何正艷，馮 果，鄭傳奇，李 瑋，劉 文，朱光林，王文靜，蘇紅梅，宋學(xué)麗，張 菊（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550025；2.國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025）

了哥王始載于《嶺南采藥錄》，來源于瑞香科植物南嶺蕘花Wikstroemia indica（Linn.）C. A. Mey.的根及根皮，是貴州地區(qū)常用苗藥之一。了哥王味苦、微辛，性寒，有毒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛的功效，常用于瘰疬、癰腫、跌打損傷、急性扁桃體炎、慢性支氣管炎、乳腺癌、惡性淋巴癌、肺癌等疾病的臨床治療[1-5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，了哥王具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳袪痰等藥理作用[6-7]。該藥療效確切，臨床應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力較大，但因毒性作用較強(qiáng)，使得其進(jìn)一步開發(fā)和利用受限?！渡菟幮詡湟贰逗纤幬镏尽分芯辛烁缤酢按蠖尽被颉坝卸尽钡亩拘杂涊d[8-9]。目前，國內(nèi)外有關(guān)了哥王的毒性研究大多基于大鼠和小鼠模型[10-12]，具有成本高、周期長、不便于觀察等缺點(diǎn)。斑馬魚作為一種新的模式生物，其幼魚及胚胎通體透明，且繁殖率高、生長發(fā)育周期短，加之其與人類基因的相似度高達(dá)87%，故在篩選和評(píng)價(jià)藥物毒性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[13]?；诖耍疚臄M利用斑馬魚模型，探討了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎、斑馬魚的毒性作用，以期為其毒性的深入研究提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有MULTISKAN SKY 1530型全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、SMZ18型體視熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、CKX53型倒置相差顯微鏡（上海蠻吉光電科技有限公司）、PCO-1500型立體顯微鏡及成像系統(tǒng)（武漢鑫力鈞生物科技有限公司）、ESENAWS1型斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展有限公司）、SLI700型生化培養(yǎng)箱（天津信睿生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

了哥王藥材購自廣西壯族自治區(qū)玉林市玉州區(qū)玉林銀豐國際中藥港，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李瑋教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物了哥王W. indica（Linn.）C.A.Mey.的干燥根或根皮。

吖啶橙（批號(hào)325E043）、油紅O染液（批號(hào)20190910）、PBS（批號(hào)20190517）、DMSO（批號(hào)821D0311）均購自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛（批號(hào)190620）購自上海尚寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)均為20191118）均購自南京建成生物工程研究所；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4、NaHCO3、MgSO4、CaCl2等試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

AB系野生型斑馬魚，雌雄各半，購自國家斑馬魚資源中心，4～6 月齡（繁育、培養(yǎng)方法參照The Zebrafish Book），其相關(guān)質(zhì)量控制項(xiàng)（微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、寄生蟲學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)、遺傳質(zhì)量控制、病理診斷、配合飼料、環(huán)境條件）均符合北京市實(shí)驗(yàn)用魚質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)。所有斑馬魚均飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院斑馬魚飼養(yǎng)中心的養(yǎng)殖房[光照14 h、黑暗10 h 交替，水溫（28.0±0.5）℃，水pH6.8～7.5，室溫26 ℃]內(nèi)。

2 方法

2.1 斑馬魚胚胎培養(yǎng)液的配制

按照The Zebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)配制斑馬魚胚胎培養(yǎng)液，其中NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4、NaHCO3的濃度分別為0.14、5.40、0.25、0.44、1.30、1.00、4.20 mol/L。

