劉青 彭紅艷 馬春霞 鐘舒紅 李軍 李常挺 白慧麗 石艷 尹楊燕 王樂平 李鳳生 劉朝干任浪濤 郭青海 董勝美 彭昊*廖玉英*

（1.貴陽市水產(chǎn)站，貴州貴陽 550081；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；3.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，廣西南寧 530004；4.湖南格美特生物科技有限公司，湖南岳陽 414000；5.四川亭江新材料股份有限公司，四川德陽 618412）

多重耐藥細菌的迅速蔓延使大眾對直接有效的抗菌藥物的需求不斷提高[1]，但隨之而來的在水產(chǎn)、畜牧生產(chǎn)中抗生素的濫用所產(chǎn)生的細菌抗藥性以及在畜禽及水產(chǎn)產(chǎn)品中的殘留，已成為動物和人類健康最大的威脅。自從農業(yè)農村部發(fā)布公告宣布抗生素2020年全面退出畜禽生產(chǎn)后，抗生素替代物的研究就變得日益迫切。擁有良好的抗菌、抗氧化、抗炎、抗腹瀉的藥理活性的單寧及其提取物，廣受大眾的青睞，在水產(chǎn)畜牧業(yè)上擁有非常大的潛力和市場前景。單寧（Tannin）是除木質素外含量最豐富的一類植物酚類化合物，根據(jù)單寧的物理性質和化學結構，可分為水解單寧（HT）和縮合單寧（CT）兩大類。廣泛存在于五倍子、栗木、茶、葡萄、檸條、堅木、百脈根、高粱和咖啡等植物中[2]。過去單寧一直被認為是一種影響動物營養(yǎng)物質消化利用的抗營養(yǎng)因子，近年來隨著對單寧的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加水解單寧酸有利于保護腸道形態(tài)完整，增加畜禽腸道有益菌豐度，降低潛在致病菌豐度，從而對畜禽生長起到促進作用，提高肉雞對營養(yǎng)物質的消化吸收，降低肉雞的料重比和死淘率，提高歐洲效益指數(shù)、腸道消化酶活性和乳酸桿菌數(shù)量，促進腸道發(fā)育并保護肉雞腸道健康[3-4]。此外，還有大量的研究表明，單寧具有很強的生物和藥理活性，能激活動物機體的免疫反應、提高抗氧化能力和抗應激能力、改善腸道內環(huán)境、營養(yǎng)物質利用率，對于動物的生產(chǎn)性能和健康狀況有很好的促進和改善作用，在一定的程度上有替代抗生素的潛力[5-7]。

隨著“無抗”時代的來臨，替抗產(chǎn)品的研究蜂擁而至。單寧雖有諸多優(yōu)勢，但不同來源植物單寧其益生效果亦有差異。目前國內外對單寧研究主要集中在單一產(chǎn)品，缺乏對多種單寧的比較研究。本研究采用體外共培養(yǎng)的方法，研究不同單寧分別對革蘭氏陽性菌（產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌）的抑菌和殺菌效果，為單寧產(chǎn)品的選擇以及其在飼料和動物養(yǎng)殖中的應用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用材料分別來源于以下8 種：五倍子（I）、栗木（II）、橡椀（Ⅲ）、塔拉（IV）、低單寧酸塔拉粉（塔拉經(jīng)單寧酸水解酶提取沒食子酸后副產(chǎn)品，V）、白堅木（VI）、荊樹皮（VII）、純沒食子酸（Ⅷ）。其中五倍子單寧（水解單寧酸含量45%）為湖南玖瑞公司產(chǎn)品，栗木單寧（總單寧75%，水解單寧酸含量28%）為意大利施華公司產(chǎn)品。塔拉單寧（水解單寧酸含量45%）由湖南格美特生物科技有限公司生產(chǎn)其余植物單寧（橡椀、白堅木、荊樹皮、低單寧酸塔拉粉）和沒食子酸由四川亭江新材料股份有限公司提供。水解單寧酸含量測定采用LY/T1642-2005 檢測方法，沒食子酸含量測定采用LY/T1644-2005 檢測方法。

