康忱，趙雪芳，李亞棟，田哲娟，王鵬，吳志明

黃瓜CC-NBS-LRR家族基因鑒定及在霜霉病和白粉病脅迫下的表達(dá)分析

康忱，趙雪芳，李亞棟，田哲娟，王鵬，吳志明

河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，石家莊 050051

【目的】對黃瓜全基因組的CC-NBS-LRR（CNL）基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，為深入研究CNL基因家族在黃瓜生長、發(fā)育和病害脅迫響應(yīng)中的功能提供參考?！痉椒ā恳詳M南芥為參考序列，利用本地perl語言和Pfam等軟件檢索黃瓜‘9930’基因組并確定黃瓜CNL基因家族成員。通過ExPASy、GSDS2.0、MEGA、MEME、Tbtools、Mev等工具對黃瓜CNL家族基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫、霜霉病菌（）、白粉病菌（）接種處理和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該類基因的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】從黃瓜全基因組中鑒定得到17個(gè)，這些基因分布在除1號染色體外的6條染色體上，其編碼蛋白與其他植物CNL結(jié)構(gòu)相似，均含有CC、NBS和LRR保守結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)大小介于197—1 148 aa，分子量在22.6—131.3 kD，等電點(diǎn)在5.71—8.38。共線性分析表明其中不存在片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)基因，多物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系表明，CsCNL基因家族成員在葫蘆科植物之間具有較高的結(jié)構(gòu)和功能相似性。啟動子中存在多種與抗病相關(guān)的順式作用元件。表達(dá)具有組織特異性。在接種霜霉病菌2 d和5 d后，、和在抗性品種中均顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中下調(diào)表達(dá)，在敏感品種中顯著性表現(xiàn)不一；在接種白粉病菌2 d和5 d后，和在敏感品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中顯著下調(diào)表達(dá)；、和在抗性品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在敏感品種中表達(dá)量無變化或顯著下調(diào)?！窘Y(jié)論】CsCNL家族成員具有組織表達(dá)特異性并且多數(shù)基因能夠響應(yīng)霜霉病菌和白粉病菌的脅迫。推測、和表達(dá)量增加，表達(dá)量減少可誘發(fā)抗病黃瓜品種的霜霉病抗病反應(yīng)；、和表達(dá)量增加，和表達(dá)量減少可誘發(fā)抗病黃瓜品種的白粉病抗病反應(yīng)；而表達(dá)量的增加能同時(shí)誘發(fā)抗病黃瓜品種的霜霉病和白粉病的抗病反應(yīng)。

