劉銳，李子衿，費安奎，張譯文，王樂宇，李克儉，劉智

（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer′s disease，AD），又稱老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為記憶和認(rèn)知功能障礙、行為及人格異常改變，是最常見的癡呆類型?，F(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國65歲以上老年人AD發(fā)病率為6.25‰［1］，患病率為5.14%～7.30%［2］。隨著人口老齡化進(jìn)程的加速，其發(fā)病率還將不斷增加。但迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，使得其防治成為世界性的難題。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)普遍認(rèn)為是一種多因素所致疾病，其中，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是AD病程發(fā)展過程中的早期重要事件［3-4］，其在AD中的作用受到廣泛關(guān)注，而具體機(jī)制仍有待深入研究。

近年來，IR介導(dǎo)的代謝異常在AD病理損害機(jī)制中的作用受到越來越多的關(guān)注，AD逐漸被認(rèn)為是一種神經(jīng)代謝性疾病，也被稱為3型糖尿?。?］。因此，從代謝角度研究和認(rèn)識AD將為其發(fā)病機(jī)制研究提供新的線索。但現(xiàn)有研究主要關(guān)注糖、脂代謝異常。值得注意的是，除了調(diào)節(jié)糖、脂代謝，胰島素信號通路也是體內(nèi)氨基酸代謝的重要調(diào)控者。腦是氨基酸利用的重要靶器官，體內(nèi)氨基酸通過參與神經(jīng)遞質(zhì)的生成、能量代謝、神經(jīng)信號傳導(dǎo)等對維持正常的神經(jīng)功能至關(guān)重要［6］。目前，關(guān)于AD發(fā)展過程中IR對氨基酸代謝影響的研究非常有限。因此，本研究擬以對AD易感的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，通過高脂膳食喂養(yǎng)建立IR模型，觀察IR對APP/PS1 AD模型小鼠氨基酸穩(wěn)態(tài)的影響，為進(jìn)一步從代謝角度研究和認(rèn)識AD提供線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Aβ40/Aβ42 ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）、甲醇（美國Thermo Fisher公司）、乙腈（美國Thermo Fisher公司）、異丙醇（美國Thermo Fisher公司），超高液相色譜儀（美國Waters公司）、Xevo TQ-S質(zhì)譜儀（美國Waters公司）。

1.2 實驗動物分組及飼養(yǎng)

20只SPF級雄性3月齡APP/PS1小鼠，購買于北京華阜康生物有限公司，飼養(yǎng)于江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，環(huán)境溫度（20±5）℃，相對濕度（50±10）%，明暗交替周期為12 h，小鼠自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為對照組（normal diet，ND）和高脂組（high-fat diet，HFD），分別喂飼普通飼料和高脂飼料。實驗飼料均由北京華阜康生物有限公司提供，普通飼料和高脂飼料分別參照Research Diet公司D12450B和D12451配方配制。喂養(yǎng)期間每日記錄小鼠進(jìn)食量，每周監(jiān)測并記錄體重。實驗20周后，進(jìn)行胰島素耐量（insulin tolerance testing，ITT）和葡萄糖耐量試驗（glucose tolerance testing，GTT）并分別計算血糖曲線下面積，評價胰島素敏感性。實驗結(jié)束后，斷頭取血，留取血清和海馬組織，經(jīng)液氮速凍后-80℃保存，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)測定。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 GTT和ITT實驗20周末，小鼠禁食10 h，尾靜脈穿刺取血，丟棄第一滴血，血糖儀測定空腹血糖（G0），2 g/kg.bw的葡萄糖溶液（w/v 50%）灌胃或腹腔注射0.75 IU/kg.bw胰島素溶液（200 IU/L），分別測定和記錄各組干預(yù)后15 min（G15）、30 min（G30）、60 min（G60）和120 min（G120）的血糖值，計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC），計算公式為：AUC=（G0+G120）/2+G15+G30+G60。

1.3.2 ELISA法檢測海馬淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42含量取各組小鼠海馬組織，勻漿后取上清，參照試劑盒說明書ELISA法測定各組Aβ40和Aβ42水平。

1.3.3 超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測血清氨基酸水平每只小鼠各取25 μL血清加入96孔板，加入100 μL含內(nèi)標(biāo)物的冰冷甲醇，劇烈渦旋5 min，4000 g離心30 min。取30 μL上清液轉(zhuǎn)移至干凈的96孔板中，每孔加入20 μL新鮮制備的衍生劑，密封后在30℃衍生化60 min。結(jié)束后，加入350 μL冰冷的50%甲醇溶液稀釋樣品，-20℃儲存20 min后離心，取上清轉(zhuǎn)移至新的96孔板，每孔加入15 μL內(nèi)標(biāo)，將板密封進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

1.3.4 透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)小鼠處死后低溫迅速分離海馬組織，置于有預(yù)冷固定液的蠟板上，將其切割為1 mm×1 mm×1 mm小塊，放入2.5%戊二醛溶液中固定4 h后，0.1 mol/L磷酸緩沖液清洗3次，鋨酸固定，梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸泡、包埋、聚合，超薄切片機(jī)切片，鈾鉛雙染色，透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)差（xˉ±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本的t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料組間比較采用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重和進(jìn)食量

高脂飼料喂養(yǎng)組小鼠每天的能量攝入量高于正常飼料喂養(yǎng)組（P＜0.05）（圖1A），從第9周開始高脂組小鼠體重顯著高于正常飼料喂養(yǎng)組（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 各組小鼠體重和能量攝入量Fig.1 Body weight and calorie intake of mice in each group