1.2 試驗菌株

大腸桿菌標準株（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6583）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。產(chǎn)氣莢膜梭菌為廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存菌株。沙門氏菌（SM022）由美國杜克大學分子遺傳學和微生物學實驗室惠贈。

1.3 試驗方法

1.3.1 致病菌菌懸液和單寧產(chǎn)品混懸液的制備

致病菌菌懸液的制備：無菌操作臺里挑取單個大腸桿菌/金黃色葡萄球菌/沙門氏菌/產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落接種于10mL LB 液體培養(yǎng)基（產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于卵黃瓊脂培養(yǎng)基），37℃，150r/min 培養(yǎng)18h。4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

單寧產(chǎn)品母液的制備：按無菌操作規(guī)程，以滅菌普通LB 肉湯培養(yǎng)基為稀釋液，分別稱取2.56gⅠ～Ⅷ單寧產(chǎn)品于10mLLB 肉湯中，配制為256mg/mL 母液備用。

1.3.2 試驗分組

利用二倍稀釋法將Ⅰ～Ⅶ單寧產(chǎn)品母液依次稀釋為128、64、32、16 和8mg/mL 5 個不同濃度溶液,Ⅷ單寧產(chǎn)品母液稀釋為128、64、32、16、8、4、2 和1mg/mL 8 個濃度，混勻備用。試驗分為4 個大組，18 個小組，分別為空白組、陰性對照組、陽性對照組和試驗組。其中空白組為10mL 未添加任何單寧產(chǎn)品和細菌的LB 肉湯；陰性對照組為10mL 不同濃度Ⅰ～Ⅷ單寧產(chǎn)品溶液，未添加任何細菌；陽性對照組為10mL 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌懸液（細菌接種量為1%），未添加任何單寧產(chǎn)品；試驗組是在陰性對照組的基礎上分別添加100μL 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌菌液。所有試驗組于37℃，150r/min 培養(yǎng)18h，其中，空白組和陰性對照組劃線于LB 培養(yǎng)基（產(chǎn)氣莢膜梭菌接種于卵黃瓊脂培養(yǎng)基），37℃，培養(yǎng)18h 后觀察是否有菌落生長；陽性對照組和試驗組采用倍比稀釋法計數(shù)各組菌懸液活菌落數(shù)。每個稀釋度做3 個平行，最后活菌數(shù)濃度取平均值。對單寧的抑菌效果做出最終判定，以細菌生長明顯受到抑制的最低稀釋濃度為單原子的最小抑菌濃度，以無細菌生長的最低稀釋濃度為單原子的最小殺菌濃度。

2 結果與分析

2.1 陰性對照組混懸液劃線結果

將陰性對照組混懸液劃線于麥康凱培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)18h 后觀察無細菌生長，表明單寧酸系列材料本身為無菌產(chǎn)品或具有抑菌的作用。

2.2 不同來源的植物單寧和沒食子酸在不同濃度情況下對致病菌的抑菌效果

陽性對照組菌落計數(shù)結果：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌分別為1.08×108、4.60×108、2.10×108和6.90×108CFU/mL。

由表1 可知，五倍子來源單寧在32mg/mL 時即對大腸桿菌和沙門氏菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，64mg/mL 時對金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為128mg/mL 時對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出殺菌作用，256mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出殺菌作用。

表1 不同濃度來源單寧酸對致病菌抑菌試驗結果

栗木來源單寧在64mg/mL 時即對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為128mg/mL 時對大腸桿菌表現(xiàn)出殺菌作用，256mg/mL 時對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出殺菌作用。

橡椀來源單寧在16mg/mL 時即對大腸桿菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，32mg/mL 時對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為32mg/mL 時對大腸桿菌表現(xiàn)出殺菌作用，64mg/mL 時對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出殺菌作用，128mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出殺菌作用。