黃瓜；CC-NBS-LRR（CNL）；霜霉?。话追鄄?；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】在與病原微生物共同進(jìn)化的過程中，植物先天免疫系統(tǒng)會發(fā)揮至關(guān)重要的作用，保護(hù)自身免受生物或非生物脅迫的影響[1-2]。植物先天免疫系統(tǒng)主要包括兩個(gè)層次：第一層次是病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫（pattern-triggered immunity，PTI）反應(yīng)；第二層次是效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，ETI）反應(yīng)，面對病原菌的入侵，植物進(jìn)化出細(xì)胞內(nèi)受體蛋白，主要為抗病基因（R基因）編碼的R蛋白，不同的R蛋白可以直接或間接識別不同來源的病原物效應(yīng)因子，并且激發(fā)相似的防衛(wèi)反應(yīng)[3-7]。CNL（coiled-coil nucleotide-binding site leucine-rich repeat，CC-NBS-LRR）作為R基因家族中非常重要的一類，在植物病害防御過程中具有重要作用。黃瓜（）為葫蘆科一年蔓生或攀援草本植物，是我國重要的蔬菜作物之一。由古巴假霜霉菌（）侵染引起的霜霉?。╠owny mildew，DM）和由單囊殼白粉菌（）引起的白粉病（powdery mildew，PM）是黃瓜生產(chǎn)中極具破壞性的病害，給黃瓜生產(chǎn)帶來巨大威脅[8-10]。鑒定并分析黃瓜可為研究該類基因在黃瓜霜霉病和白粉病防御中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NBS-LRR基因家族是最大的一類R基因，其編碼的NBS-LRR蛋白是一種核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù)序列，該蛋白能夠保護(hù)植物靶點(diǎn)免受病原體效應(yīng)蛋白的侵害。NBS結(jié)構(gòu)域?qū)儆贜B-ARC（nucleotide-binding adaptor shared by APAF-1，R proteins and CED-4）結(jié)構(gòu)域，是ATP和GTP核苷酸結(jié)合所必需的關(guān)鍵區(qū)域，并在防御信號傳輸中起作用[11-12]。植物R基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)非常保守，最重要的特征之一就是具有LRR，LRR是NBS的C端富含亮氨酸重復(fù)序列的區(qū)域[13]。NBS-LRR類蛋白在植物各組織中均有分布，根據(jù)N端的不同，NBS-LRR蛋白分為TIR-NBS-LRR（toll/interleukin 1 receptor-NBS- LRR，TNL）類和non-TIR-NBS-LRR類，其中non-TIR- NBS-LRR包括CNL類和RPW8-NBS-LRR（resistance to powdery mildew 8-NBS-LRR，RNL）類。TNL類的N端包含TIR結(jié)構(gòu)域，CNL類的N端包含CC結(jié)構(gòu)域，RNL類的N端包含RPW8結(jié)構(gòu)域[14-15]。目前，多種植物的NBS家族成員已被報(bào)道，如粳稻[16]、大豆[17]、馬鈴薯[18]、木薯[19]、高粱[20]、野生刺葡萄[21]等。從中可以發(fā)現(xiàn)不同物種CNL家族成員的數(shù)量存在很大差異，大白菜、高粱、馬鈴薯、粳稻、油菜、木薯及谷子中分別鑒定出40、33、65、159、17、117和33個(gè)[16,18-20,22-24]。研究發(fā)現(xiàn)CNL家族在多種植物抗病過程中發(fā)揮作用。是最初從六倍體小麥中分離的能夠高抗小麥葉銹病的[25]；（）是編碼CNL蛋白的稻瘟病抗性基因[26]；能夠抵抗由f. sp.（）引起的小麥白粉病[27]；能抵抗由條形柄銹菌小麥專化型（f. sp.，）引發(fā)的條銹病[28]。2013年，Wan等[29]已對黃瓜基因組中NBS-LRR家族成員進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析，鑒定出57個(gè)NBS-LRR基因家族成員?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然黃瓜NBS-LRR基因家族以及其成員在抗病方面的功能已有報(bào)道[30]，但還未見針對黃瓜CNL（CsCNL）家族的研究報(bào)道，且該家族成員在防御霜霉病和白粉病等真菌病害侵染方面的作用尚不明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用生物信息學(xué)方法在黃瓜全基因組范圍內(nèi)對CsCNL基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對其染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化分化特征以及物種間的共線性進(jìn)行分析，構(gòu)建不同物種CNL蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹闡明進(jìn)化過程。檢測并分析在黃瓜不同組織和霜霉病菌、白粉病菌侵染下的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究CsCNL家族基因的生物學(xué)功能及其對霜霉病和白粉病的響應(yīng)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在河北省農(nóng)林科學(xué)院完成。

1.1 材料和處理

供試材料為黃瓜品種‘9930’‘PI 197088’和‘EOM402-10’。將供試黃瓜材料播種于育苗溫室，選取三片真葉期的幼苗進(jìn)行霜霉病菌和白粉病菌接種，均采用孢子懸浮液噴霧接種法。霜霉病菌：從田間發(fā)病植株上采摘新鮮病葉，將發(fā)病部位的新鮮霉層用消毒軟毛刷刷入無菌水中，用血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)濃度，配成濃度為5×105個(gè)/ml的孢子懸浮液。白粉病菌：從田間發(fā)病植株上采集白粉病菌孢子，同樣用無菌水將病菌配成濃度為5×105個(gè)/ml的孢子懸浮液。接種幼苗置于相對濕度100%的培養(yǎng)箱中處理48 h，然后將植株放置于溫度24—28℃，光照強(qiáng)度為2 000 1x，光周期為光照16 h/黑暗8 h的溫室中培養(yǎng)。分別在處理0、2和5 d后采集接種病菌的植株葉片，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法驗(yàn)證接種病原菌后在抗性品種和敏感品種中的表達(dá)差異。

