粟雯，張丹，吳雅雯，鐘奇，蔣旭東，龍浩

(1.邵陽(yáng)學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000；2.湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽(yáng)，422000)

萘敏維滴眼液是常見(jiàn)的眼用制劑之一，主要在臨床上用于治療結(jié)膜充血，眼睛發(fā)癢等癥狀。滴眼液作為一種無(wú)菌外用制劑，為防止在使用的過(guò)程中被微生物污染，需要添加防腐劑[1-3]。尼泊金乙酯(ethylparaben，EP)的毒害作用小，并無(wú)局部刺激作用[4]，在合適的濃度范圍內(nèi)可以有效地抑制細(xì)菌、真菌等的滋生。但是EP的不當(dāng)添加，將有可能對(duì)眼部造成不同程度的傷害[5]，如引起結(jié)膜的炎癥反應(yīng)或?qū)е陆悄ど掀ぜ?xì)胞的缺失、甚至引起較嚴(yán)重的干眼癥。因此，嚴(yán)格控制萘敏維滴眼液中的EP的含量并進(jìn)行準(zhǔn)確定量顯得格外重要。目前，EP的定量分析方法主要有高效液相色譜法[6]、氣相色譜法[7]、毛細(xì)管氣相色譜法[8]、高效液相色譜法-質(zhì)譜法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]等。然而，由于滴眼液中組分多樣，EP的濃度極低，需要先通過(guò)一系列前處理過(guò)程對(duì)其進(jìn)行富集，再進(jìn)行定量檢測(cè)。目前用于萃取富集EP含量的前處理方法有液液萃取(LLE)[7]，固相萃取法(SPE)[11]、固相微萃取(SPME)[12-13]、微滴液相微萃取(SDME)[14]等，但傳統(tǒng)的樣品預(yù)處理方法LLE和SPE存在著萃取時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)溶劑消耗量大、不利于高效富集、成本較高等缺點(diǎn)。而SPME和SDME的預(yù)處理方法雖然試劑使用量較少，但操作步驟相對(duì)復(fù)雜。因此，發(fā)展操作簡(jiǎn)單、快速高效、綠色環(huán)保、萃取富集效果好的前處理技術(shù)是很有必要的。

超分子溶劑是指在水溶液的環(huán)境中兩親性化合物通過(guò)水相和有機(jī)相或分子間自發(fā)組裝和凝集過(guò)程所形成的具有納米結(jié)構(gòu)的膠束聚集體[15]。超分子溶劑萃取技術(shù)是以超分子溶劑作萃取劑的一種新型萃取技術(shù)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、成本低、溶劑用量少等優(yōu)勢(shì)，并且可以對(duì)不同極性的目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)高效萃取，已成功應(yīng)用于環(huán)境[16]、食品[17-18]和生物[19]等樣品的前處理。目前一般多采用烷基酸或醇與四氫呋喃和水混合的超分子溶劑對(duì)化合物進(jìn)行有效萃取。然而，由于組裝成的超分子溶劑的密度低于水，微量萃取相位于上相，較難收集，常需要特制窄口樣品裝置[20]，在一定程度上增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和成本。

六氟異丙醇(Hexafluoroisopropanol，HFIP)是一種全氟代醇，它引入了一種強(qiáng)疏水基團(tuán)-CF3，能夠誘導(dǎo)單一或混合兩親性化物質(zhì)在水溶液中形成超分子溶劑[21]。目前HFIP介導(dǎo)長(zhǎng)鏈烷醇兩親性化合物自組裝形成超分子溶劑，并對(duì)萘敏維滴眼液中的EP進(jìn)行萃取和檢測(cè)還未有報(bào)道。

本研究構(gòu)建了正辛醇-HFIP-水的超分子溶劑，結(jié)合渦旋和離心輔助對(duì)滴眼液中的EP進(jìn)行超分子溶劑液液微萃取，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)正辛醇和HFIP的用量、渦旋時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合超高效液相色譜測(cè)定萘敏維滴眼液中EP的含量，為萘敏維滴眼液中的防腐劑的含量測(cè)定提供簡(jiǎn)便、快速、高效、環(huán)保的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；H-1850臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；QL-901型渦旋混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；FB223電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

甲醇(德國(guó)默克公司)；HFIP(Adamas，上海泰坦科技股份有限公司)；EP標(biāo)準(zhǔn)品(Dr：Ehrenstorfer, LGC Standards GmbH)；正辛醇(Adamas，上海泰坦科技股份有限公司)；萘敏維滴眼液(江西閃亮制藥有限公司，批號(hào)2108071；沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司，批號(hào)1A210901；山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司，批號(hào)21120901)；去離子水采用Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取5 mg(精確至0.1 mg)EP標(biāo)準(zhǔn)品至50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存待用。使用時(shí)，用去離子水逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 超分子溶劑的制備

準(zhǔn)確量取180 μL正辛醇和540 μL HFIP，迅速注入10 mL的離心管中，加入去離子水至9 mL的刻度線，渦旋振蕩3 min后，以3 004 r/min離心2 min,體系分成界面清晰的兩相透明溶液，用微量注射器取出下相至玻璃瓶中，即得超分子溶劑，4 ℃下密封保存。

1.4 樣品處理

精密量取所購(gòu)買的滴眼液5 mL，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾后，取濾液450 μL于1.5 mL離心管中，加入225 μL的超分子溶劑，渦旋振蕩3 min后，以6 000 r/min的速度離心3 min，用注射器取出下相于進(jìn)樣瓶中，待超高效液相色譜測(cè)定。

1.5 色譜條件

色譜柱為Servo-PT C18 120A(250 mm×4.6 mm×5 μm)；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；流動(dòng)相為甲醇(A)∶0.1%醋酸水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～2.0 min，5%～30% A；2.0～5.0 min，30%～80% A；5.0～7.0 min，80%～100% A；7.0～7.5 min，100%～5% A；7.5～10.0 min,5% A；流速為0.3 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm。

