程 琳，郝艷林，周夢(mèng)鑫，李夢(mèng)鴿，韓群威，李鳳英

(1. 信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 河南 信陽 464000; 2. 信陽市林業(yè)科學(xué)研究所， 河南 信陽 464000)

0 引言

被子植物又稱為開花植物，有超過30萬種組成，占整個(gè)植物界的一半，為人類提供食物、氧氣、能源、醫(yī)藥等資源[1-2]。所有的被子植物都發(fā)生過全基因組重復(fù)(whole genome duplication, WGD)事件[3-4]。在進(jìn)化過程中，基因重復(fù)為物種進(jìn)化提供充足的遺傳物質(zhì)，也是新基因產(chǎn)生的主要方式[5-6]?；蛑貜?fù)有多種類型，如串聯(lián)重復(fù)、片段重復(fù)、全基因組重復(fù)(WGD)等[7]。其中WGD能夠使基因組中所有基因增加一個(gè)拷貝，推動(dòng)物種在生化和分子層面的根本性變革，導(dǎo)致物種的快速分化，影響最為深遠(yuǎn)[8-9]。在目前種質(zhì)資源最豐富也是擴(kuò)張最為成功的被子植物中，WGD事件更是普遍，為植物適應(yīng)環(huán)境和物種分化提供了非常豐富的資源[10-12]。因而，對(duì)近期重復(fù)產(chǎn)生的基因拷貝丟失或保留的規(guī)律以及保留下來的旁系同源基因之間功能分化進(jìn)行研究具有重要的意義。

植物體內(nèi)的氨基酸在維持植物正常生長發(fā)育、代謝及抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(amino acid transporter, AAT)是一種膜整合蛋白，成員眾多，在不同植物中其表達(dá)模式和功能表現(xiàn)出強(qiáng)烈的多樣化[13]。近期氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工作證實(shí)其在細(xì)胞之間物質(zhì)運(yùn)輸方面具有重要功能，如調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡和防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)[14],負(fù)責(zé)氨基酸的輸入、輸出以及在韌皮部中的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)等，對(duì)植物的生長發(fā)育及種子和果實(shí)中蛋白質(zhì)含量起重要調(diào)控作用[15-17]。類似賴氨酸/組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(lysine-histidine-like transporters，LHTs)基因家族屬于氨基酸/生長素透性酶(amino acid/auxin permease，AAAP)超家族的一個(gè)分支，在擬南芥中AtLHT1參與根對(duì)土壤中氨基酸的吸收以及向庫器官的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[18]。AtLHT2具有對(duì)天冬氨酸和脯氨酸的高親和力，參與氨基酸向孢子細(xì)胞的運(yùn)輸過程[19]。

在全球范圍內(nèi)，根瘤菌每年為農(nóng)業(yè)提供4 000萬噸的氮源[20-21]。然而，共生固氮具有嚴(yán)格的宿主專一性，僅限于豆科植物和少數(shù)非豆科植物。目前尚無法通過基因工程的方法實(shí)現(xiàn)重要禾谷類作物的共生固氮[22]，因而進(jìn)一步揭示共生固氮的分子機(jī)理,并最終通過遺傳改良提高豆科植物與根瘤菌的結(jié)瘤固氮效率，對(duì)于實(shí)施農(nóng)業(yè)資源的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

大豆起源于中國，也是中國主要農(nóng)作物之一，目前尚無大豆LHT同源基因及其編碼蛋白家族其他成員的報(bào)道。自2010年大豆基因組公布至今[23]，大豆基因組數(shù)據(jù)庫不斷完善。本文利用Phytozome數(shù)據(jù)庫和相關(guān)生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)被子植物L(fēng)HT基因家族的進(jìn)化歷史進(jìn)行了分析，并對(duì)大豆中LHT同源基因的表達(dá)進(jìn)行了探索，以期為進(jìn)一步揭示和利用大豆LHT基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆根瘤菌USDA110由復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王應(yīng)祥教授惠贈(zèng)；栽培大豆Willimas82由中科院東北地理所孔凡江研究員惠贈(zèng)；百脈根種子(MG-20)、大腸桿菌菌株DH5α、發(fā)根農(nóng)桿菌LBA1334、根瘤菌M.lotiMAFF303099和植物超表達(dá)載體p1301U均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物固氮分子研究室惠贈(zèng)；其余克隆載體、限制性內(nèi)切酶、PCR所用試劑等購自Promega、TaKaRa等公司。