1.2 CsCNL家族成員的獲得與鑒定

從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫CuGenDB（Cucurbit Genomics Database）（http://www.cucurbitgenomics.org/organism/ 2）下載“黃瓜基因組9930_V2版本”（‘9930’作為參考基因組）基因組數(shù)據(jù)。從TAIR數(shù)據(jù)庫（https:// www.arabidopsis.org/）獲得擬南芥（）CNL基因家族的基因ID和氨基酸序列信息。利用BioEdit軟件，以e-5為臨界值選取候選，用本地Perl語言提取候選基因蛋白序列，初步獲得CsCNL基因家族成員。結(jié)合下載于Pfam數(shù)據(jù)庫（https://pfam.xfam.org/）的CNL蛋白的NBS、CC和LRR保守結(jié)構(gòu)域，使用Pfam中的HMMScan和PfamScan對上一步獲得的候選基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，剔除不含CNL蛋白典型結(jié)構(gòu)域的序列，確定CsCNL基因家族的最終成員。

1.3 CsCNL家族基因生物信息學(xué)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過ExPASy網(wǎng)站（https://web.expasy.org/compute _pi/）對CsCNL家族蛋白的等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行預(yù)測。利用在線網(wǎng)站MEME（https://meme-suite.org/meme/ index.html）進(jìn)行motif預(yù)測，數(shù)量設(shè)置為15個(gè)，其余參數(shù)選擇默認(rèn)。提取CsCNL基因家族成員的gff文件信息，通過Gene Structure Display Server 2.0（GSDS2.0）網(wǎng)站（http://gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。從黃瓜基因組序列注釋文件中提取每個(gè)的染色體位置，利用MapGene2Chrom web v2（MG2C）在線網(wǎng)站（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制基因在各條染色體上的位置圖譜。利用TBtools中的MCscanX分析黃瓜、甜瓜、西瓜、擬南芥、玉米和高粱CNL家族成員之間的同源性，生成共線性分析圖。

使用軟件MEGA 7.0分別對黃瓜、甜瓜、西瓜、擬南芥、玉米和高粱中CNL的蛋白序列進(jìn)行多重比較，通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)BootStrap抽樣次數(shù)為1 000，其余參數(shù)默認(rèn)。

1.4 CsCNL家族基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

為了分析CsCNL家族基因啟動子區(qū)域包含的順式作用元件，利用TBtools軟件提取每個(gè)起始密碼子‘ATG’上游2 000 bp的序列， PlantCARE在線網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）對順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，然后使用Mev軟件對選取的抗病相關(guān)的順式作用元件進(jìn)行作圖分析。

1.5 CsCNL家族蛋白三維結(jié)構(gòu)的同源建模

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)對于理解其功能非常重要，為了從分子水平上了解蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，通過同源建模方法進(jìn)一步預(yù)測CsCNL蛋白的三維結(jié)構(gòu)。首先，使用位置特定的迭代BLAST算法（PSI-BLAST）在PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中找到最相似的同源蛋白[31]，然后使用Swiss-Model在線網(wǎng)站（https:// swissmodel.expasy.org/interactive/）預(yù)測CsCNL蛋白的三維結(jié)構(gòu)[32]。

1.6 基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基因組織表達(dá)與病害響應(yīng)分析

為了確定的組織表達(dá)特異性，從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫CuGenDB（Cucurbit Genomics Database）下載并分析相關(guān)的RNA-seq數(shù)據(jù)：10個(gè)黃瓜組織（根、莖、葉、子房（未膨大）、未受精子房（已膨大）、受精子房（已膨大）、雌花、雄花、卷須和卷須基部的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)）（PRJNA80169）；接種霜霉病菌的霜霉病抗性品種‘PI 197088’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)）（PRJNA388584）和接種白粉病菌的白粉病抗性品種‘SSL508-28’的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)）（PRJNA321023）。