1.6 超分子溶劑萃取條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

選取正辛醇/HFIP/水作為超分子溶劑體系，保持總體積為9 mL,HFIP的用量為450 μL,考察了正辛醇的用量分別為135、180、225、270、315 μL時(shí)目標(biāo)物質(zhì)的峰面積。HFIP是超分子溶劑的重要組成部分，與水完全互溶并對(duì)長(zhǎng)鏈烷醇具有很強(qiáng)的溶解能力，使其在水中分散。本研究考察了HFIP用量分別為405、450、495、540和595 μL(保持總體積9 mL)時(shí)目標(biāo)物質(zhì)的萃取率。隨著HFIP的用量增加，EP的萃取率先升高后降低。一般而言，分散劑含量越高，超分子溶劑體積越大，對(duì)目標(biāo)物的富集情況也會(huì)減少。在超分子溶劑分散液液微萃取的過(guò)程中，渦旋能使目標(biāo)物與SUPRAS膠束聚集體充分發(fā)生作用，從而促進(jìn)傳質(zhì)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)考查了渦旋時(shí)間分別為1.0、2.0、3.0、3.5和4.0 min時(shí)EP的萃取率。在超分子溶劑分散液液微萃取過(guò)程中，離心可以促使SUPRAS相與水相更好地分離，有利于對(duì)目標(biāo)物的萃取。

2 結(jié)果

2.1 超分子溶劑萃取條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

如圖1所示，當(dāng)正辛醇用量位于135～180 μL之間時(shí)，隨著正辛醇用量的增加，峰面積逐漸增大，萃取率也逐漸升高，當(dāng)正辛醇用量高于180 μL時(shí)，萃取量逐漸達(dá)到飽和，由于超分子溶劑體積的增大反而會(huì)降低EP的濃度，因此，實(shí)驗(yàn)選擇的正辛醇的用量設(shè)置為180 μL(2%,v/v)。

圖1 不同因素對(duì)EP峰面積的影響Fig.1 Effects of different factor on peak area of EP

2.1.1 HFIP用量的優(yōu)化

當(dāng)HFIP的用量為540 μL(6%,v/v)時(shí)，EP標(biāo)準(zhǔn)品的萃取效果最好，因此，在后續(xù)的研究中540 μL HFIP為最佳用量。

2.1.2 渦旋時(shí)間的優(yōu)化

結(jié)果顯示，渦旋時(shí)間對(duì)EP的萃取效果影響不大，但渦旋為3.0 min時(shí)，目標(biāo)物的萃取效率相對(duì)最高。因此，選擇渦旋3.0 min為最佳條件。

2.1.3 離心時(shí)間的優(yōu)化

離心時(shí)間對(duì)EP的萃取效果基本沒(méi)有影響，但離心2 min時(shí)萃取效果最好。因此，選擇離心2 min為最佳條件。

2.2 超分子溶劑萃取條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述單因素分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以EP的萃取率為考察指標(biāo)，采用L9(33)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。通過(guò)比較表2各個(gè)因素對(duì)EP萃取率的極差值，可確定影響順序?yàn)锳>B>C，得到最佳提取條件為A2B2C2。從表3可看出，A、B因素各水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)、C因素各水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。綜合考慮確定最優(yōu)萃取條件為2%正辛醇、6%HFIP、渦旋3.0 min、離心2 min。

表1 因素水平表(正交設(shè)計(jì))

表2 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

在最優(yōu)萃取條件(2%正辛醇，6%HFIP，渦旋3 min，離心2 min)下，測(cè)定一系列不同加標(biāo)水平的樣品，對(duì)本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，EP在0.01～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(y=2 872x-7 772.4，R2=0.999 1),檢出限為1.2 μg/L，定量限為4.0 μg/L。為避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的隨機(jī)因素所造成的影響，對(duì)500 μg/L EP標(biāo)準(zhǔn)液做日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)，日內(nèi)精密度和日間精密度分別為4.82%和3.21%。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

在市場(chǎng)上隨機(jī)選取了3種不同廠家的滴眼液，對(duì)其中的EP的含量進(jìn)行了測(cè)定。在各種滴眼液中EP的含量都低于檢測(cè)線，即可認(rèn)為不含EP。對(duì)所有待測(cè)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率的考察，見(jiàn)表4。

表4 尼泊金乙酯的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.5 與其他方法比較

本文所述的超分子溶劑萃取方法處理過(guò)程快速簡(jiǎn)單，萃取時(shí)間少，與其他方法的比較見(jiàn)表5。

表5 超分子萃取方法與其他方法比較

3 討論

本研究采用正辛醇為萃取劑，水和HFIP為分散劑，制備了新型超分子溶劑，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，此新型超分子溶劑有利于實(shí)現(xiàn)極性較大的EP的萃取，在2%正辛醇和6%HFIP的組成下，對(duì)目標(biāo)物渦旋3 min，再離心2 min，可達(dá)到最佳萃取效率。

綜上所述，本文建立了一種基于HFIP-正辛醇-水為萃取劑的測(cè)定滴眼液中EP的新方法。此種超分子溶劑萃取劑可以快速實(shí)現(xiàn)對(duì)極性目標(biāo)化合物的高效萃取和富集，與傳統(tǒng)的超分子溶劑相比，其位于體系下相，更容易收集和處理。該方法與其他方法相比，前處理過(guò)程快速簡(jiǎn)單，消耗溶劑少，更加綠色環(huán)保，回收率及精密度較高，可為滴眼液中其他防腐劑的萃取測(cè)定提供一種可行高效的方案。