高賢賢孔樂(lè)輝史青堯單衛(wèi)星強(qiáng)曉玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

細(xì)胞死亡是植物生命進(jìn)程中的重要生理活動(dòng),不僅參與植物正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,還在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[1]。為應(yīng)對(duì)病原菌侵染,植物進(jìn)化形成了PTI(PAMP-Triggered Immunity)和ETI(Effector Triggered Immunity)兩層先天免疫反應(yīng)系統(tǒng)[2]。病原菌侵染可引發(fā)植物PTI免疫反應(yīng),進(jìn)而產(chǎn)生活性氧迸發(fā)并誘發(fā)植物細(xì)胞死亡;而植物ETI免疫反應(yīng)通常會(huì)引發(fā)超敏反應(yīng)(Hypersensitive Reaction,HR),HR 相關(guān)的細(xì)胞死亡可有效阻止病原菌在植物體內(nèi)定殖和擴(kuò)展[3-4]。在哺乳動(dòng)物體系中,細(xì)胞凋亡由Bcl-2基因家族編碼的蛋白調(diào)控,當(dāng)細(xì)胞感知凋亡信號(hào)后,Bcl-2家族蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體中細(xì)胞色素C的釋放以促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡產(chǎn)生[5]。然而,植物中尚未鑒定到Bcl-2同源基因,但研究發(fā)現(xiàn)植物Bax inhibitor 1(BI-1)可抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BAX 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,進(jìn)一步揭示了動(dòng)植物之間可能存在保守的細(xì)胞死亡機(jī)制[6]。

BI-1最初在人類cDNA 文庫(kù)中篩選鑒定出來(lái),可抑制酵母中Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。BI-1編碼定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白,是高度保守的、廣泛存在于真核生物中的一類細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子[7-9]。動(dòng)物細(xì)胞中BI-1通常與多種疾病如癌癥、糖尿病等相關(guān),BI-1可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+含量以及活性氧的產(chǎn)生進(jìn)而調(diào)控免疫反應(yīng)中的細(xì)胞死亡[10]。在植物中,BI-1也被證實(shí)參與各類生物和非生物脅迫[11]:過(guò)氧化氫和水楊酸可誘導(dǎo)擬南芥AtBI-1上調(diào)表達(dá),并且過(guò)表達(dá)At BI-1可抑制Bax、過(guò)氧化氫和水楊酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[12];大麥中,過(guò)表達(dá)HvBI-1可抑制細(xì)胞死亡進(jìn)而顯著減少根部?jī)?nèi)生真菌印度梨形孢在植物根部的定殖[13];病毒侵染可誘導(dǎo)煙草中NbBI-1上調(diào)表達(dá),當(dāng)Nb-BI-1缺失后,植物體內(nèi)病原菌的累積量顯著增加[14];在擬南芥中過(guò)表達(dá)小麥TaBI-1可顯著增強(qiáng)植物對(duì)Pseudomonas syringaepv.Tomato(Pst)DC3000的抗病性;另外,TaBI-1可正向調(diào)控水楊酸相關(guān)基因的表達(dá)[15]。