1.2 LHT蛋白氨基酸成員鑒定

從Phytozome v12.0(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下載目前已經(jīng)完成基因組測(cè)序的被子植物代表物種，為了獲得LHT基因家族全部的成員數(shù)目，采用BLASTP和HMMsearch相結(jié)合的方法在本地?cái)?shù)據(jù)庫中檢索LHT基因家族成員。首先，利用已報(bào)道的擬南芥LHT家族成員蛋白序列[22]作為誘餌序列，本地BLASTP搜索數(shù)據(jù)庫。其次，從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)下載LHT蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的種子文件(PF00324和PF01490),使用HMMER(HMMER 3.1b1)的Hmmsearch程序，采用默認(rèn)參數(shù)，搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。綜合這兩種方法獲得LHT基因家族候選蛋白序列，通過Pfam和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)[24]在線分析手動(dòng)驗(yàn)證，最終確定該家族成員的數(shù)目。

1.3 序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)生分析

采用mafft v7.215 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)對(duì)獲取的LHT蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，用RaxML v8.2.8 構(gòu)建最終的最大似然法(maximum likehood,ML)樹，參數(shù)設(shè)置為：JTT(jones, taylor and thorton)氨基酸替換模型，gamma分布以及進(jìn)行100次bootstrap replicates。

1.4 大豆LHT同源基因及編碼的蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)分析軟件GSDS和TMHMM(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/；http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對(duì)LHT基因內(nèi)含子與外顯子結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)進(jìn)行分析。利用MEME(http://meme-suite.org/index.html)在線平臺(tái)對(duì)LHT蛋白序列進(jìn)行保守基序(motif)分析，最大基序檢索數(shù)值設(shè)為20，最適基序長度在6～50個(gè)氨基酸殘基之間。

1.5 大豆LHT同源基因表達(dá)分析

對(duì)大豆不同發(fā)育時(shí)期和組織的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，包括根、莖、幼苗、葉、花發(fā)育的4期、種子等[24]。利用R語言繪制基因的表達(dá)熱圖。

1.6 大豆幼苗培養(yǎng)和熒光定量PCR分析

用Trizol Reagent(Invitrogen)提取不同時(shí)期大豆材料不同組織材料的總RNA。使用NANODROP ONE(Thermo)檢測(cè)RNA樣品濃度和純度，樣品置于-80 ℃保存。使用TIANGEN公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第1鏈，隨后以其為模板按照BIOTAKE公司Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture操作說明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(LightCycler 96, Roche)。內(nèi)參為大豆β-actin基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL Power 2×SYBR Premixture，0.4 μL Forward Primer(10 μm)，0.4 μL Reverse Primer(10 μm)，1 μL cDNA，0.4 μL ROX，7.8 μL超純水至20 μL反應(yīng)體系。采用三步法反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s；45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，根據(jù)CT值進(jìn)行目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCT進(jìn)行目標(biāo)的計(jì)算[25]。

1.7 大豆GmaLHT17基因的克隆及植物超表達(dá)載體的構(gòu)建

參照MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)說明書的操作流程，提取大豆總RNA。取500 ng總RNA，使用FastQuant RT Kit (TIANGEN)合成cDNA第一條鏈。根據(jù)大豆基因組注釋信息(Phytozome)獲得大豆LHT17基因的序列，利用Primer Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增獲得的目的片段連接到T載體上測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確的GmaLHT17基因插入到植物表達(dá)載體p1301U中，酶切位點(diǎn)為KpnI和BamHI。構(gòu)建完成的p1301U-GmaLHT17超表達(dá)載體經(jīng)過酶切鑒定和測(cè)序后，將重組質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA1334中，用于百脈根的發(fā)根轉(zhuǎn)化。