塔拉來源單寧在16mg/mL 時即對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，64mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為64mg/mL 時對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出殺菌作用，256mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出殺菌作用。

低單寧塔拉在16mg/mL 時即對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，32mg/mL 時對沙門氏菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，64mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為128mg/mL 時對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出殺菌作用，256mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出殺菌作用。

白堅木來源單寧在64mg/mL 時即對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，128mg/mL 時產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為256mg/mL 時對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出殺菌作用。

荊樹皮來源單寧在16mg/mL 時即對大腸桿菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，32mg/mL 時對沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，64mg/mL 時對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為256mg/mL 時對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出殺菌作用。

沒食子酸在2mg/mL 時即對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用，4mg/mL 時對沙門氏菌表現(xiàn)出明顯的抑菌作用；濃度為8mg/mL 時對大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出殺菌作用。

由表2 可知，與水解單寧（塔拉、栗木、五倍子、橡椀）和縮合單寧（白堅木、荊樹皮）相比，沒食子酸對于大腸桿菌、沙門氏菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌具有很強的抑菌作用，分別在濃度≥2、4 和2mg/mL 時表現(xiàn)出很好的抑菌效果，但是對于金黃色葡萄球菌卻未見抑菌效果。塔拉來源的單寧酸相較于其余6 種對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌作用，在濃度≥16mg/mL時便表現(xiàn)出很好的抑菌作用；白堅木來源的單寧酸相較于其余6 種來源的單寧酸對這4 種致病菌抑菌效果差，尤其在濃度≥128mg/mL 時對產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出抑菌效果。塔拉、五倍子以及橡椀來源的單寧酸的抑菌性能要強于栗木來源的單寧酸，如果比較五倍子和塔拉來源的單寧酸的抑菌和殺菌性能可以發(fā)現(xiàn)，二者對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌能力基本保持一致，但是塔拉來源的單寧酸對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌和殺菌作用明顯優(yōu)于五倍子來源的單寧酸。低單寧酸塔拉與塔拉單寧酸相比，二者的抑菌效果基本保持一致，這可能與低單寧酸塔拉中經(jīng)過單寧酸水解酶提取沒食子酸后，所含的奎寧酸有關。

表2 不同來源植物單寧和沒食子酸對致病菌的最小抑菌和殺菌濃度

3 討論

研究表明富含單寧的植物提取物具有很高的抗菌作用[8]，主要通過2 條途徑發(fā)揮抑菌作用：一是單寧酸與細菌細胞膜和細胞質功能蛋白之間的直接相互作用；二是單寧酸對細菌細胞代謝（如代謝酶、脂質和脂肪酸等）存在二次作用，引起細菌細胞代謝功能改變[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)塔拉來源的單寧酸在濃度為16mg/mL 是便對沙門氏菌表現(xiàn)出很好的抑菌效果，濃度為64mg/mL 時即達到殺菌效果。但栗木來源和白堅木來源的單寧酸在濃度為64mg/mL 時表現(xiàn)出抑菌效果，濃度為256mg/mL 時才出現(xiàn)殺菌效果。說明不同植物提取的水解單寧酸可能由于結構不同，抑菌效果也有所不同。ELizondo 等在研究對不同來源的單寧酸（白堅木、栗木或二者的組合）對健康動物和患病動物腸道中A、B、C、D、E 型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長的影響進行體外試驗時，發(fā)現(xiàn)栗木單寧酸的抑菌活性明顯優(yōu)于白堅木單寧酸[11]。也再一次驗證不同來源單寧抑菌效果也不同。

