去離子水、4 μL 200 U/m L HRP 和20 μL 10 mmol/L ADHP混合均勻配置“XO 空白混合物”工作液。分別將50μL 乳汁稀釋樣品加入96孔不透明微量滴定板中,再添加50μL 的“XO 檢測混合物”(XO 空白混合物),乳中所含的XO 與“XO 檢測混合物”中的次黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2。使用多功能酶標(biāo)儀在37 ℃恒溫(發(fā)射波長590 nm,激發(fā)波長544 nm)條件下,對反應(yīng)體系內(nèi)H2O2與ADHP 氧化結(jié)合后生成的熒光間苯二酚進(jìn)行吸光度測定,每90 s讀取1 次讀數(shù),持續(xù)監(jiān)測30 min。根據(jù)公式計算不同種類乳汁樣品中XO 活性:

酶活力(U/L)=K1/K2×稀釋倍數(shù)

其中K1表示乳汁樣品吸光度值相對于時間的斜率(減去空白的斜率后),K2表示H2O2吸光值相對于H2O2濃度的斜率,U 為本試驗(yàn)條件(以次黃嘌呤作為底物)下每分鐘釋放1μmol H2O2所需XO 的量。

1.2.4 PAO 活性檢測 根據(jù)Zou等[17]的試驗(yàn)結(jié)果選取最佳PAO 反應(yīng)條件。將936μL 100 mmol/L PBS(p H=7)、40μL 10 mmol/L精胺、4 μL 200 U/m L HRP和20μL 10 mmol/L ADHP混合均勻配置“PAO 檢測混合物”工作液。將936μL 100 mmol/L PBS(p H=7)、40μL去離子水、4μL 200 U/m L HRP 和20μL 10 mmol/L ADHP混合均勻配置“PAO 空白混合物”工作液。分別將50μL 乳汁稀釋樣品加入96孔不透明側(cè)微量滴定板的每個孔中,再向孔中添加50μL的“PAO 檢測混合物”(PAO 空白混合物),乳中所含的PAO 與“PAO 檢測混合物”中的精胺發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2。PAO 活性檢測與計算同上述XO 活性檢測。U 為本試驗(yàn)條件(以精胺為底物)下每分鐘釋放1μmol H2O2所需PAO 的量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)設(shè)置3個重復(fù),每個樣品平行測定3次。采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和吸光度值初步分析,結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示,采用GraphPad Prism 6.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛、羊鮮乳和冷凍乳中XO 和PAO 的活性

2.1.1 XO 活性 為探究Amplex Red熒光法對微量乳中XO 活性檢測的適用性以及凍藏對乳中XO 活性的影響,使用Amplex Red熒光法檢測不同濃度鮮牛、羊乳和冷凍牛、羊乳中XO 活性,結(jié)果如圖1所示。XO 活性在5個不同濃度乳樣中均保持穩(wěn)定狀態(tài),各組之間無顯著性差異(P＞0.05)。不同濃度鮮牛乳、鮮羊乳、冷凍牛乳、冷凍羊乳中XO 活性分別為2.1～2.5 U/L、0.31～0.36 U/L、0.76～0.88 U/L、0.1～0.13 U/L;鮮乳中XO 活性均極顯著高于冷凍乳(P＜0.01),牛乳中該酶活性均極顯著高于羊乳(P＜0.01),牛、羊乳中XO 活性總體差異未受到凍藏處理的影響。

圖1 鮮乳與冷凍乳的XO 活性Fig.1 XO activities of fresh and frozen milk

2.1.2 牛、羊鮮乳和冷凍乳的PAO 活性 不同濃度鮮乳、冷凍乳中PAO 活性如圖2 所示。PAO 活性在5個不同濃度乳樣中保持穩(wěn)定狀態(tài),各組之間無顯著性差異(P＞0.05)。不同濃度鮮牛乳、鮮羊乳、冷凍牛乳、冷凍羊乳中PAO 活性分別為0.31～0.34 U/L、0.16～0.18 U/L、0.1～0.12 U/L、0.053～0.06 U/L。鮮乳中PAO 活性均極顯著高于冷凍乳(P＜0.01),牛乳中該酶活性均極顯著高于羊乳(P＜0.01),牛、羊乳中PAO活性總體差異未受到凍藏處理的影響。