1.8 百脈根毛根轉(zhuǎn)化及“復(fù)合體”植株的獲得

百脈根種子用次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，無菌水沖洗5次后，22 ℃暗培養(yǎng)2～3 d，待種子萌發(fā)后移入MS培養(yǎng)基。待幼苗胚根長約1 cm時(shí)將其剪掉，收集子葉作為待侵染外植體。將剪掉胚根的子葉在發(fā)根農(nóng)桿菌菌懸液(OD6000.6)中侵染15～20 min，將外植體移入MS培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3～5 d，然后將其轉(zhuǎn)移至含有300 mg/L 羧芐的MS篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周。然后進(jìn)行GUS染色鑒定，將不顯藍(lán)色的陰性毛根切除，此時(shí)獲得的植株即為百脈根“復(fù)合體”植株。

1.9 百脈根“復(fù)合體”植株的結(jié)瘤處理

在YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)百脈根中生根瘤菌M.lotiMAFF303099至OD600大于1.0, 4 000 r/min離心10 min，用YMA液體培養(yǎng)基將菌體重懸，然后接種至1.8節(jié)中獲得的百脈根“復(fù)合體”植株中。接種28 d后，將沙盆中的百脈根植株用流動(dòng)水沖洗干凈，置于平皿中統(tǒng)計(jì)結(jié)瘤數(shù)目，進(jìn)行顯著性差異分析。然后提取根瘤RNA，方法同1.7節(jié)中所描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 被子植物代表物種中LHT基因家族成員的數(shù)量與全基因組重復(fù)有關(guān)

目前已有的基因家族研究主要是基于某單個(gè)物種，如大豆、水稻、擬南芥、馬鈴薯等。但是單個(gè)物種中LHT基因并不足以建立起整個(gè)被子植物的LHT基因分子進(jìn)化關(guān)系。為了重建被子植物中該基因家族的分子進(jìn)化結(jié)構(gòu)，利用隱馬爾可夫模型(HMM)在被挑選的物種中搜尋LHT基因。這些物種包括5種核心真雙子葉植物和4種單子葉植物，這9個(gè)物種均已完成了全基因組測(cè)序。之后，根據(jù)序列比對(duì)，手動(dòng)去除質(zhì)量較差的序列，最終獲得114個(gè)LHT基因，如表1所示。很明顯，這些物種中祖先經(jīng)歷過更多全基因組重復(fù)事件的物種基因組內(nèi)有更多的LHT基因成員(表1)，多經(jīng)歷了兩輪全基因組重復(fù)的豆科植物大豆的基因數(shù)目(25)高于同科的苜蓿(19)、菜豆(14)和百脈根(8)。這些結(jié)果暗示LHT基因家族在植物進(jìn)化的過程中一直在持續(xù)擴(kuò)張，并且其擴(kuò)張與全基因組重復(fù)密切相關(guān)。

表1 選取的被子植物分類及數(shù)據(jù)情況Tab. 1 The classification and data of the selected angiosperms

2.2 被子植物中LHT基因家族的系統(tǒng)發(fā)生

選取代表物種的LHT蛋白全長序列，利用ML對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建。基于蛋白質(zhì)全長序列的系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果顯示，LHT基因可以分為具有不同支持率(43%～98%)的7大類：Ⅰ—Ⅶ。除分支Ⅱ和Ⅲ外，其余均含有單子葉和雙子葉植物成員。分支Ⅱ?yàn)殡p子葉植物特有，分支Ⅲ為單子葉植物特有。分支Ⅲ中來自水稻、玉米、粟和二穗短柄草的LHT基因并未嚴(yán)格按照物種界限聚類，而是混合分布(圖1)。

圖1 LHT系統(tǒng)發(fā)生樹和基因結(jié)構(gòu)Fig. 1 Phylogenetic tree and gene structure of LHT