1.7 CsCNL家族基因表達(dá)分析

使用植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）從樣品中提取總RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒（TaKaRa，北京）完成第一鏈cDNA的合成，使用的儀器為ABI PRISM 7500（操作軟件為7500 Fast Real-Time PCR Systems，v2.0.6，USA），熒光染料為TB Green，試劑盒為TaKaRa公司的TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）。使用Primer Premier 3在線設(shè)計(jì)特異性引物，序列如表1所示。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，包含5 μL的TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×），1 μL cDNA模板，primer-F/R（終濃度為0.2 μmol·L-1）各0.2 μL，0.2 μL ROX Reference Dye II（50×），3.4 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸34 s，40個(gè)循環(huán)；72℃ 20 s。（）為內(nèi)參基因。使用2-??CT算法分析基因的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 CsCNL家族基因的全基因組鑒定

通過序列分析，共鑒定得到17個(gè)。圖1為在染色體上的位置圖譜，17個(gè)分布在除1號外的6條染色體上，1—7號染色體上基因數(shù)目分別為0、3、4、5、1、1和3。根據(jù)基因片段的復(fù)制關(guān)系進(jìn)行共線性分析，其中不存在片段重復(fù)基因和串聯(lián)重復(fù)基因。CsCNL蛋白的氨基酸殘基數(shù)目在197—1 148，分子量在22.6—131.3 kD，蛋白等電點(diǎn)在5.71—8.38（表2）。

圖1 CsCNL家族基因在染色體上的位置

表2 CsCNL家族基因全基因組鑒定與分子特征分析

2.2 CsCNL家族基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

CsCNL家族基因外顯子數(shù)目差異明顯，為1—5個(gè)不等，其中有6個(gè)基因含有1個(gè)外顯子，8個(gè)基因含有2個(gè)外顯子，1個(gè)基因含有3個(gè)外顯子，2個(gè)基因含有5個(gè)外顯子（圖2-A）。CsCNL蛋白均含有該家族的CC、NBS和LRR保守結(jié)構(gòu)域，有14個(gè)家族成員含有10—15個(gè)motif，有3個(gè)成員含有6—7個(gè)motif（圖2-B）。

圖2 CsCNL家族成員基因的結(jié)構(gòu)（A）及保守基序motif（B）

使用MEGA 7.0和在線軟件ITOL對黃瓜、甜瓜、西瓜、擬南芥、玉米和高粱中的CNL家族蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。如圖3所示，根據(jù)其蛋白序列特征分為7個(gè)亞組，即Group 1—Group 7。最大的亞組為Group 4，有30個(gè)成員，最小的亞組為Group 5，有13個(gè)成員組成。絕大部分黃瓜、甜瓜和西瓜CNL家族成員集中在Group 1中，個(gè)別成員出現(xiàn)在Group 4、Group 6和Group 7。擬南芥CNL家族成員集中在Group 4、Group 5、Group 6和Group 7，單子葉植物玉米和高粱CNL家族成員在除Group 1外的6個(gè)亞組均有分布。

為了進(jìn)一步了解CsCNL家族基因的進(jìn)化關(guān)系，通過軟件MCscanX對黃瓜與甜瓜、西瓜、擬南芥、玉米、高粱中CNL家族基因進(jìn)行了物種間共線性分析，結(jié)果如圖4所示，和家族基因之間有3個(gè)同源基因?qū)?；和家族基因?個(gè)同源基因?qū)?；與、、家族基因之間沒有共線性基因。就單條染色體上的共線性基因分布而言，黃瓜的3號、4號和7號染色體上共線性基因分別為2條，其余染色體上為0條。

2.3 CsCNL家族基因啟動子中順式作用元件分析

利用在線網(wǎng)站PlantCARE對CsCNL家族中各基因啟動子區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測和分析。除去位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的TATAbox、CAAT-box和啟動子5′端上游調(diào)控區(qū)含有的分生組織、胚乳、種子細(xì)胞等調(diào)控元件和生物過程中涉及到的代謝、晝夜節(jié)律、細(xì)胞周期等響應(yīng)元件，的啟動子中包含10種參與抗病響應(yīng)的順式作用元件（W-box、ERE、GT1-motif、G-box、as-1、JERE、S-box、P-box、TGACG-motif和TC-rich repeats）以及植物激素響應(yīng)元件（圖5）。W-box是一類植物病原誘導(dǎo)相關(guān)基因的順式作用元件，ERE元件能夠調(diào)控真菌誘導(dǎo)表達(dá)，分別存在于10個(gè)啟動子中，共有19項(xiàng)和27項(xiàng)。共有8個(gè)在其啟動子中包含GT1-motif。G-box和as-1元件分別存在于13個(gè)和11個(gè)啟動子中，共有31項(xiàng)和26項(xiàng)。JERE元件和調(diào)控真菌誘導(dǎo)表達(dá)的S-box及P-box相似，存在于少數(shù)啟動子中。大多數(shù)啟動子中含有響應(yīng)茉莉酸（JA）途徑的TGACG-motif和響應(yīng)免疫防御反應(yīng)的TC-rich repeats。分別有12個(gè)啟動子中含有茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）響應(yīng)元件。