2.2 了哥王提取物的制備

參照課題組前期研究方法制備了哥王提取物并進(jìn)行相關(guān)分析：取了哥王藥材粗粉5 kg，以14 倍量的70%乙醇按5 mL/（min·kg）的速度進(jìn)行滲漉提??；收集滲漉提取液，回收乙醇至提取液無醇味，采用低壓真空濃縮干燥法（溫度60 ℃，真空度0.07～0.08 MPa）進(jìn)行濃縮、干燥后，粉碎成細(xì)粉，得了哥王提取物粉末（傘形花內(nèi)酯和西瑞香素的含量分別為0.067、2.263 mg/g，浸膏得率為10.08%，每1 g了哥王提取物相當(dāng)于生藥9.92 g）[14]。

2.3 了哥王提取物藥液的配制

精密稱取“2.2”項(xiàng)下了哥王提取物粉末適量，溶于一定量的DMSO 中，渦旋溶解后，再加入胚胎培養(yǎng)液配制成1 mg/mL的母液，于實(shí)驗(yàn)前加胚胎培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.4 了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

于實(shí)驗(yàn)前一天晚上，將健康成年的斑馬魚按雌雄比例1∶1放入產(chǎn)卵缸中，使其自然受精產(chǎn)卵。隨機(jī)選取受精后6～8 h（6-8 hours post fertilization，6～8 hpf）、發(fā)育正常且無畸形的斑馬魚胚胎，轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔20 枚胚胎），并加入適量胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為（28.0±0.5）℃。

2.4.1 藥物暴露質(zhì)量濃度的選取與藥液的配制 設(shè)置暴露質(zhì)量濃度為10、20、40 μg/mL（質(zhì)量濃度參考課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），并按照“2.3”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為10、20、40 μg/mL的了哥王提取物藥液。

2.4.2 暴露處理 設(shè)置了哥王提取物10、20、40 μg/mL組和空白組（每孔20 枚胚胎，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔），緩慢吸出各孔中的胚胎培養(yǎng)液，各藥物組分別按4 mL/孔加入“2.4.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的了哥王提取物藥液進(jìn)行暴露，空白組加入等體積的胚胎培養(yǎng)液和等量的DMSO作為對(duì)照。加蓋標(biāo)記后，將培養(yǎng)板置于生化培養(yǎng)箱中孵育72 h，每24 h更換藥液1次。

2.4.3 斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)、心率及其畸形率、死亡率的測(cè)定 暴露24 h后，使用立體顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察各組斑馬魚1 min 內(nèi)的胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)（每組選取10枚胚胎）；暴露48 h后，使用立體顯微鏡及成像系統(tǒng)觀察各組斑馬魚10 s 內(nèi)的胚胎心率（每組選取10 枚胚胎）；暴露72 h后，計(jì)算各組斑馬魚胚胎的畸形率和死亡率：畸形率（%）＝某一時(shí)間點(diǎn)幼魚的畸形數(shù)/某一時(shí)間點(diǎn)全部存活的幼魚數(shù)×100%，死亡率（%）＝死亡胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。

2.5 了哥王提取物對(duì)斑馬魚的急性毒性作用

參照文獻(xiàn)方法[15]繁育斑馬魚，于實(shí)驗(yàn)前一天晚上，將健康成年的斑馬魚按雌雄比例1∶1放入產(chǎn)卵缸中，使其自然受精。取受精卵，經(jīng)清洗消毒后放入生化培養(yǎng)箱中孵育96 h。隨機(jī)選取96 hpf、發(fā)育正常且無畸形的斑馬魚，轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔20尾斑馬魚），并加入適量的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度為（28.0±0.5）℃。

2.5.1 藥物暴露質(zhì)量濃度的選取與藥液的配制 根據(jù)課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置10、20、27、37、51、72、90、100 μg/mL藥物暴露濃度組，并按照“2.3”項(xiàng)下方法配制質(zhì)量濃度分別為10、20、27、37、51、72、90、100 μg/mL 的了哥王提取物藥液。

2.5.2 暴露處理 慢慢吸出各孔中的胚胎培養(yǎng)液，分別加入“2.5.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度的了哥王提取物藥液進(jìn)行暴露，其余操作同“2.4.2”項(xiàng)下。