這些分析表明，該分支基因的起源應(yīng)該在水稻、玉米、粟等禾本科植物分開之前，且有可能經(jīng)歷了禾本科植物祖先的多次全基因組加倍事件以及后期各自獨(dú)立進(jìn)化過程中的譜系篩選。其余分支(Ⅰ、Ⅳ—Ⅶ)是具有單子葉植物和雙子葉植物成員的復(fù)雜分支。在這些分支中，雙子葉植物和單子葉植物的LHT基因成員并未按照譜系差異分開，而是互相混合在一起，形成支持度高低不同的小分支。這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)暗示這些基因可能經(jīng)歷了被子植物的WGD事件。

2.3 大豆LHT旁系同源基因共線性及進(jìn)化歷史構(gòu)建

染色體定位分析表明，LHT基因在被子植物基因組中的分布沒有特定的規(guī)律，多散布在多個(gè)染色體上。如在大豆中含有25個(gè)LHT基因，這25個(gè)基因毫無規(guī)律地分布在1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)等染色體上(表2)。另外，進(jìn)一步的共線性分析表明，大豆LHT基因擴(kuò)增過程中，WGD或串聯(lián)重復(fù)扮演了極為重要的角色，鑒定出大豆的25個(gè)LHT基因，64%的同源拷貝是WGD或串聯(lián)重復(fù)的結(jié)果(圖2A)。根據(jù)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和共線性分析，重構(gòu)了大豆LHT旁系同源基因的進(jìn)化歷史(圖1，圖2B)。在單雙子葉植物分化之前，存在有4個(gè)LHT祖先基因，第一和二個(gè)祖先基因在13×106a之前又分別經(jīng)歷了一次加倍，而第四個(gè)則在單雙子葉植物分化前首先經(jīng)歷了一次基因加倍事件。隨后，分別經(jīng)歷了13×106a的豆科植物的全基因組重復(fù)事件，最終在大豆基因組中保留了8對(duì)旁系同源基因(圖2B)。

圖2 大豆LHT基因的共線性分析及進(jìn)化分析Fig. 2 Collinearity analysis and evolution analysis of soybean LHT genes

表2 大豆LHT基因成員信息Tab. 2 Member information of soybean LHT genes

2.4 大豆旁系同源基因Ka/Ks和功能分化分析

非同義替換率(Ka)與同義替換率(Ks)的比值是鑒定蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中所承受選擇壓力的一個(gè)重要指標(biāo)。當(dāng)Ka/Ks>1時(shí)為正達(dá)爾文選擇，Ka/Ks=1時(shí)為中性進(jìn)化，Ka/Ks<1時(shí)為凈化選擇。為了研究大豆LHT旁系同源基因功能分化機(jī)制，對(duì)大豆8對(duì)旁系同源基因編碼序列的Ka和Ks進(jìn)行計(jì)算(表3)，Ka/Ks值均小于1(0.15～0.47)，平均值為0.30，表明較強(qiáng)的凈化選擇在全基因組復(fù)制后基因功能的分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

2.5 大豆LHT同源基因結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的跨膜區(qū)、結(jié)構(gòu)域分析

為了研究大豆LHT基因的序列特征，分別對(duì)Ⅰ—Ⅶ類的序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)及跨膜區(qū)進(jìn)行分析?？梢钥闯?圖1、圖3)，在同一類群內(nèi)部，大部分成員具有共同或類似的結(jié)構(gòu)域(數(shù)據(jù)未列出)組成，提示它們可能具有相似的功能。進(jìn)一步蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，除Gma20G186600外，其余成員完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)均具有2個(gè)及以上跨膜區(qū)(圖3)，推測(cè)這與其主要行使氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的功能相關(guān)。同時(shí)，對(duì)不同類群的LHT基因組序列進(jìn)行了內(nèi)含子/外顯子組成分析。