2.2 胰島素敏感性評價

高脂飼料喂養(yǎng)20周，分別進(jìn)行ITT和GTT試驗。ITT試驗結(jié)果（圖2A、圖2B）顯示，HFD組小鼠0、15、30、60 min血糖值及AUC均顯著高于ND組（P＜0.05）。GTT試驗實現(xiàn)結(jié)果（圖2C、圖2D）顯 示，HFD組 小鼠0、15、30、60和120 min血糖值 及AUC均 顯 著高于ND組（P＜0.05）。結(jié)果表明HFD組小鼠胰島素敏感性降低，出現(xiàn)胰島素抵抗。

圖2 各組小鼠胰島素敏感性比較Fig.2 Comparison of insulin sensitivity of mice in each group

2.3 高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗APP/PS1小鼠海馬淀粉樣蛋白Aβ生成及超微病理結(jié)構(gòu)變化

細(xì)胞外由β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）構(gòu)成的老年斑沉積是AD典型的神經(jīng)病理學(xué)變化。高脂喂養(yǎng)20周，HFD組小鼠海馬Aβ40和Aβ42含量均顯著高于ND組（P＜0.05）（圖3A）；海馬CA1區(qū)超微病理結(jié)果（圖3B）顯示，與ND組小鼠海馬結(jié)構(gòu)相比，HFD組小鼠海馬突觸數(shù)量減少，突觸前膜、后膜、突觸小泡結(jié)構(gòu)不清、模糊，部分軸突和樹突失去膜性結(jié)構(gòu)。

圖3 高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗APP/PS1小鼠海馬淀粉樣蛋白Aβ生成及超微病理結(jié)構(gòu)變化Fig.3 Effects of high-fat diet-induced insulin resistance on Aβ production and ultrastructure in the hippocampus of APP/PSI mice

2.4 高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗APP/PS1小鼠血清氨基酸水平的變化

20種氨基酸檢測結(jié)果見表1。與對照組小鼠相比，高脂組血清亮氨酸、異亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸和絲氨酸水平均顯著降低（P＜0.05）。

表1 對照組和高脂組血清中20種氨基酸的含量 /（μmol·L-1）Tab.120 kinds of serum amino acids concentration in ND and HFD-fed mice

3 討論

胰島素以及相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路異常與AD的病理進(jìn)程有著密切的聯(lián)系［7-8］。研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)的IR加劇AD特征性病理改變和認(rèn)知功能障礙。本研究結(jié)果同樣顯示，高脂誘導(dǎo)的IR組APP/PS1小鼠海馬淀粉樣蛋白Aβ生成增加，海馬區(qū)域病理結(jié)構(gòu)破壞加重。

IR通過多種機(jī)制參與AD的發(fā)生［11］，近年來，IR引起的早期代謝異常受到廣泛關(guān)注，被認(rèn)為可能是導(dǎo)致AD病理改變的上游機(jī)制。胰島素及其信號通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)氨基酸水平的重要因素，而氨基酸的穩(wěn)態(tài)對維持正常神經(jīng)功能至關(guān)重要。氨基酸水平的異常可通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激水平、調(diào)節(jié)線粒體功能、影響神經(jīng)遞質(zhì)合成等導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙［5］。已有多個代謝組學(xué)研究先后報道AD動物模型及患者血和腦組織氨基酸水平的改變［12-13］，但研究結(jié)果不盡一致。本研究通過高脂膳食誘導(dǎo)IR，結(jié)果表明IR的APP/PS1小鼠空腹血清四種生糖氨基酸（半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸）及兩種支鏈氨基酸（亮氨酸和異亮氨酸）水平均顯著降低。研究表明，支鏈氨基酸可通過與芳香族氨基酸的競爭影響多巴胺、腎上腺素和5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的合成。此外，支鏈氨基酸（尤其是亮氨酸）也是氮的重要供體，參與調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的合成［14］。一項多個隊列研究的綜合分析結(jié)果表明，支鏈氨基酸水平與AD發(fā)病風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)［15］。絲氨酸是D-絲氨酸的前體，而D-絲氨酸是突觸可塑性所必需的N-甲基-D-天冬氨酸受體的協(xié)同激動劑，絲氨酸水平的降低與AD認(rèn)知功能降低有關(guān)［16］。谷氨酰胺是AD腦糖代謝受損時主要的替代能源之一［17］。半胱氨酸參與抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽的合成［18］。盡管上述氨基酸在腦組織中具有重要功能，但其水平的降低與IR引起的認(rèn)知功能損傷之間的因果關(guān)系以及相關(guān)機(jī)制仍有待深入研究。有研究認(rèn)為，AD患者由于腦內(nèi)胰島素受體表達(dá)水平下降，導(dǎo)致腦組織糖利用能力下降，能量代謝障礙。而由于神經(jīng)元缺乏脂肪酸β氧化的酶，一方面氨基酸可作為暫時性能量來源來彌補(bǔ)腦糖代謝的異常，補(bǔ)充大腦所需能量，而另一方面氨基酸代謝改變導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物增加具有神經(jīng)毒性［6］。

綜上所述，胰島素抵抗加劇AD病理改變，并伴有氨基酸水平的異常，但未來仍需要更多的研究來闡明兩者之間的因果關(guān)系和潛在機(jī)制，從而為AD的發(fā)病機(jī)制研究提供新的線索和思路。