段鴻斌，楊立軍，羅 偉，崔晨旭，高 涵，陳 重

(信陽農(nóng)林學院 制藥工程學院， 河南 信陽 464000)

0 引言

鐵線蕨(Adiantumcapillus-venerisL.)是鐵線蕨科鐵線蕨屬草本植物，又名豬毛七、巖棕、鐵線草等，其分布廣泛，具有較高的藥用和食用價值[1-2]，眾多研究表明,鐵線蕨具有抑菌[3]、抗氧化[4]、降血糖[5]等多種藥理作用。此外，鐵線蕨中還含有豐富的黃酮類[6]、酚類[7]、三萜類[8]等生物活性成分，這些物質(zhì)在食品工業(yè)[9]、醫(yī)藥等行業(yè)[10]中具有重要的應(yīng)用潛力。

植物內(nèi)生菌(Endophytes)是寄生于活體植物各組織和器官內(nèi)的，且不會引起明顯的宿主植物外在感染癥狀的微生物。從藥用植物中分離得到的內(nèi)生菌的次級代謝物含有許多與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)；它們還具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[11]，對藥用植物內(nèi)生菌的研究有著重大的科學意義和現(xiàn)實的實用意義[12]。然而,目前對于鐵線蕨化學成分與藥理作用等的研究均停留在植株本身[1]，蕨類植物中內(nèi)生菌資源豐富[13]，但對鐵線蕨內(nèi)生菌及其次級代謝產(chǎn)物活性的研究卻未見相關(guān)報道。

本研究從鐵線蕨根部分離出一株內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學和分子生物學手段對其進行鑒定，并對其抑菌與抗氧化能力進行了初步研究，為進一步研究和開發(fā)其活性產(chǎn)物作為天然抑菌劑、抗氧化劑奠定基礎(chǔ)，為擴展優(yōu)質(zhì)、高效食品防腐劑的品種來源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵線蕨于2021年4月采集于河南省信陽市大別山地區(qū)，經(jīng)信陽農(nóng)林學院陳瓊教授鑒定為鐵線蕨(Adiantumcapillus-venerisL.)。將新鮮、健康的鐵線蕨清洗干凈，外覆保鮮膜，4 ℃保存于信陽農(nóng)林學院微生物實驗室。

1.2 材料與儀器

Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒D2300，廣州索萊寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(DPPH)，合肥千盛生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)標準品，得研實驗生物耗材有限公司；過硫酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司；大腸埃希菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，信陽農(nóng)林學院微生物實驗室；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-2000A型，鄭州貝楷儀器設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，BS-1E(A)型，上海精密儀器儀表有限公司；落地式潔凈工作臺，SW-CJ-2F型，上海力辰邦西儀器科技有限公司；酶標儀，DNM-9602型，北京普朗新技術(shù)有限公司；電熱式壓力蒸汽滅菌鍋，XFH-75CA型，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司。

1.3 內(nèi)生真菌的分離

根據(jù)文獻[14]分離鐵線蕨內(nèi)生真菌。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株的分子鑒定

根據(jù)文獻[15]修改如下：采用Solarbio真菌基因組DNA提取試劑盒D2300(廣州索萊寶生物科技有限公司)提取真菌DNA，提取合格的DNA進行rDNA-ITS的PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCTTATTGATATGC-3’)各1 μL，2×Taq Master Mix混合物(包括藍色染料)10 μL，基因組DNA 1 μL和ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：在98 ℃預(yù)變性30 s，在98 ℃下變性10 s，在55 ℃退火30 s，在72 ℃下延伸1 min，30個循環(huán)，最終在72 ℃下延伸5 min，在4 ℃下儲存。經(jīng)過1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產(chǎn)品被送往檢測公司進行測序，獲取基因序列。將獲取的ITS序列提交至NCBI網(wǎng)站，使用BLAST程序進行比較，然后在MEGA程序中使用鄰接連接，參考FELSENSTEIN等[16]的最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.2 菌株的形態(tài)學鑒定

挑取純化后的內(nèi)生真菌菌絲，接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d，觀察記錄菌落形狀、顏色、生長速度以及菌落的質(zhì)地。挑取菌絲，結(jié)晶紫染色，然后在顯微鏡下觀察菌絲和孢子的特征，并根據(jù)《真菌鑒定手冊》[17]進行初步鑒定。

1.5 次級代謝產(chǎn)物的提取

無菌條件下，將生長在PDA固體培養(yǎng)基中的活化菌株接種到PDB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 d作為種子液備用。將種子液按4%的接種量接種于PDB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)4～6 d得到發(fā)酵液。取發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，八層紗布過濾，除去菌絲體，合并濾液，用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，將萃取液減壓蒸干濃縮得到粗浸膏，用甲醇配制成50 g/L的樣液。

1.6 抑菌活性研究

1.6.1 供試菌液的制備

在無菌環(huán)境下，取出保存的供試病原細菌，用平板劃線法接種在滅菌后的NA培養(yǎng)基上，37 ℃活化培養(yǎng)18～24 h后，挑取部分菌落接種在滅菌后的NB培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩器中37 ℃，200 r/min培養(yǎng)18～24 h。無菌操作條件下，采用麥氏比濁法，用無菌水將細菌原液稀釋成波長600 nm下OD值為0.2(約1×108CFU/mL)的供試菌液。