表3 大豆LHT基因Ka、Ks估算Tab. 3 Estimation of Ka and Ks of soybean LHT genes

圖3 大豆LHT基因跨膜分析Fig. 3 Transmembrane analysis of soybean LHT gene

結(jié)果表明，每一個(gè)類群內(nèi)部，其大部分成員具有相似的內(nèi)含子/外顯子組成，包括內(nèi)含子類型、內(nèi)含子數(shù)量以及外顯子長度。而編碼保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列，內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)的相似度更高，如類群Ⅳ的6個(gè)成員均具有相同的基因結(jié)構(gòu)和motif組成。另一方面，不同類群之間內(nèi)含子數(shù)目構(gòu)成差異較大，從1個(gè)(類群Ⅴ)到9個(gè)(類群Ⅱ)(圖2)。

2.6 大豆GmLHT基因的表達(dá)模式分析

對(duì)大豆LHT家族基因在子葉、根、莖、葉、花、花蕾、種子、根瘤等部位中的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：除Gma20G186600外，其余成員的表達(dá)可以分為兩類：一類為組織特異性表達(dá)基因，如Gma18G009400/Gma11G247800和Gma08G101900/Gma05G145300，在花發(fā)育過程中表達(dá)量最高，在其他組織中表達(dá)量很低，推測(cè)這些成員可能參與了大豆花的發(fā)育過程；Gma06G019500/Gma04G019200分別在花和葉芽中表達(dá)量最高，暗示著其可能在花芽分化過程中發(fā)揮著重要作用。第二類主要是一些非組織特異性表達(dá)的基因，如Gma15G068700、Gma13G245000在多個(gè)組織中均有低水平表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)表達(dá)特性不同的成員的進(jìn)化簇分布情況分析發(fā)現(xiàn)：一些組織特異性表達(dá)的基因主要分布在Group Ⅰ、Ⅱ和Ⅶ(圖4)。

圖4 大豆LHT家族成員的表達(dá)模式分析及亞家族分布Fig. 4 Expression pattern analysis and sub-family distribution of LHT family members in soybean

2.7 大豆GmLHT基因的組織表達(dá)分析

基于qRT-PCR技術(shù)，進(jìn)一步分析這25個(gè)LHT基因在大豆的根、莖、葉，接種根瘤菌的根、莖、葉和根瘤等7個(gè)組織中的表達(dá)特征。以持家基因β-actin為內(nèi)參，定量分析表明，25個(gè)大豆LHT基因具有完全不同的表達(dá)模式，呈現(xiàn)多樣化(圖5)。GmaLHT1/2/3/6/19/19在接種根瘤菌后大豆葉片中表達(dá)量較高，如GmaLHT2在接種根瘤菌后大豆葉片中的表達(dá)量是未接種的葉片的近400倍；GmaLHT4/13接種后的莖中特異性表達(dá)，特別是GmaLHT4，表達(dá)量升高了近1 560倍；GmaLHT9/15在接種根瘤菌后大豆的根中特異性表達(dá)。屬于同一組的不同基因具有不同的表達(dá)特征，表明其在進(jìn)化的過程中，家族內(nèi)同類基因表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)的相似性和功能分化的多樣性。

2.8 GmaLHT的超表達(dá)促進(jìn)結(jié)瘤

為了檢測(cè)GmaLHT基因的生物學(xué)功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化技術(shù)，將構(gòu)建的超表達(dá)載體和空載體分別導(dǎo)入百脈根毛根中，然后接種M.lotiMAFF303099根瘤菌4周后統(tǒng)計(jì)結(jié)瘤數(shù)目。結(jié)果顯示，GmaLHT17-OX植株的結(jié)瘤數(shù)目與對(duì)照相比明顯增加，對(duì)照組平均每棵植株結(jié)瘤數(shù)目為4.9，GmaLHT17-OX為11.2(圖6)。百脈根超表達(dá)植株根瘤的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6D)，在超表達(dá)GmaLHT17-OX中GmaLHT17基因 mRNA的表達(dá)水平為對(duì)照的13.6倍，表明超表達(dá)載體的構(gòu)建有效。因此，GmaLHT17基因的超表達(dá)能夠引起植株結(jié)瘤數(shù)目的增加。