2.5.3 半數(shù)致死濃度的計(jì)算 當(dāng)暴露24、48、72 h時(shí)，統(tǒng)計(jì)各個(gè)藥物暴露濃度組死亡的斑馬魚數(shù)量，按“2.4.3”項(xiàng)下方法計(jì)算死亡率，并運(yùn)用SPSS 26.0 軟件繪制其急性毒性線性回歸方程并計(jì)算半數(shù)致死濃度（LC50）。

2.6 了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝臟的毒性作用

2.6.1 藥物暴露質(zhì)量濃度的選取和暴露處理 根據(jù)“2.5”項(xiàng)下急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置藥物低、中、高質(zhì)量濃度組，并設(shè)置含等體積胚胎培養(yǎng)液的空白組作為對(duì)照（每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔）。隨機(jī)選取96 hpf、發(fā)育正常且無畸形的斑馬魚，轉(zhuǎn)移至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔20尾斑馬魚）。經(jīng)培養(yǎng)后，各藥物組分別按4 mL/孔加入不同質(zhì)量濃度的了哥王提取物藥液，空白組加入等體積的胚胎培養(yǎng)液和等量的DMSO，置于（28.0±0.5）℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.6.2 斑馬魚肝臟表型的觀察 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚進(jìn)行表型觀察：將斑馬魚用胚胎培養(yǎng)液清洗3次，以側(cè)躺姿態(tài)固定于涂布有3%甲基纖維素凝膠的載玻片上，在體視熒光顯微鏡下依次觀察各組斑馬魚的肝臟表型變化并拍照記錄。

2.6.3 斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡的評(píng)價(jià) 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚進(jìn)行細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)：將各孔斑馬魚用胚胎培養(yǎng)液清洗后，于避光條件下按2 mL/孔加入2.5 μg/mL吖啶橙染色液（以胚胎培養(yǎng)液配制[16]）進(jìn)行染色；染色完成后，將斑馬魚用PBS反復(fù)清洗，以側(cè)躺姿態(tài)固定于涂布有3%甲基纖維素凝膠的載玻片上，在體視熒光顯微鏡下觀察斑馬魚肝臟細(xì)胞的凋亡情況，并拍照記錄。

2.6.4 斑馬魚肝臟脂質(zhì)沉積的評(píng)價(jià) 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚進(jìn)行脂質(zhì)沉積評(píng)價(jià)：將各孔斑馬魚用胚胎培養(yǎng)液清洗，再以4%多聚甲醛固定過夜，依次用PBS和漂白液清洗3次；分別用85%、100%丙二醇脫水，用0.5%油紅O染液染色3 h；染色完成后，依次用100%、85%丙二醇脫色30 min，用PBS清洗后于顯微鏡下觀察油紅O染液的染色情況，以評(píng)價(jià)斑馬魚的肝臟脂質(zhì)沉積情況。

2.6.5 斑馬魚ALT、AST、LDH 活性的測(cè)定 按“2.6.1”項(xiàng)下方法暴露處理后，吸去藥液，每組選取10尾幼魚進(jìn)行ALT、AST、LDH活性測(cè)定：將各孔斑馬魚用生理鹽水清洗，以濾紙吸干水分后稱定質(zhì)量；加入9倍量的生理鹽水，于冰浴中充分研磨，所得勻漿產(chǎn)物于4 ℃下以3 500 r/min 離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組上清液中ALT、AST、LDH活性。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（方差不齊）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響的測(cè)定結(jié)果

當(dāng)斑馬魚的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)未發(fā)育完全時(shí)，會(huì)不受控制地發(fā)生胚胎自主抽動(dòng)；隨著運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的逐漸發(fā)育，這種自主抽動(dòng)的次數(shù)將會(huì)減少[17]。與空白組比較，各藥物組斑馬魚胚胎的自主抽動(dòng)次數(shù)均顯著增加，了哥王提取物40 μg/mL組斑馬魚胚胎的心率顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)、胚胎心率、畸形率、死亡率影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表1 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎自主抽動(dòng)次數(shù)、胚胎心率、畸形率、死亡率影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05