圖3 不同物種CNL家族蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 CsCNL家族蛋白同源建模

使用基于同源性的建模方法進(jìn)一步預(yù)測了這些CsCNL蛋白的三維結(jié)構(gòu)。大多數(shù)CsCNL蛋白的建模三維結(jié)構(gòu)在疊加時(shí)相對于相應(yīng)的同源模板顯示小于1?的均方根偏差（RMSD），表明預(yù)測是可靠的。結(jié)果表明，Csa7G425930由-螺旋組成，除此之外的16個(gè)CsCNL蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，均由-螺旋、-折疊以及不規(guī)則卷曲組成（圖6）。結(jié)構(gòu)的上半部分由-螺旋、-折疊和不規(guī)則卷曲組成，下半部分由3—4個(gè)-螺旋組成，內(nèi)部形成疏水腔。

2.5 CsCNL家族基因的組織表達(dá)分析

利用從黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫CuGenDB下載的RNA-seq數(shù)據(jù)，分析了CsCNL家族基因的組織表達(dá)情況（圖7-A）。其中、、、、、和在各組織中的表達(dá)量較高；、、、和在各組織的表達(dá)量較低；、、、、、、、和在未受精子房中的表達(dá)量最高，推測這些基因可能對黃瓜未受精子房的生長有重要作用；和在莖中的表達(dá)量最高，推測該基因可能對黃瓜莖的生長發(fā)揮重要作用；在抵抗病蟲害過程中發(fā)揮重要作用的葉片中，、、、、、、和的表達(dá)量較高。在各組織中的表達(dá)水平不同，表明其成員功能的分化和組織表達(dá)的特異性。

背景中灰色線條表示基因組中的共線區(qū)域，紅色線條突出顯示共線的CNL基因?qū)?/p>

2.6 CsCNL家族基因在霜霉病菌和白粉病菌處理下的表達(dá)分析

利用黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫下載來自黃瓜幼苗在霜霉病菌以及白粉病菌處理后的RNA-seq數(shù)據(jù)。霜霉病抗性品種‘PI 197088’在接種霜霉病菌0、6和24 h的表達(dá)情況見圖7-B，大部分受霜霉病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，其中、、、和在誘導(dǎo)后6 h和24 h上調(diào)表達(dá)；在誘導(dǎo)后6 h上調(diào)表達(dá)；在誘導(dǎo)后24 h上調(diào)表達(dá)；和在誘導(dǎo)后6 h下調(diào)表達(dá)，24 h上調(diào)表達(dá)；、、和在誘導(dǎo)后6 h和24 h下調(diào)表達(dá)；在6 h、在24 h下調(diào)表達(dá)；和兩個(gè)基因表達(dá)無顯著變化。

白粉病抗性品種‘SSL508-28’在白粉病菌處理48 h的表達(dá)情況見圖7-C，其中、、、、、和在接種白粉病菌后表達(dá)量升高；、、和在接種白粉病菌后表達(dá)量降低；其余基因沒有明顯的表達(dá)差異。

數(shù)字表示順式作用元件的數(shù)量The numbers represent the amount of cis-elements

圖6 CsCNL家族蛋白的三維結(jié)構(gòu)

A：組織表達(dá)模式Expression profiles of different tissues。Female：雌花Female flower；Leaf：葉；Male：雄花Male flower；Ovary_fertilized：受精子房；Ovary：子房；Ovary_unfertilized：未受精子房；Root：根；Stem：莖；Tendril_base：卷須基部；Tendril：卷須。B：在霜霉病菌處理下的表達(dá)模式Expression patterns after treated by P. cubensis。C：在白粉病菌處理下的表達(dá)模式Expression patterns after treated by P. xanthii