單寧對不同類型的細菌表現(xiàn)出不同的作用趨勢，革蘭氏陽性細菌比革蘭氏陰性細菌對單寧更敏感，而五倍子酸對各種革蘭氏陽性細菌的抑制的最低濃度大約是單寧酸的200 倍[12]。Belhaoues 等研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸對革蘭氏陽性菌的作用效果要好于革蘭氏陰性菌[13]。這可能是由于革蘭氏陽性菌沒有細胞壁，水解單寧酸更容易滲透，干擾細胞質膜，擾亂膜電位和主動運輸功能，進而抑制部分革蘭氏陽性菌的生長[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同植物單寧對4 株致病菌的抑菌作用都是2株革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌）弱于2 株革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌），這與前人研究略有區(qū)別。可能是因為分子質量大小不同，單寧酸對腸道細菌的抑制能力也不同，而且細菌的受抑制程度與細菌類型也有關系[15]。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)雖然不同植物單寧對4 種常見致病菌均有抑制作用，相對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用，對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑制效果略差。但隨著單寧濃度的升高，其抑菌效果也在不斷增加。因此，在后續(xù)應用中如需預防產(chǎn)氣莢膜梭菌的侵擾，不妨嘗試加大單寧使用濃度。

單寧酸來源廣，國外對單寧酸的研究多見于栗木中提取的單寧酸，在動物生產(chǎn)應用上效果顯著；國內主要研究傳統(tǒng)中草藥五倍子中提取的單寧酸，側重應用于醫(yī)學領域[16]。本研究發(fā)現(xiàn)塔拉來源單寧酸對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果都優(yōu)于以上兩者，這個結果對于以后實踐應用有很大的參考意義。相較于常見的五倍子單寧和栗木單寧，塔拉單寧的優(yōu)勢也很明顯。塔拉單寧水解產(chǎn)生沒食子酸和一定量奎寧酸，而五倍子單寧水解僅產(chǎn)生沒食子酸，栗木單寧水解僅產(chǎn)生逆沒食子酸；塔拉單寧中游離的沒食子酸（4%）是優(yōu)秀的抗氧化劑，而水解的奎寧酸具有收斂作用，是芳香族氨基酸的前體，也是抗流感神藥“達菲”的前體；栗木單寧中逆沒食子酸比塔拉單寧和五倍子單寧更難降解，且在構象柔性方面比沒食子酸單寧（塔拉和五倍子）差：沒食子酸單寧更易與細菌體上的脂質和蛋白質結合。此外，五倍子單寧的價格高昂，其化學制備方法存在對環(huán)境污染、設備損耗較大和能耗較高等問題，生物法存在發(fā)酵周期長且產(chǎn)物分離難的缺陷[17]。栗木單寧主要來自意大利及其周邊的中歐國家，需經(jīng)高溫蒸煮和有機溶劑提取。而塔拉單寧主要存在于塔拉豆莢中，塔拉樹生命力強，沒有五倍子對生長條件要求高，經(jīng)人工栽培和滴灌后產(chǎn)量大。塔拉與五倍子有相似的結構，作用基團一致，被認為可以用來替代五倍子作為生產(chǎn)沒食子酸和沒食子酸丙酯的主要原料。

在水產(chǎn)畜牧業(yè)生產(chǎn)中，將單寧酸用作飼料添加劑替代抗生素，有改善動物腸道健康及促進生長性能的作用[18]，對畜禽的高效安全生產(chǎn)具有重要的意義。自1962 年Swain 等研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的植物均含有少量單寧酸，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，從植物中提取單寧酸的方法不斷發(fā)展優(yōu)化，并迅速應用于各行各業(yè)。不同植物來源、不同劑量的單寧酸，由于動物種類和動物生長階段不同其應用效果不一，需對單寧酸的植物來源、化學結構、添加劑量及補充時間進一步篩選，篩選出最佳添加劑量及最適宜補充時間；但單寧酸在動物生產(chǎn)中的作用機制研究尚處于初級階段，具體的作用途徑尚不明確，下一步可考慮深入挖掘其機制與具體作用過程，為進一步應用提供參考。

4 結論

常見單寧產(chǎn)品由于來源不同其抑菌效果也不同，隨著單寧濃度的升高其抑菌效果會不斷增強。在本研究選用不同來源的植物單寧中，塔拉單寧對常見致病菌均有很好的抑菌效果，在未來的水產(chǎn)畜牧業(yè)應用和研究中有很大的潛力。