卵菌,尤其是疫霉屬,是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類重要病原菌,而由致病疫霉菌引發(fā)的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中破壞性最大的一類病害,每年可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵制約因素之一[16]。并且隨著病原菌毒性變異加快,品種抗性喪失問(wèn)題尤為嚴(yán)重,因此亟需探索和挖掘新型抗病基因資源用于馬鈴薯抗病分子育種。盡管大量研究揭示了BI-1在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮作用,但是有關(guān)馬鈴薯StBI-1基因的鑒定分析及其影響植物抗疫霉菌的生物學(xué)功能尚不甚明了。本研究通過(guò)對(duì)擬南芥AtBI-1蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析,鑒定到與之相似度為77.22%、且具有Bax inhibitor 1-like結(jié)構(gòu)域的馬鈴薯BI-1 蛋白?；诖?本研究以馬鈴薯‘大西洋’品種cDNA 為模板,克隆獲得馬鈴薯StBI-1基因。通過(guò)分析馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉菌侵染時(shí)StBI-1基因的表達(dá)模式,揭示StBI-1受致病疫霉菌侵染而誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)體系初步揭示過(guò)表達(dá)StBI-1可顯著增強(qiáng)植物對(duì)疫霉菌的抗性,為挖掘馬鈴薯抗晚疫病新型基因資源及深入解析其抗病分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯‘大西洋’品種和‘隴薯12’品種,本氏煙草(Nicotiana benthamiana)為試驗(yàn)材料。生長(zhǎng)條件:溫度23℃,光照時(shí)間14 h 光照/10 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1StBI-1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 以At-BI-1蛋白序列為模板,首先利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)BLASTP功能在馬鈴薯蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定馬鈴薯中BI-1蛋白,并利用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用在線網(wǎng)站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.2.2StBI-1表達(dá)模式分析 根據(jù)馬鈴薯St-BI-1基因序列設(shè)計(jì)引物,F:5'-TCCTCACAACATTGGCTTGC-3'; R: 5'-AGGACCAATAGAAGCGCCTT-3'。以St EF1α作為內(nèi)參基因(F:5'-CAGAAGAAGGGAAAGTGAACAG-3';R:5'-CCGCCTATCAAGTACCCAGT-3')。馬鈴薯葉片接種致病疫霉菌游動(dòng)孢子,并分別于3 hpi、6 hpi、12 hpi、24 hpi、36 hpi、48 hpi和72 hpi收取葉片樣品,參照TRIZOL(Invitrogen)試劑說(shuō)明書,提取馬鈴薯葉片RNA,按照Ta KaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime ScriptTMRT regent kit)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到馬鈴薯cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)基因表達(dá)模式,實(shí)時(shí)定量PCR 程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸45 s,40個(gè)循環(huán),基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-△△Ct法。

1.2.3StBI-1基因克隆和載體構(gòu)建 利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)分別帶有XholⅠ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)的特異性引物F:5'-GGAGAGGACACGCTCGAGATGGAAGGTTTCACATCGT TCTT-3';R:5'-TAATTAACCCCATAAGCTTCTAGTTTCTCCTCTTCTTCTTCT-3'。以馬鈴薯品種‘大西洋’cDNA 為模板擴(kuò)增St BI-1基因,將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到植物表達(dá)載體p Kannibal上并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序正確的質(zhì)粒為p Kannibal-StBI-1。將p Kannibal-StBI-1與雙元載體p ART27分別用NotⅠ單酶切后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化,測(cè)序成功后即得到植物過(guò)表達(dá)載體p ART27::StBI-1。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá) 將p ART27::StBI-1 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中,28℃、200 r/min 培養(yǎng);待菌液培養(yǎng)至橙黃色后,室溫稍靜置離心收集菌體,用含有乙酰丁香酮(終濃度為200μmol/L)的MES 重懸液重懸菌體;紫外分光光度計(jì)測(cè)量菌液OD600值,將菌液濃度調(diào)至0.3～0.5;重懸液在室溫條件下孵育1 h后用1 m L 注射器注射煙草并作好標(biāo)記;煙草葉片噴水保濕過(guò)夜,黑暗培養(yǎng)1 d,次日恢復(fù)正常條件,2～3 d后進(jìn)行接菌試驗(yàn)。

1.2.5 病原菌的培養(yǎng)與接種 穩(wěn)定表達(dá)GFP的寄生疫霉菌轉(zhuǎn)化子1121以及致病疫霉菌88069用于侵染本氏煙草葉片。培養(yǎng)方式及離體葉片接種方式分別參考已報(bào)道的方法[17-18]。

1.2.6 Western Blot 收取注射區(qū)煙草葉片,用Hepes 緩沖液(250 mmol/L 蔗糖,50 mmol/L HEPES-KOH,5% 甘油,1 mmol/L Na2MoO4·2H2O,25 mmol/L NaF,10 mmol/L EDTA)提取蛋白樣品。參考已報(bào)道的方法進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)StBI-1蛋白表達(dá)情況[19]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、顯著性分析以及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 StBI-1 基因的鑒定與分析

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https://www.arabidopsis.org)網(wǎng)站中下載擬南芥AtBI-1(AT5G47120)編碼的蛋白序列,在馬鈴薯蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 檢索,檢索得到數(shù)條蛋白序列,將這些同源性較高的蛋白與AtBI-1進(jìn)行蛋白多序列對(duì)比,并利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1-a)。其中馬鈴薯中與At BI-1親緣關(guān)系最為接近的是NP_001305552.1(圖1-a),兩者相似度為77.22%。將編碼這個(gè)蛋白的基因命名為St-BI-1,該基因全長(zhǎng)747 bp,編碼248個(gè)氨基酸。同時(shí)在SMART 網(wǎng)站對(duì)St BI-1基因所編碼的蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與其AtBI-1蛋白相似,包含7個(gè)跨膜域,并且包含Bax inhibitor-1-like結(jié)構(gòu)域(圖1-b)。