畸形率/%組別空白組了哥王提取物10 μg/mL組了哥王提取物20 μg/mL組了哥王提取物40 μg/mL組1 min內(nèi)自主抽動(dòng)/次4.28±0.38 5.37±0.32a 8.28±0.45a 8.78±0.15a暴露48 h后10 s內(nèi)胚胎心率/次21.60±0.87 20.80±0.44 20.60±0.54 19.20±0.92a 0 0 31.25±6.25a 99.00±1.00a死亡率/%0 7.66±2.51a 28.33±2.88a 76.66±2.88a

空白組斑馬魚胚胎發(fā)育正常，未見發(fā)育畸形和死亡。與空白組比較，了哥王提取物10 μg/mL 組斑馬魚的胚胎形態(tài)相似且無明顯變化，了哥王提取物20、40 μg/mL 組斑馬魚胚胎可見畸形（表現(xiàn)為心包腫大、卵黃囊畸形、體長變短等）；各藥物組斑馬魚胚胎畸形率（了哥王提取物10 μg/mL 組除外）和死亡率均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.2 了哥王提取物對(duì)斑馬魚急性毒性作用的測(cè)定結(jié)果

空白組斑馬魚發(fā)育正常，72 h 內(nèi)無死亡；藥物暴露24、48、72 h 后，LC50分別為39.850、28.300、21.490 μg/mL。24、48、72 h的線性回歸方程（式中，y為死亡率，x為藥物質(zhì)量濃度）和LC50見表2。根據(jù)LC50檢測(cè)結(jié)果，本文以27、37、51 μg/mL 作為了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)了哥王提取物對(duì)斑馬魚急性毒性作用的線性回歸方程和LC50

3.3 了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝臟毒性影響的測(cè)定結(jié)果

3.3.1 肝臟表型 空白組斑馬魚肝臟表型正常，肝臟形態(tài)完整、清晰，卵黃囊基本吸收完全，不存在肝臟變性。與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚的肝臟區(qū)域均有不同程度的透明度降低、形態(tài)膨大現(xiàn)象，且有隨藥物暴露質(zhì)量濃度增加而肝臟區(qū)域逐漸模糊的趨勢(shì)；當(dāng)藥物暴露質(zhì)量濃度為51 μg/mL時(shí)，斑馬魚卵黃囊吸收不完全，且部分魚體肝臟輪廓模糊。結(jié)果見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝臟表型的影響（×3.2）

3.3.2 肝臟區(qū)域細(xì)胞凋亡情況 吖啶橙染色結(jié)果顯示，空白組斑馬魚肝臟區(qū)域未出現(xiàn)黃綠色亮點(diǎn)，提示空白組斑馬魚肝臟基本無細(xì)胞凋亡；而了哥王提取物中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚的肝臟區(qū)域均可見致密透亮的黃綠色亮點(diǎn)，且有藥物暴露質(zhì)量濃度越高、熒光強(qiáng)度越強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)果見圖2。

3.3.3 肝臟脂質(zhì)沉積 經(jīng)油紅O染液染色后，空白組斑馬魚肝臟區(qū)域橘紅色較淺；而了哥王提取物高質(zhì)量濃度組斑馬魚肝臟區(qū)域的顏色明顯加深，提示其肝臟存在脂質(zhì)沉積。結(jié)果見圖3（了哥王提取物低、中質(zhì)量濃度組經(jīng)油O染液染色后，與空白組比較無明顯差異，故圖略）。

3.3.4 肝組織中ALT、AST、LDH活性 與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚肝組織中ALT、AST、LDH活性均顯著升高（P＜0.05），且有隨藥物暴露質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)。結(jié)果見表3。