通過qRT-PCR檢測在霜霉病菌接種敏感品種‘9930’和抗性品種‘PI 197088’后0、2和5 d的表達(dá)量，如圖8所示，在接種2 d后，、、、、和在抗性品種和敏感品種中顯示出相似的表達(dá)趨勢，均上調(diào)表達(dá)，其中在抗性品種‘PI 197088’中的表達(dá)水平高于敏感品種‘9930’；、和在兩個(gè)品種中表現(xiàn)出相反的表達(dá)特征，其中和在敏感品種中顯著下調(diào)表達(dá)，在抗性品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在敏感品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中顯著下調(diào)表達(dá)。接種5 d后，、和在兩個(gè)品種中均上調(diào)表達(dá)，均下調(diào)表達(dá)；、和在兩個(gè)品種中表現(xiàn)出相反的表達(dá)特征，其中和在敏感品種中顯著下調(diào)表達(dá)，在抗性品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在敏感品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中顯著下調(diào)表達(dá)；和在敏感品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中無顯著變化；和在抗性品種中顯著下調(diào)表達(dá)，在敏感品種中無顯著變化。

處理與對照的差異顯著性分析用t-test法統(tǒng)計(jì)Significance differences between treatment and control were analyzed by t-test. * α=0.05，**α=0.01。圖9同The same as Fig. 9

綜合接種后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，和均下調(diào)表達(dá)，和無顯著變化。、和在抗性品種中均顯著上調(diào)表達(dá)，在敏感品種中顯著性表現(xiàn)不一致，而在抗性品種中下調(diào)表達(dá)，敏感品種中表現(xiàn)不一，結(jié)合上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這4個(gè)基因在各組織尤其是葉片中是有一定表達(dá)量的（圖7-A、7-B），推測、、和為黃瓜抗霜霉病的R基因，、和表達(dá)量增加可誘發(fā)抗病黃瓜品種的抗病反應(yīng)，而表達(dá)量減少可誘發(fā)抗病黃瓜品種的抗病反應(yīng)。

如圖9所示，利用qRT-PCR檢測在白粉病敏感品種‘9930’和抗性品種‘EOM402-10’接種白粉病菌0、2和5 d后的表達(dá)量，、、、和在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)趨勢一致，和上調(diào)表達(dá)，、和均下調(diào)表達(dá)。和在敏感品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中無顯著變化。接種后5 d、接種后2 d、和接種后2 d和5 d在兩個(gè)品種中表現(xiàn)相反的表達(dá)特征。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)沒有顯著的表達(dá)變化。

在接種后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，和在敏感品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在抗性品種中顯著下調(diào)表達(dá)；、和在抗性品種中顯著上調(diào)表達(dá)，在敏感品種中表達(dá)量無變化或顯著下調(diào)。結(jié)合上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這5個(gè)基因在各組織尤其是葉片中是有一定表達(dá)量的（圖7-A、7-C），推測、、、和為黃瓜抗白粉病的R基因，、和表達(dá)量增加可誘發(fā)抗病黃瓜品種的抗白粉病反應(yīng)，而和表達(dá)量減少可誘發(fā)抗病黃瓜品種的抗白粉病反應(yīng)。