圖1 StBI-1系統(tǒng)進(jìn)化樹及蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Functional domain analysis and phylogenetic analysis of StBI-1

2.2 StBI-1 基因響應(yīng)致病疫霉菌侵染的表達(dá)模式分析

為了揭示StBI-1響應(yīng)致病疫霉菌侵染的表達(dá)模式,首先對(duì)煉苗后轉(zhuǎn)移至土壤基質(zhì)生長(zhǎng)3周的馬鈴薯品種‘大西洋’和‘隴薯12’葉片分別進(jìn)行致病疫霉菌游動(dòng)孢子接種處理,并分別于3 hpi、6 hpi、12 hpi、24 hpi、36 hpi、48 hpi和72 hpi收取葉片樣品,提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄合成c DNA。進(jìn)一步,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)StBI-1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果表明,2個(gè)馬鈴薯品種中StBI-1響應(yīng)致病疫霉菌侵染的表達(dá)模式相似(圖2),在接菌24 hpi內(nèi),St BI-1基因的表達(dá)水平略有上調(diào);而從36 hpi至72 hpi,StBI-1基因受致病疫霉菌侵染而顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。同時(shí)通過(guò)比較分析發(fā)現(xiàn),在響應(yīng)致病疫霉菌侵染時(shí),馬鈴薯抗病品種‘隴薯12’中St BI-1基因表達(dá)量始終高于馬鈴薯‘大西洋’品種,并呈現(xiàn)顯著性差異(圖2)。該結(jié)果揭示了StBI-1在馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉菌侵染時(shí)處于表達(dá)活躍狀態(tài),可能在馬鈴薯與致病疫霉菌的互作過(guò)程中具有重要功能。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)致病疫霉菌侵染階段‘大西洋’和‘隴薯12’中StBI-1 表達(dá)模式Fig.2 Quantitative reverse transcription PCR analysis for the expression of StBI-1 in‘Atlantic’and‘Longshu 12’leaves at different time points after P.infestans inoculation

2.3 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)體系分析StBI-1 抗疫霉菌的免疫功能

為了進(jìn)一步探究StBI-1影響植物抗疫霉菌的潛在生物學(xué)功能,構(gòu)建p35S::St BI-1-4myc植物表達(dá)載體用于功能驗(yàn)證(圖3-a)。借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)體系,在煙草葉片上瞬時(shí)表達(dá)p35S::StBI-1-4myc和p35S::empty vector,并于表達(dá)2 d后,收取注射區(qū)葉片,Western Blot檢測(cè)StBI-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示,表達(dá)St-BI-1-4myc的葉片中檢測(cè)到StBI-1蛋白,且條帶大小與預(yù)測(cè)大小一致(圖3-b)。之后,對(duì)葉片進(jìn)行寄生疫霉菌游動(dòng)孢子接種處理,并于接菌36 h 后,統(tǒng)計(jì)病斑大小。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)StBI-1葉片病斑面積顯著小于對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩者病斑直徑存在顯著性差異(圖4)。以上結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)StBI-1可增強(qiáng)植物對(duì)寄生疫霉菌的抗病性。

圖3 StBI-1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和驗(yàn)證Fig.3 Construction and verification of StBI-1 overexpression vector

圖4 過(guò)表達(dá)StBI-1 增強(qiáng)植物對(duì)寄生疫霉菌的抗性Fig.4 Overexpression of StBI-1 enhanced plant resistance to P.parasitica

此外,進(jìn)一步分析了StBI-1影響植物抗致病疫霉菌的免疫功能。借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)體系,在煙草葉片上瞬時(shí)表達(dá)p35S::StBI-1-4myc和p35S::empty vector,并于2 d后,對(duì)葉片進(jìn)行致病疫霉菌游動(dòng)孢子接種處理,接菌6 d后,統(tǒng)計(jì)病斑大小。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)StBI-1葉片病斑面積顯著小于對(duì)照組,并且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩者病斑直徑存在顯著性差異(圖5)。該結(jié)果揭示了過(guò)表達(dá)StBI-1也可增強(qiáng)植物對(duì)致病疫霉菌的抗病性。