圖5 LHT基因在大豆不同組織中的qRT-PCR分析Fig. 5 qRT-PCR analyses of LHT genes in different tissues of soybean

注：A)對(duì)照，Ct. p1302G (對(duì)照)；B)轉(zhuǎn)基因根毛結(jié)瘤，GmaLHT17-OX. GmaLHT17-p1302;C)轉(zhuǎn)基因毛根的結(jié)瘤數(shù)目；D)轉(zhuǎn)基因毛根中GmaLHT17的轉(zhuǎn)錄水平。*和**分別表示對(duì)照與超表達(dá)株系間在0.05和0.01水平存在顯著性差異。

3 討論

3.1 LHT基因家族的起源和進(jìn)化

LHT基因在植物防御、發(fā)育等方面承擔(dān)著多種重要的生理功能[18-20]。通過全基因組掃描，在被子植物代表物種中獲得114個(gè)LHT基因，但是在綠藻中沒有找到LHT基因的同源拷貝，說明該基因家族為陸生植物所特有，而且該基因數(shù)量的大規(guī)模擴(kuò)增主要發(fā)生在后期的譜系進(jìn)化過程中。對(duì)大豆LHT基因染色體定位和共線性分析表明，染色體片段的復(fù)制和全基因組加倍事件可能對(duì)其在不同進(jìn)化階段的擴(kuò)增產(chǎn)生重要影響。目前有更多的證據(jù)證實(shí)，在植物進(jìn)化的歷史中存在多次全基因組重復(fù)事件，其中包括發(fā)生在十字花科譜系的2次比較近的α和β事件[10,12,26]，所有真雙子葉植物共有的一次三倍化事件(γ)[4]，以及發(fā)生在單子葉植物的谷物和其他禾本科草類分化之前的ρ和σ事件[8-9]。在豆科的歷史上也發(fā)生過一次全基因組重復(fù)事件，2010年完成的大豆全基因組測(cè)序不僅確認(rèn)了這次全基因組重復(fù)(53 ×106a)，還發(fā)現(xiàn)了一次大豆特有的更近期的全基因組重復(fù)(13×106a)[23]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合染色體定位和共線性等資料表明，大豆LHT基因家族中的很多片段重復(fù)可能都源自植物進(jìn)化過程中不同階段發(fā)生的全基因組重復(fù)事件。因此，LHT基因家族在大豆中是一個(gè)比較古老的基因家族，其成員經(jīng)歷了大范圍的WGD、染色體片段重復(fù)等擴(kuò)增方式，在大豆基因組中保留下來，進(jìn)而分化出不同的功能。從進(jìn)化樹還可看出，幾乎所有的基因在9個(gè)物種中都有分布，少見有大規(guī)模丟失的情況，這表明，在被子植物的共同祖先中，多拷貝的保留或丟失可能在物種分化前就已經(jīng)完成，而不是在物種分化完成后在不同物種中獨(dú)立丟失。

3.2 大豆LHT基因家族的擴(kuò)張與全基因組重復(fù)相關(guān)

從圖1可以看出，基因組重復(fù)對(duì)LHT基因家族的擴(kuò)張具有重要意義，經(jīng)歷過全基因組重復(fù)的物種類群中LHT基因數(shù)量相對(duì)高于其他近緣物種，特別是大豆，其數(shù)量約是同科物種菜豆的2倍，百脈根的3倍。大豆特有的全基因組重復(fù)約發(fā)生在13×106a前，距今時(shí)間短，大量基因得以保留。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，這些復(fù)制后保留下來的基因序列同源性較高，但表達(dá)模式已出現(xiàn)分化。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在分子進(jìn)化樹中，幾乎所有基因拷貝數(shù)增加的事件都能夠與已知的全基因組重復(fù)事件對(duì)應(yīng)，表明在被子植物種WGD對(duì)基因家族擴(kuò)張的貢獻(xiàn)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他類型的基因重復(fù)。