圖2 鮮乳與冷凍乳的PAO 活性Fig.2 PAO activities of fresh and frozen milk

2.1.3 乳中XO 與PAO 活性測定方法評價Amplex Red 熒光法測定結(jié)果(“2.1.1”和“2.1.2”)表明,牛、羊鮮乳和冷凍乳中XO 和PAO 活性在不同稀釋倍數(shù)(1 000～10 000)下,各組之間均無顯著性差異(P＞0.05)?？梢?Amplex Red熒光檢測法不僅實(shí)現(xiàn)了微量乳汁的XO和PAO 活性檢測,且能穩(wěn)定反應(yīng)不同物種乳汁的XO 和PAO 活性及其差異,可以采用此方法進(jìn)行大熊貓初乳中酶活性的測定。

2.2 冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO 活性

使用Amplex Red熒光法檢測5個不同濃度冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO 活性,結(jié)果如圖3所示。不同濃度冷凍大熊貓初乳中XO 活性為0.59～0.65 U/L,各組之間XO 活性無顯著差異(P＞0.05);不同濃度冷凍大熊貓初乳PAO 活性為0.023～0.029 U/L,各組之間也無顯著性差異(P＞0.05)。

圖3 冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO 活性Fig.3 XO activities and PAO activities in frozen giant panda colostrum

2.3 牛、羊乳與冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO活性比較

將冷凍大熊貓初乳與牛羊鮮乳、冷凍乳中的XO 活性對比,結(jié)果如表1 所示。0.05% 和0.10%濃度的冷凍牛乳中XO 活性是冷凍大熊貓初乳的1.3～1.4 倍,顯著高于冷凍大熊貓初乳(P＜0.05),而0.01%、0.025%和0.075%濃度的冷凍牛乳中該酶活性與冷凍大熊貓初乳相比均無顯著差異(P＞0.05),但其酶活性均比相應(yīng)濃度冷凍大熊貓初乳高5%～32%;不同濃度鮮牛乳中XO 活性為冷凍熊貓初乳的3.4～4.3 倍。不同濃度的冷凍大熊貓初乳中XO 活性均高于羊乳,為鮮羊乳的1.7～2.0倍、冷凍羊乳的4.6～5.5倍。3 種乳中XO 活性總體趨勢為牛乳＞大熊貓初乳＞羊乳。

表1 牛、羊乳與冷凍大熊貓初乳中XO 活性Table 1 Comparison of XO activities in cow milk,goat milk and frozen giant panda colostrum U/L

將冷凍大熊貓初乳與牛羊鮮乳、冷凍乳中的PAO 活性對比,結(jié)果如表2所示。不同濃度牛乳中PAO 活性均顯著高于冷凍大熊貓初乳(P＜0.05),鮮牛乳是冷凍大熊貓初乳的11.1～14.5倍,冷凍牛乳是冷凍大熊貓初乳的3.7～4.5倍。鮮羊乳中PAO 活性均顯著高于冷凍大熊貓初乳(P＜0.05),是冷凍大熊貓初乳的5.6～7.2倍;0.025%、0.05%、0.075%和0.10%濃度的冷凍羊乳中該酶活性顯著高于冷凍大熊貓初乳(P＜0.05),是冷凍大熊貓初乳的1.9～2.3 倍,其中0.01%濃度的冷凍羊乳雖與冷凍大熊貓初乳相比均無顯著差異(P＞0.05),但該濃度下該酶活性比相應(yīng)濃度冷凍大熊貓乳高92%。3 種乳中PAO 活性總體趨勢為牛乳＞羊乳＞大熊貓初乳。

表2 牛、羊乳與冷凍大熊貓初乳中PAO 活性Table 2 Comparison of PAO activities in cow milk,goat milk and frozen giant panda colostrum U/L

3 討論

XO 是乳汁中產(chǎn)生H2O2的主要酶類,PAO通過氧化精胺以補(bǔ)充乳汁中的H2O2含量[5,7]。Amplex Red熒光檢測法通常用于測量生物樣品中極低濃度的H2O2,具有穩(wěn)定性好、熒光強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)[19-20]。同時有研究證明XO 或PAO 氧化產(chǎn)生的H2O2與HRP催化的ADHP氧化結(jié)合后產(chǎn)生高熒光物質(zhì)間苯二酚,通過對其熒光強(qiáng)度檢測可實(shí)現(xiàn)4×105倍稀釋乳中XO 和PAO 活性的測量[17,21],因此Amplex Red熒光法為測定大熊貓乳中XO 和PAO 活性提供了可能。在此基礎(chǔ)上,本研究通過測定牛、羊乳中XO 和PAO 活性,進(jìn)一步證實(shí)Amplex Red熒光法在乳中適用性,并創(chuàng)新地應(yīng)用在冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO 活性的檢測。