圖2 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝臟區(qū)域細(xì)胞凋亡的影響（吖啶橙染色，×3.2）

圖3 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝臟脂質(zhì)沉積的影響（油紅O染色，×3.2）

表3 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝組織中ALT、AST、LDH 活性影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表3 不同質(zhì)量濃度了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝組織中ALT、AST、LDH 活性影響的測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.05

組別空白組了哥王提取物低質(zhì)量濃度組了哥王提取物中質(zhì)量濃度組了哥王提取物高質(zhì)量濃度組ALT/（U/g prot）14.98±3.11 32.51±5.45a 36.17±4.73a 49.89±4.72a AST/（U/g prot）37.28±1.98 55.41±3.78a 66.17±4.68a 90.56±4.60a LDH/（U/g prot）37.67±3.37 48.40±2.47a 52.31±3.86a 71.18±6.75a

4 討論

了哥王作為一種民族藥，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，但其毒性限制了該藥的后續(xù)開發(fā)及利用。有研究表明，了哥王的不同提取物對(duì)正常大鼠具有明顯的肝毒性，其中了哥王乙醇提取物的毒性作用較為明顯[10]。斑馬魚的每個(gè)發(fā)育時(shí)間段都有不同的生理生化指標(biāo)，且易于體外觀察，適用于藥物毒性評(píng)價(jià)[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用斑馬魚模型，對(duì)了哥王提取物的毒性作用進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

為探究了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性作用，本研究以6～8 hpf 斑馬魚胚胎為對(duì)象，記錄了其1 min 內(nèi)自主抽動(dòng)次數(shù)、10 s 內(nèi)心率及畸形、死亡發(fā)生情況。結(jié)果表明，與空白組比較，經(jīng)了哥王提取物暴露后，斑馬魚胚胎在發(fā)育過程中的自主抽動(dòng)次數(shù)增加、心率減慢，且出現(xiàn)心包腫大、卵黃囊腫大、體長變短等畸形現(xiàn)象和死亡；同時(shí)，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，斑馬魚胚胎畸形和死亡的現(xiàn)象逐漸明顯，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[17]，提示了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎具有一定的致畸和致死作用。

為探究了哥王提取物對(duì)斑馬魚肝臟的毒性作用，本研究在急性毒性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用顯微鏡觀察了低、中、高質(zhì)量濃度藥物對(duì)斑馬魚肝臟表型及相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚的肝臟均有不同程度的透明度降低、形態(tài)膨大現(xiàn)象，且有隨藥物暴露質(zhì)量濃度增加而肝臟區(qū)域逐漸模糊的趨勢(shì)。吖啶橙染色結(jié)果顯示，與空白組比較，中、高質(zhì)量濃度的了哥王提取物均能夠誘導(dǎo)斑馬魚肝臟細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。油紅O染色結(jié)果顯示，與空白組相比較，了哥王提取物高質(zhì)量濃度組斑馬魚的肝臟中存在脂質(zhì)沉積。這提示該提取物可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡，并可促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積。

ALT、AST、LDH 常用以評(píng)價(jià)肝臟受到外源性物質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，其活性會(huì)升高[18]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)了斑馬魚中ALT、AST、LDH 的活性，結(jié)果表明，與空白組比較，了哥王提取物低、中、高質(zhì)量濃度組斑馬魚肝組織中ALT、AST、LDH活性均顯著升高，提示該提取物對(duì)斑馬魚肝臟具有損傷作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，連續(xù)給予了哥王提取物后，大鼠血清中ALT、AST水平顯著升高，其肝細(xì)胞凋亡增加，從而造成肝臟損傷[10，19]，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，了哥王提取物對(duì)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性表現(xiàn)為自主抽動(dòng)次數(shù)增加，心率減慢，畸形率、死亡率升高等；同時(shí)，了哥王提取物可通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積而誘發(fā)肝臟損傷。