圖5 過(guò)表達(dá)StBI-1 增強(qiáng)植物對(duì)致病疫霉菌的抗性Fig.5 Overexpression of StBI-1 enhanced plant resistance to P.infestans

3 討論

由疫霉屬卵菌引發(fā)的植物病害嚴(yán)重威脅著馬鈴薯生產(chǎn)及可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展,并且疫霉菌毒性變化較快,導(dǎo)致品種抗性喪失問(wèn)題極為突出。因此亟需挖掘新型抗病基因資源,并深入解析其免疫作用機(jī)制,以有效推進(jìn)馬鈴薯抗病分子育種。本研究鑒定并克隆馬鈴薯StBI-1基因,并初步探究其響應(yīng)致病疫霉菌侵染的表達(dá)模式及抗疫霉菌的免疫功能,研究結(jié)果揭示St BI-1在植物與疫霉菌的互作過(guò)程可能發(fā)揮重要作用。

前人報(bào)道表明病原菌入侵以及非生物脅迫均可誘導(dǎo)植物BI-1表達(dá)上調(diào)[20]。例如,植物損傷或病原菌入侵均可誘導(dǎo)擬南芥AtBI-1上調(diào)表達(dá);小麥條銹菌侵染或高溫條件下,小麥TaBI-1轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)上調(diào);鹽脅迫可誘導(dǎo)棉花Gh BI-1表達(dá)水平上升[15,21-22]。本研究發(fā)現(xiàn),St BI-1可響應(yīng)致病疫霉菌侵染而誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),尤其在接菌后36～72 h上調(diào)表達(dá)水平更為顯著(圖2),并且在馬鈴薯抗病品種‘隴薯12’中StBI-1基因的表達(dá)量更高(圖2)。致病疫霉菌作為兼性營(yíng)養(yǎng)型病原菌,其在入侵植物后期則轉(zhuǎn)入死體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段[16],推測(cè)在植物與致病疫霉菌互作后期,StBI-1可能通過(guò)抑制植物細(xì)胞死亡而阻止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。

為有效應(yīng)對(duì)病原菌入侵,植物進(jìn)化形成了PTI和ETI兩層免疫系統(tǒng)[2]。而植物的免疫反應(yīng)通常會(huì)伴隨細(xì)胞死亡事件的發(fā)生[4],作為植物免疫應(yīng)答的關(guān)鍵機(jī)制,細(xì)胞死亡在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫中扮演著重要角色。植物與病原菌互作過(guò)程中,植物免疫系統(tǒng)引發(fā)超敏性細(xì)胞死亡通常被認(rèn)為是阻止活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌和兼性營(yíng)養(yǎng)型病原菌定殖和擴(kuò)展的有效策略[3]。作為一個(gè)保守的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子,BI-1被證實(shí)參與調(diào)節(jié)植物與病原菌互作中的細(xì)胞死亡事件,并且BI-1與不同蛋白相互作用來(lái)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+含量以及活性氧的累積進(jìn)而調(diào)控植物細(xì)胞死亡[23-24]。此外,BI-1也被證實(shí)參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡,而前期研究揭示了寄生疫霉菌可引發(fā)擬南芥植株產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路UPR(unfolded protein response)[25-26]。由此推測(cè),StBI-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡而影響植物對(duì)疫霉菌的抗性。本研究中初步證實(shí)StBI-1參與植物對(duì)疫霉菌的響應(yīng),過(guò)表達(dá)StBI-1可顯著抑制疫霉菌在植物中擴(kuò)展。然而StBI-1是否調(diào)控致病疫霉菌侵染引發(fā)的植物細(xì)胞死亡尚不清楚,后續(xù)我們將借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)制備過(guò)表達(dá)StBI-1和RNAi沉默St BI-1的馬鈴薯穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株,在明確St-BI-1影響馬鈴薯抗晚疫病的免疫功能基礎(chǔ)上,通過(guò)分析病菌侵染的寄主細(xì)胞內(nèi)活性氧累積水平、鈣離子流的變化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等,以期深入解析馬鈴薯響應(yīng)致病疫霉菌侵染時(shí)產(chǎn)生的植物細(xì)胞死亡作用機(jī)制,進(jìn)而揭示StBI-1參與調(diào)控馬鈴薯抗晚疫病的作用機(jī)制,為馬鈴薯新型抗病基因資源挖掘和抗病分子育種提供理論基礎(chǔ)。