此外,XO 和PAO 是乳汁中兩種重要活性成分,在有氧條件下參與黃嘌呤(次黃嘌呤)與精胺(亞精胺)的代謝,其代謝過程中產(chǎn)生的活性氧、氨基醛類以及H2O2具潛在的抗菌作用。研究發(fā)現(xiàn)XO 和PAO 產(chǎn)生的H2O2存在進(jìn)一步被乳中乳過氧化物酶(lactoperoxidase,LPO)系統(tǒng)催化的可能,可通過LPO-H2O2-SCN-體系生成具有抗菌活性的次硫氰酸鹽(OSCN-),反應(yīng)機(jī)制如圖4所示[6,17-18,22-23]。OSCN-對革蘭氏陽性和陰性菌有抑制作用,因此乳中XO 和PAO 可以通過該協(xié)同作用達(dá)到降低乳腺炎的發(fā)生,調(diào)節(jié)新生幼崽腸道環(huán)境的作用。

圖4 乳中XO、PAO 和LPO 系統(tǒng)的擬協(xié)同反應(yīng)機(jī)制Fig.4 Simulated synergistic reaction mechanism of XO,PAO and LPO system in milk

本研究測定的牛、羊乳中PAO 活性與Zou等[17]和Morgan等[24]的測定結(jié)果相似,但XO 活性與尿酸鹽吸光度法測定的酶活性相比較低,這可能歸因于哺乳期、飼料和季節(jié)變化等各種因素[9,25]。從總體趨勢來看,牛乳中XO 和PAO 活性均高于羊乳,這與Zou等[17]和Atmani等[26]的研究結(jié)果一致;且牛、羊乳中XO 和PAO 活性在不同稀釋倍數(shù)下,各組之間均無顯著性差異,說明Amplex Red熒光法效果良好,能準(zhǔn)確反映牛、羊乳中XO 和PAO 活性及其差異,進(jìn)一步證實(shí)該方法對微量乳中XO 和PAO 活性測定的適用性。

新生大熊貓幼崽免疫力極低,大熊貓初乳在幼崽免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[15]。因此,本研究應(yīng)用該方法對十分珍貴的大熊貓初乳進(jìn)行XO 和PAO 活性檢測,其XO 活性為0.59～0.65 U/L,PAO 活性為0.023～0.029 U/L,這為后續(xù)大熊貓初乳中XO 和PAO 活性的研究提供參考。此外,大熊貓初乳中XO 活性略低于牛乳,但高于羊乳;PAO 活性比牛、羊乳低;且大熊貓初乳中XO 活性高于PAO 活性,大熊貓乳汁中XO、PAO 和LPO 系統(tǒng)的協(xié)同抗菌機(jī)制可能以XO 為主。乳中較低的PAO 活性可能與大熊貓?zhí)厥獾倪M(jìn)食模式和消化系統(tǒng)有關(guān),牛、羊幼崽在出生3～4月時會發(fā)育出一個瘤胃,用于消化食物中的纖維物質(zhì),而大熊貓幼崽直至成年都不能發(fā)育出瘤胃[27-29]。大熊貓具有典型的肉食性動物的腸道結(jié)構(gòu),但成年大熊貓的飲食模式以竹子(＞90%)等高纖維食物為主,其必須依靠腸道微生物來消化纖維素,因此大熊貓幼崽腸道微生物的形成在其生長發(fā)育中十分重要[29]。大熊貓幼崽的斷奶時間通常在1歲以后,由此猜測,雖然大熊貓乳中PAO 活性較低,但大熊貓乳可通過XO、PAO 和LPO 系統(tǒng)長期的協(xié)同抗菌機(jī)制(LPO-H2O2-SCN--OSCN-)來實(shí)現(xiàn)對大熊貓幼崽腸道微生物的調(diào)節(jié),進(jìn)而促進(jìn)大熊貓幼崽先天免疫系統(tǒng)的形成。

4 結(jié)論

本研究采用高靈敏度的Amplex Red熒光法對冷凍大熊貓初乳中XO 和PAO 活性進(jìn)行檢測,并與牛羊鮮乳、冷凍乳進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)大熊貓初乳中XO 活性低于牛乳但高于羊乳,PAO 活性低于牛、羊乳。通過對乳中XO、PAO 和LPO 系統(tǒng)的協(xié)同抗菌機(jī)制分析,認(rèn)為大熊貓初乳在新生幼崽腸道微生物和先天免疫系統(tǒng)形成過程中發(fā)揮作用的以XO 為主。本文首次探究了大熊貓初乳中XO 和PAO 活性,并對其相關(guān)的抗菌協(xié)同作用進(jìn)行初步分析,為進(jìn)一步探究大熊貓乳與幼崽免疫形成的關(guān)系提供了理論參考。