李輝，肖嫦娥，游濤

(邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 邵陽，422000)

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是全世界成年人死亡和永久殘疾的主要原因，具有較高患病率、致殘率、病死率，嚴(yán)重影響著患者的身心健康與生活質(zhì)量[1]。腦缺血或缺氧會破壞作為血腦屏障重要結(jié)構(gòu)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial,BMECs)間的連接、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能等，從而損傷腦細(xì)胞和腦組織，造成腦功能紊亂[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)基因的表達(dá)。近年來有報道稱，lncRNAs可調(diào)節(jié)腦卒中后BMEC的存活、炎癥反應(yīng)和血管生成[3-4]。LncRNA TSPOAP1-AS1(ENSG00000265148.5)，又名BZRAP1-AS1，參與肝癌、前列腺癌等的發(fā)生發(fā)展[5-6]。然而，關(guān)于其在腦卒中的作用鮮有報道。本研究首先分析IS患者血清樣本中TSPOAP1-AS1的表達(dá)水平，然后擬體外培養(yǎng)小鼠BMECs，通過氧糖剝奪實驗建立細(xì)胞缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)損傷模型，研究lncRNA TSPOAP1-AS1在OGD條件下對人BMECs存活的影響，為IS防治尋找新的潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2021年5月至10月期間邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院就診后確診的10例IS患者作為試驗組，另外收集10例同期來本醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康者作為對照組。兩組性別和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)病癥符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[7]中IS診斷的準(zhǔn)則；(2)首次經(jīng)頭顱CT或MRI確診；(3)發(fā)病時間在72 h以內(nèi)，且在住院24 h內(nèi)完成其靜脈血液樣本收集；(4)無精神系統(tǒng)方面的疾病。剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有重要臟器器質(zhì)性損傷;(2)伴有腦出血、惡性腫瘤、嚴(yán)重感染等;(3)在確診前3個月內(nèi)有服用葉酸、維生素B12、B6等藥劑；(4)有心理精神疾病并服用精神類藥劑的。所有參與者均了解研究內(nèi)容，并簽署知情同意書。空腹?fàn)顟B(tài)采集所有受試者的肘靜脈血5 mL，離心分離血清，-80 ℃冰箱保存，實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測樣本中TSPOAP1-AS1的相對表達(dá)水平。本研究經(jīng)邵陽學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要實驗材料

小鼠BMECs購買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；無糖和正常糖的DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購自美國GIBCO公司；TRIzol和Lipofectamine 2000試劑盒均購于美國Invitrogen公司；Prime Script RT reagent Kit和qPCR試劑購于日本Taraka公司；MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒購于美國Promega公司；lncRNA TSPOAP1-AS1干擾序列(si-TSPOAP1-AS1)和對照(negative Control)序列(si-NC)購于蘇州吉瑪基因股份有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和OGD損傷模型的構(gòu)建

小鼠BMECs在使用前細(xì)胞已經(jīng)生長到大約90%的融合度，為模擬OGD缺血樣條件，BMECs接種在無糖的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后置于37 ℃、95% N2、5% CO2氣體培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。對照組BMECs在正常條件下培養(yǎng)6 h。RT-qPCR檢測細(xì)胞中TSPOAP1-AS1的相對表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實驗分組

在正常條件下培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增長時收集細(xì)胞，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行si-TSPOAP1-AS1和si-NC轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為si-NC+OGD組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC后OGD處理6 h)；si-TSPOAP1-AS1+OGD組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-TSPOAP1-AS1后OGD處理6 h)。RT-qPCR檢測細(xì)胞中TSPOAP1-AS1的相對表達(dá)水平。

1.5 RT-qPCR

TRIzol試劑提取血清樣本、經(jīng)培養(yǎng)或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的總RNA，檢測濃度和質(zhì)量后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)試劑說明書配置qPCR體系，檢測樣本中TSPOAP1-AS1表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計算TSPOAP1-AS1相對表達(dá)。

1.6 MTS實驗

MTS實驗檢測上述兩組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖。將接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至96孔板中，各組設(shè)置3個復(fù)孔，隨后將細(xì)胞經(jīng)OGD處理6 h，正常條件下培養(yǎng)24、48、72 h后，按照MTS檢測試劑盒方法用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在490 nm波長下的吸光度，計算細(xì)胞的存活率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 IS患者血清中TSPOAP1-AS1表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果表明，IS患者和健康體檢者血清中TSPOAP1-AS1相對表達(dá)水平分別為5.28±1.45和0.99±0.358。與健康體檢者相比，IS患者血清中TSPOAP1-AS1水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.12，P<0.001)。