3.3 大豆重復(fù)基因進(jìn)化過程中的功能分化

植物遭遇環(huán)境脅迫或者掠食者時(shí)不能像動(dòng)物一樣移動(dòng)逃離，只能依靠自己遺傳變異來抵抗外界傷害。全基因重復(fù)是進(jìn)化的主要驅(qū)動(dòng)力之一，而基因重復(fù)及重復(fù)后的分化是新基因產(chǎn)生、提高物種適應(yīng)性以及產(chǎn)生新物種的基礎(chǔ)[27-28]?；蚣易宓臄U(kuò)張依賴基因拷貝數(shù)的增加，而基因拷貝數(shù)的增加則與基因功能分化密切相關(guān)。基因重復(fù)后會(huì)發(fā)生基因的丟失和保留，保留下來的基因則可以維持原有功能或發(fā)生分化[29-30]。大部分保留下來的重復(fù)基因存在一定的功能偏好性，與物種自身的生理變化相關(guān)，幫助其更好地適應(yīng)環(huán)境，同時(shí)，也會(huì)推動(dòng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)化[31-32]。根據(jù)對(duì)大豆LHT旁系同源基因?qū)Ρ磉_(dá)數(shù)據(jù)的分析，不難發(fā)現(xiàn)，8對(duì)旁系同源基因的表達(dá)情況有所不同，有的具有相同表達(dá)模式，有的則明顯不同。這些結(jié)果表明，這些基因在大豆中已經(jīng)發(fā)生了功能分化，并且對(duì)應(yīng)了基因功能分化的不同類型。

3.4 大豆LHT基因促進(jìn)豆科植物結(jié)瘤效率

豆科植物固氮占整個(gè)生物固氮量的75%，而共生固氮涉及根瘤菌與植物根部細(xì)胞之間的識(shí)別、互作、結(jié)瘤和固氮基因的表達(dá)以及二者之間信息網(wǎng)絡(luò)的建成和傳遞，因而共生結(jié)瘤固氮始終是生物固氮研究領(lǐng)域中最受關(guān)注的部分之一。目前，發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化方法已成為根系生物學(xué)研究的一種高效快捷的方法。本研究中構(gòu)建了大豆GmaLHT17基因的超表達(dá)載體，通過發(fā)根農(nóng)桿菌LBA1334菌株介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得了百脈根超表達(dá)陽性毛根。首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了超表達(dá)大豆GmaLHT17能夠顯著增加百脈根的結(jié)瘤數(shù)目，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果，推測(cè)GmaLHT17基因可能在根瘤菌與植物互作共生的早期階段發(fā)揮作用，從而正調(diào)控結(jié)瘤的過程。而該基因通過哪種調(diào)控途徑來影響植株結(jié)瘤，還需要后期的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來揭示其具體調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

基于9種已全基因組測(cè)序的被子植物代表物種的數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘出114個(gè)LHT家族成員，屬于7個(gè)亞家族，在染色體上的分布沒有明顯規(guī)律。大豆中含有25個(gè)成員，成員數(shù)目遠(yuǎn)多于其他物種，其中有8對(duì)旁系同源基因，共線性分析表明大豆LHT基因家族的擴(kuò)張與全基因組重復(fù)相關(guān)。大豆中LHT編碼的蛋白在56～543個(gè)氨基酸殘基之間，含有1～11個(gè)不等的跨膜結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)δ芫哂兄匾饔?。它們?cè)诖蠖怪胁煌l(fā)育階段的表達(dá)模式各不相同，通過在百脈根毛根中超表達(dá)GmaLHT17基因證實(shí)，其參與豆科植物結(jié)瘤固氮過程，推測(cè)可能在根瘤菌與植物互作共生的早期階段發(fā)揮作用，正調(diào)控結(jié)瘤的過程。對(duì)大豆LHT基因家族的分析及成員的功能研究，為提高大豆氨基酸含量及大豆氮肥利用效率的大豆新品種培育，提供重要的基因資源和理論基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。