1.6.2 含菌平板的制備

無菌環(huán)境下，取200 μL的供試菌液，用涂布棒將菌液均勻涂布于NA培養(yǎng)基平板，倒置備用。

1.6.3 抑菌試驗

用打孔器將無菌濾紙制成直徑為6 mm的圓紙片，取20 μL的樣液滴加到濾紙片上，吹干，然后將紙片貼在含大腸埃希菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)平板上。革蘭氏細菌平板的陽性與陰性對照分別為含500 mg/L的青霉素溶液、鏈霉素溶液的濾紙片；滴加甲醇溶液的濾紙片為空白對照置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值。

1.6.4 MIC 和 MBC 值的測定

根據(jù)文獻[18]與[19]修改如下：以僅含LB的液體培養(yǎng)基為陰性對照(NC)，在培養(yǎng)箱中37 ℃保溫24 h。通過觀察孔內(nèi)溶液的清晰度來判斷抑制效果，將處于清晰與渾濁之間的濃度定為最低抑菌濃度(MIC)；從澄清孔中分別吸取50 μL溶液涂布在LB平板上，并在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，沒有細菌生長的最小稀釋濃度即為最低殺菌濃度(MBC)。

1.7 抗氧化活性研究

1.7.1 供試樣品的制備

取50 g/L的樣液，用甲醇將其分別配制成濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g/L的溶液，4 ℃避光保存。同理，取適量抗壞血酸(Vc)，依次配置成上述濃度的溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存。

1.7.2 清除DPPH自由基能力測定

根據(jù)文獻[20]測定清除DPPH自由基能力。

1.7.3 清除ABTS自由基能力測定

根據(jù)文獻[21]的方法修改如下：分別吸取50 μL不同濃度的樣品溶液，加入200 μL ABTS自由基工作液，搖勻，于酶標儀37 ℃孵育10 min，在734 nm處測定吸光度A1。按照相同方法，吸取50 μL樣品溶液和200 μL蒸餾水(代替ABTS自由基工作液)，測定吸光度A2；吸取50 μL蒸餾水(代替樣品溶液)和200 μL ABTS自由基工作液，測定吸光度A0。以同等濃度梯度的Vc溶液作為陽性對照，以甲醇作為陰性對照。按照公式(1)計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率=

(1)

1.7.4 清除羥基自由基能力測定

根據(jù)文獻[22]測定清除羥基自由基能力。

1.8 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復(fù)3次，使用Excel 2010、SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 tg-1形態(tài)學鑒定結(jié)果

tg-1菌株的形態(tài)特征如圖1(A)和圖1(B)所示，tg-1菌株在PDA培養(yǎng)基上生長2～3 d后可看到新生菌絲，菌絲從中心向外依次由致密至疏松生長，菌落呈規(guī)則圓形。隨菌齡的增加，菌落中心菌絲退化，逐漸出現(xiàn)深棕色孢子團，向外形成兩個菌絲呈白色及深黃色的同心圓。取菌落中心孢子團，在光學顯微鏡下進行觀察，如圖1(C)所示，菌絲有隔膜，孢子形態(tài)呈橢球形。根據(jù)文獻[17]，初步鑒定其為曲霉屬(Aspergillussp.)。

圖1 內(nèi)生真菌tg-1的單菌落(A)、平板劃線形態(tài)(B)、孢子形態(tài)(C)Fig. 1 Single colony(A)、plate streak(B) and spore morphology(C) of endophytic fungus tg-1

2.1.2 tg-1分子生物學鑒定結(jié)果

應(yīng)用PCR擴增，獲得tg-1內(nèi)生菌的ITS序列，然后通過測序和基于BLAST的方法進行擴增。獲得的序列顯示對具有高身份(99%～100%)和高序列覆蓋率(97%～100%)的數(shù)據(jù)庫的命中率。選擇最佳命中率以構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育和BLAST分析，NCBI數(shù)據(jù)庫中最接近的可用菌株屬于曲霉屬，最相似的菌株是Aspergillusterreus(99%序列同一性)。

2.2 抑菌試驗結(jié)果

內(nèi)生真菌tg-1次級代謝產(chǎn)物在含有大腸埃希菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等4種供試菌的平板上均出現(xiàn)了抑菌圈，表明其對供試菌具有不同程度的抑制作用(見表1)。對大腸埃希菌和沙門氏菌的抑制作用最強，這兩種供試菌的抑菌圈直徑分別為1.34±0.42、1.52±0.28 mm，接近陽性對照的一半。采用二倍稀釋法分別測定內(nèi)生菌對4種供試菌的MIC與MBC的數(shù)據(jù)如表1所示。

圖2 基于ITS序列鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 內(nèi)生真菌tg-1抑菌試驗的結(jié)果