3 討論

3.1 CsCNL家族成員結(jié)構(gòu)分析

植物抗病基因（R基因）識別引發(fā)的植物抗性反應(yīng)還包括防御基因表達(dá)增加、活性氧的產(chǎn)生、水楊酸的產(chǎn)生或釋放、離子通量等因素[33]。NBS-LRR蛋白可以直接或間接識別病原體的存在，對多種病原體的特異性識別需要大量R基因的活性。本研究中通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)黃瓜中CC型NBS-LRR家族包含17個(gè)基因，分布在除1號外的6條染色體上。物種內(nèi)共線性分析表明，17個(gè)成員之間不存在片段重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)的現(xiàn)象。CsCNL蛋白均含有該家族的保守結(jié)構(gòu)域CC、NBS和LRR，motif數(shù)目為6—15個(gè)不等，這些motif在基因家族中的分布表現(xiàn)出比較相似的模式（圖2）。不同物種蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析和物種間共線性分析均表明CNL基因家族成員在葫蘆科植物之間具有較高的結(jié)構(gòu)和功能相似性（圖3、圖4）。通過同源建模對CsCNL蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，除Csa7G425930由-螺旋組成外，其余CsCNL蛋白均具有相似的三維結(jié)構(gòu)，上半部分由-螺旋、-折疊和不規(guī)則卷曲組成，下半部分由3—4個(gè)-螺旋組成，內(nèi)部形成疏水腔，該疏水空腔在體外可以結(jié)合或轉(zhuǎn)移脂肪酸、脂肪?；?CoA、磷脂和糖脂等疏水分子[34-35]。這些蛋白質(zhì)的建模三維結(jié)構(gòu)為研究其生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。

3.2 CsCNL家族基因可能參與黃瓜霜霉病和白粉病防御過程

啟動子是位于基因5′端上游的一段負(fù)責(zé)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列，其中順式作用元件的類型表明基因的潛在功能。與植物抗病相關(guān)基因的啟動子區(qū)含有能針對病原菌脅迫作出應(yīng)答的順式作用元件，這些順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)抗病基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高植物的抗病性。CsCNL家族基因的啟動子中存在多種抗病相關(guān)的順式作用元件以及植物激素響應(yīng)元件，其中，ERE元件能夠調(diào)控真菌誘導(dǎo)表達(dá)；W-box是與植物病原誘導(dǎo)相關(guān)的SA響應(yīng)元件[36-37]；GT1-motif的表達(dá)由病原體誘導(dǎo)，部分與GT-1-like轉(zhuǎn)錄因子相互作用，GT-1-like轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合病程相關(guān)（PR）PR-1a啟動子，影響SA誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平[38]。G-box是能夠應(yīng)答一些環(huán)境因子（如脫落酸、光照、紫外線、傷害以及病原物信號）的順式作用元件；as-1元件是參與信號（包括SA、植物生長激素、茉莉酮酸酯和過氧化氫）應(yīng)答的植物防御反應(yīng)元件，G-box和as-1元件都能與bZIP蛋白結(jié)合[39]。JA能誘導(dǎo)許多植物產(chǎn)生防衛(wèi)應(yīng)答反應(yīng)，合成一些與防衛(wèi)相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物，能夠調(diào)控JA誘導(dǎo)表達(dá)的JERE元件和調(diào)控真菌誘導(dǎo)表達(dá)的S-box及P-box相似，存在于少數(shù)啟動子中。P-box最初是在歐芹啟動子上發(fā)現(xiàn)的受真菌激發(fā)子誘導(dǎo)的DNA-蛋白互作位點(diǎn)，可與MYB類蛋白BPF-1結(jié)合[40]。絕大多數(shù)啟動子中含有響應(yīng)JA途徑的TGACG-motif和響應(yīng)免疫防御反應(yīng)的TC-rich repeats。JA途徑主要響應(yīng)死體型病原菌的侵入，而SA途徑主要響應(yīng)活體營養(yǎng)性病原菌的侵入[41-42]。上述順式作用元件通過與轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)抗病基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高植物的抗病性。

圖9 白粉病菌處理后CsCNL的實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

目前已有越來越多的在病害防御過程中的功能被報(bào)道，例如小麥葉銹病[25]、小麥條銹病[28]、稻瘟病[26]、小麥白粉病[27]。在本研究中，如圖8和圖9所示，在黃瓜霜霉病菌和白粉病菌侵染過程中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，表明在抵御黃瓜霜霉病和白粉病過程中發(fā)揮著重要作用，其具體作用取決于病原體種類和接種時(shí)間。其中，推測、、和這4個(gè)基因?yàn)辄S瓜抗霜霉病的R基因，、和表達(dá)量增加，表達(dá)量減少可誘發(fā)抗病黃瓜品種的霜霉病抗病反應(yīng)。而、、、和這5個(gè)基因?yàn)辄S瓜抗白粉病的R基因，、和表達(dá)量增加，和表達(dá)量減少可誘發(fā)抗病黃瓜品種的白粉病抗病反應(yīng)。目前已有研究證明控制黃瓜霜霉病和白粉病的QTL共定位，認(rèn)為霜霉病和白粉病抗性具有顯著的相關(guān)性[43-44]。在霜霉病菌和白粉病菌誘導(dǎo)下，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)顯示出相似的表達(dá)趨勢，表明在參與霜霉病和白粉病的防御反應(yīng)過程中可能具有相似的作用機(jī)制，表達(dá)量的增加能同時(shí)誘發(fā)抗病黃瓜品種的霜霉病和白粉病抗病反應(yīng)。