2.2 OGD損傷模型細(xì)胞中TSPOAP1-AS1的表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示，正常條件下培養(yǎng)的BMECs和OGD損傷模型BMECs中TSPOAP1-AS1的相對表達(dá)水平分別為0.98±0.66和6.73±4.80。與正常條件培養(yǎng)相比，OGD損傷模型BMECs中TSPOAP1-AS1相對表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.75，P=0.002)。

2.3 干擾OGD損傷模型細(xì)胞中TSPOAP1-AS1的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染后的OGD損傷模型細(xì)胞，si-NC+OGD組和si-TSPOAP1-AS1+OGD組中TSPOAP1-AS1的相對表達(dá)水平分別為1.00±0.15和0.03±0.01。與si-NC+OGD組相比，si-TSPOAP1-AS1+OGD組中TSPOAP1-AS1的相對表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.40，P=0.001)。

2.4 干擾TSPOAP1-AS1表達(dá)對OGD損傷模型細(xì)胞存活率的影響

MTS實驗結(jié)果顯示，與si-NC+OGD組相比，si-TSPOAP1-AS1+OGD組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h這3個時間點(diǎn)的存活率均顯著增大，且培養(yǎng)時間越長存活率差異相對越大，見表1。

表1 MTS實驗檢測干擾TSPOAP1-AS1表達(dá)對OGD損傷模型細(xì)胞的存活率的影響

3 討論

IS給患者和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，盡管在臨床上血管再通治療取得了一定的進(jìn)展，但I(xiàn)S的治療選擇仍然非常有限[8]。因此，迫切需要尋找新的有效治療IS的方式和靶點(diǎn)。

lncRNA作為一類發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼RNA，被當(dāng)作一種新的生物標(biāo)志物引起廣泛關(guān)注。在IS患者和動物模型中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種異常表達(dá)的lncRNA，與IS密切相關(guān)[9]。最新研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TSPOAP1-AS1與阿爾茨海默病的危險因子基因滋養(yǎng)層糖蛋白相互作用，與阿爾茨海默病的進(jìn)展密切相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)在IS患者血清中TSPOAP1-AS1表達(dá)異常升高，表明TSPOAP1-AS1可能參與IS病理過程。BMECs在IS過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MMP通過促進(jìn)BMECs中的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)MMP-2表達(dá)和金屬蛋白酶抑制劑1的釋放，介導(dǎo)血腦屏障分解[11]。越來越多的研究證實，保持BMECs的存活、再生以及抑制凋亡可以減輕缺血或缺氧引起的血腦屏障損傷[12]。因此，靶向BMEC是一種很有前途的針對IS的治療方法，通常在體外使用OGD模型誘導(dǎo)細(xì)胞。而lncRNA作為一種與細(xì)胞分化、增殖等生理和病理相關(guān)的調(diào)控分子，與BMECs的存活、再生、凋亡等密切相關(guān)[13]，如lncRNA NEAT 1通過靶向miR-377和促進(jìn)VEGFA、SIRT 1和BCL-XL的表達(dá)，改善OGD誘導(dǎo)的BMECs存活和血管生成[14]。因此，本研究隨后利用OGD模型誘導(dǎo)BMECs，研究TSPOAP1-AS1對OGD誘導(dǎo)的BMECs存活的影響，發(fā)現(xiàn)BMECs經(jīng)OGD誘導(dǎo)后細(xì)胞中TSPOAP1-AS1表達(dá)異常升高，與其在IS患者血清中表達(dá)相似。干擾BMECs中TSPOAP1-AS1表達(dá)能夠提高OGD處理BMECs的存活率，表明干擾BMECs中TSPOAP1-AS1表達(dá)能夠促進(jìn)OGD處理的BMECs存活。雖然證實了TSPOAP1-AS1對OGD處理的BMECs存活發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但是關(guān)于TSPOAP1-AS1對OGD處理BMECs存活的調(diào)控機(jī)制、其在IS中的具體作用等還需要在后續(xù)的研究中進(jìn)行證實。

證實了TSPOAP1-AS1在IS患者血清和OGD處理的BMECs中高表達(dá)，干擾TSPOAP1-AS1表達(dá)能夠促進(jìn)OGD處理的BMECs存活。TSPOAP1-AS1可以作為IS治療潛在的新靶點(diǎn)，具有臨床應(yīng)用前景，但是其具體機(jī)制和效應(yīng)仍需深入研究和驗證。