表1中MBC代表能夠殺滅99.9%供試微生物時次級代謝產(chǎn)物的最低質(zhì)量濃度，MIC是指能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)約80%供試微生物時次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度，理論上MBC數(shù)值應(yīng)偏大于MIC。表1中大腸埃希菌的MIC與MBC分別為0.781 5、3.125 0 g/L，二者相差較大，符合正確的試驗結(jié)果。KHAN等[3]的研究發(fā)現(xiàn)鐵線蕨屬植物的提取液對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌病原體等其他革蘭陰性菌有明顯的抑菌作用，與本試驗結(jié)果一致。

2.3 抗氧化試驗結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

由圖3可知，Vc對DPPH的清除能力很好，在0.02～0.12 g/L范圍內(nèi)Vc對DPPH自由基的清除率保持在97%以上，且受濃度的影響不大。在試驗濃度范圍0.02～0.12 g/L內(nèi)，隨著內(nèi)生真菌tg-1次級代謝產(chǎn)物濃度的升高，其對DPPH自由基的清除率呈依賴性增長，當次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度達到0.12 g/L 時，其對DPPH的清除率高達88.46%，接近同等質(zhì)量濃度下Vc對DPPH的清除率，相比于0.02 g/L質(zhì)量濃度下僅為32.54%的清除率有了大幅度增長，這表明內(nèi)生真菌tg-1次級代謝產(chǎn)物對DPPH有著極佳的清除能力。根據(jù)次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度與對DPPH清除率的曲線的趨勢進行預(yù)測，當次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度達到0.16 g/L時，它對DPPH的清除能力就將無限接近同等質(zhì)量濃度下Vc的清除能力。根據(jù)回歸方程，其IC50為0.038 g/L。

圖3 內(nèi)生真菌tg-1及Vc清除DPPH自由基的能力

2.3.2 ABTS自由基清除能力

由圖4可知，在0.02～0.12 g/L范圍內(nèi)，tg-1次級代謝產(chǎn)物對ABTS自由基的清除能力隨其質(zhì)量濃度的增加而增大。當次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度小于0.08 g/L時，次級代謝產(chǎn)物對ABTS自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加明顯增大，當質(zhì)量濃度超過0.08 g/L時，次級代謝產(chǎn)物對ABTS自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增加的增幅減慢。當次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為0.02 g/L時，其ABTS自由基的清除率為49.29%，當質(zhì)量濃度增加到0.12 g/L時，其對ABTS自由基的清除率高達98.05%，基本與同等質(zhì)量濃度Vc的清除率相同。根據(jù)回歸方程，其IC50為0.026 g/L。

圖4 內(nèi)生真菌tg-1及Vc清除ABTS自由基的能力

2.3.3 羥基自由基清除能力

由圖5可知，在0.02～0.12 g/L范圍內(nèi)，Vc對羥基自由基的清除作用很好，受質(zhì)量濃度的影響比較小，tg-1次級代謝產(chǎn)物對羥基自由基的清除作用呈一定的量效關(guān)系。

圖5 內(nèi)生真菌tg-1及Vc清除羥基自由基的能力

當次級代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度小于0.06 g/L時，次級代謝產(chǎn)物對羥基自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而明顯增大；當質(zhì)量濃度超過0.06 g/L時，次級代謝產(chǎn)物對羥基自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增加的增幅減小。質(zhì)量濃度從0.02 g/L增加到0.12 g/L時，tg-1次級代謝產(chǎn)物對羥基自由基的清除率從20.32%增加到84.15%，均明顯低于同等質(zhì)量濃度下Vc的清除能力。由此可見，相對于tg-1次級代謝產(chǎn)物對DPPH與ABTS自由基的清除能力，其對羥基自由基的清除能力較弱，這與田曉艷等[10]的研究結(jié)果相一致。根據(jù)回歸方程，其IC50為0.063 g/L。

3 結(jié)論

鐵線蕨內(nèi)生真菌菌株tg-1屬于Aspergillussp.，此類菌是常見的植物內(nèi)生真菌，該菌株雖表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性，但是MIC和MBC值不夠理想，可能是由于代謝產(chǎn)物中多個物質(zhì)之間相互作用對結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾。此外，該菌株清除DPPH、ABTS、羥基自由基的IC50分別為0.038、0.026、0.063 g/L，在一定范圍內(nèi)有較好的抗氧化活性，與Vc相比，抗氧化效果相對較弱，可能是菌株發(fā)酵液中的某種物質(zhì)對DPPH等自由基的清除效果造成了影響，或者是由于未進行菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，無法達到菌株的最適生長條件，使得發(fā)酵液中的抗氧化物質(zhì)濃度不高。為進一步追蹤高活性物質(zhì)來源，下一步應(yīng)將tg-1作為目標菌株，對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，通過批量發(fā)酵，利用化學手段進行結(jié)構(gòu)鑒定，測定評價單體物質(zhì)的抑菌和抗氧化活性，以篩選獲得具有顯著活性的單一化合物，為抑菌和抗氧化藥物先導(dǎo)分子的挖掘提供備選藥源。