4 結(jié)論

從黃瓜全基因組中鑒定出17個(gè)CsCNL家族成員，其在葫蘆科植物之間具有較高的結(jié)構(gòu)和功能相似性，家族成員具有組織表達(dá)特異性并且多數(shù)基因能夠響應(yīng)霜霉病菌和白粉病菌的脅迫，表明在抵御黃瓜霜霉病和白粉病過程中發(fā)揮著重要作用。

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Genome-Wide Identification and Analysis of CC-NBS-LRR Family in Response to Downy Mildew and Powdery Mildew in

KANG Chen, ZHAO XueFang, LI YaDong, TIAN ZheJuan, WANG Peng, WU ZhiMing

Institute of Cash Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051

【Objective】The bioinformatics and expression pattern analysis of the CC-NBS-LRR (CNL) gene family of the whole cucumber () genome was carried out to provide a reference for further study of the functions of the CsCNL gene family in growth, development and disease stress response.【Method】Taking thegene sequence ofas the reference, the genome of cucumber ‘9930’ was searched by local perl language and Pfam software, and the members of CsCNL gene family were identified. CsCNL gene family was analyzed bysome bioinformatics tools, such as ExPASY, GSDS2.0, MEGA, MEME, Tbtools and Mev. Transcriptome data, inoculating with downy mildew and powdery mildew pathogens (and) and real-time quantitative PCR (qRT-PCR) were used to evaluate the expression of the genes.【Result】A total of 17genes were identified from cucumber genome.genes are distributed on 6 chromosomes except chromosome 1. The encoded proteins are similar in structure to other plant CNLs. All CsCNL proteins contain conserved domains of CC, NBS and LRR. The amino acid sequence size ranged from 197 to 1 148 aa, with a molecular weight (MW) of 22.6 to 131.3 kD, and a protein isoelectric point (PI) ranged from 5.71 to 8.38.Collinear analysis showed that there were no segmental duplication and tandem duplication genes, and the multi-species phylogenetic relationship showed that CNL gene family members had high structural and functional similarities among Cucurbitaceae plants. There were many cis-acting elements related to disease resistance in the promoter ofgenes. The expression ofgenes was tissue-specific.At 2 d and 5 d after inoculation with,,andwere all significantly up-regulated in resistant variety,was down-regulated in resistant variety, and significantly different in susceptible variety. At 2 d and 5 d afterinoculation,andwere significantly up-regulated in susceptible variety and significantly down-regulated in resistant variety.,andwere significantly up-regulated in resistant variety, while unchanged or significantly down-regulated in susceptible variety.【Conclusion】CsCNL gene family has specific expression pattern in different tissues, and most of thegenes were induced byand. It is speculated that the increased expression of,and, and the decreased expression ofcan induce downy mildew resistance in resistant cucumber varieties. The increased expression of,and, and the decreased expression ofandcan induce the resistance to powdery mildew in resistant cucumber varieties, while the increased expression ofcan simultaneously induce disease resistance to downy mildew and powdery mildew in resistant cucumber varieties.

cucumber (); CC-NBS-LRR (CNL); downy mildew; powdery mildew; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.19.006

2022-04-28；

2022-05-29

國家自然科學(xué)基金（32172588）、河北省省級科技計(jì)劃資助（19226323D）、河北省農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新人才隊(duì)伍建設(shè)項(xiàng)目（C21R0801）、河北省農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新專項(xiàng)（2022KJCXZX-JZS-1）

康忱，E-mail：kangchen19910228@163.com。通信作者吳志明，E-mail：zhiming71@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）