薛亞茹， 楊曉雪， 張亞如，李映志，葉春海

(廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524000)

【研究意義】菠蘿[Ananascomosus(Linn.) Merr]屬鳳梨科(Bromeliaceae Juss.)鳳梨屬 (AnanasMill.)，是熱帶著名的水果。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020年我國菠蘿種植面積9.96萬hm2，總產(chǎn)量263.93萬t，位居世界第三(FAO，2022)，但是單產(chǎn)量較世界平均水平較低。施肥管理技術(shù)的缺失，導(dǎo)致肥料利用率低，施肥比例和施肥時期會嚴重影響菠蘿的生長發(fā)育，合理的施肥管理是解決菠蘿高效生產(chǎn)問題的重要途徑之一?！厩叭搜芯窟M展】菠蘿的研究主要集中在成花機制、產(chǎn)量和品質(zhì)上，梁李宏等[1]研究得出合理增施氮、磷肥能提高香水菠蘿單果重和產(chǎn)量，過量施用鉀肥有降低香水菠蘿產(chǎn)量的可能；馬海洋等[2]在大田試驗條件下研究氮、磷、鉀肥不同配比對卡因菠蘿產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，認為施磷肥對菠蘿果實品質(zhì)影響不大。盡管國內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究，但對菠蘿葉片養(yǎng)分及磷鉀吸收轉(zhuǎn)運機制的研究較少。葉片是作物進行光合作用的主要器官，根據(jù)葉片營養(yǎng)元素的積累動態(tài)，可以反映出菠蘿的養(yǎng)分需求和分配規(guī)律，為科學(xué)施肥及制定合理的栽培技術(shù)提供重要的理論依據(jù)[3]。陳菁等[4]對菠蘿不同品種不同發(fā)育期氮、磷、鉀養(yǎng)分累積差異性進行了研究，探求不同品種菠蘿在不同發(fā)育期對氮磷鉀的需求；王金輝等[5]研究了在不同施肥條件下，香水菠蘿葉片氮磷鉀含量的動態(tài)變化及氮磷鉀肥對香水菠蘿葉片養(yǎng)分含量的影響；前人研究表明適量增施氮、鉀肥能顯著提高菠蘿葉片氮、鉀含量，磷肥對菠蘿葉片磷含量的影響則不明顯[5]，施鉀可以增加菠蘿葉片鉀元素的含量[6]，施用氮肥會增加菠蘿產(chǎn)量，也會增加植株對N、P、K及中微量元素的吸收[7]。也有研究者利用滴灌技術(shù)探索菠蘿需肥特性，在滴灌施肥下，氮、磷、鉀肥的利用率顯著提高，菠蘿對鉀的需求量最大[8]。以上研究說明適量施用氮肥、鉀肥可以提高葉片氮、鉀含量，且對產(chǎn)量有積極影響。【本研究切入點】目前對菠蘿的研究大多集中于提高產(chǎn)量與品質(zhì)，對氮肥及氮元素的研究較多，磷鉀元素的吸收與利用機制方面的研究鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究分析了不同鉀源處理對菠蘿葉片磷和鉀元素吸收及轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響，以期為進一步開展菠蘿葉片磷和鉀元素吸收及轉(zhuǎn)運機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

實驗地點在廣東海洋大學(xué)林果樓(110°18′30″E，21°09′40″N)。試驗所用材料為定植于營養(yǎng)缽內(nèi)的“金菠蘿”幼株，培養(yǎng)基質(zhì)為通用型植物生長無土基質(zhì)。實驗處理前定期澆水，維持正常生長，待植株葉片達到10片葉時，進行施肥處理。

1.2 實驗處理

選擇長勢良好、大小相似的菠蘿植株，按隨機區(qū)組方法設(shè)計試驗。試驗共設(shè)置MS營養(yǎng)液、10.029 mmol/L K2HPO4(T1)、20.054 mmol/L KCl(T2)、1.250 mmol/L K2HPO4(T3)、1.250 mmol/L NaH2PO4(T4)5個處理，以H2O(CK)為對照，每個處理3株，重復(fù)3次。其中T1、T2中鉀含量與MS培養(yǎng)液一致，T3、T4中磷的含量與MS培養(yǎng)液一致。施肥后2 d取樣1次，共施肥3次。

1.3 樣品采集與處理

施肥處理后，隔2 d開始采樣，共采集3次。樣品采集時間均為16:00。采集的葉片用冰盒帶回實驗室，經(jīng)自來水—蒸餾水清洗擦干，分成兩份，一份-80 ℃冰箱保存，用于基因表達分析；另一份放入105 ℃烘箱殺青30 min后，轉(zhuǎn)80 ℃烘干至恒重，隨后充分磨碎，干燥保存，用于P、K元素含量分析。

1.4 測定方法

葉片P元素含量的測定使用鉬銻抗比色法[9]，葉片K元素含量的測定使用火焰原子吸收法[9]。

使用試劑性RNA提取試劑盒(TAKARA)提取菠蘿葉片總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄(Prime Script RT reagent Kit，TAKARA)后，利用基因特異引物進行熒光定量 PCR( SYBR?Premix ExTaqTMII，TAKARA)分析，每個樣品重復(fù)3 次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進行結(jié)果統(tǒng)計，利用SPSS軟件對統(tǒng)計的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。采用2-ΔΔCt法計算基因的表達量。

表1 引物和內(nèi)參基因的序列

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷鉀源對菠蘿葉片磷、鉀元素含量的影響

如圖1所示，施肥處理后2、4、6 d，T3和T4處理后的菠蘿葉片磷含量與對照相比均顯著提高，T1與T2處理后各個時期磷含量與對照無顯著差異。以上結(jié)果表明，T3、T4處理對菠蘿葉片磷元素的吸收與積累有一定的促進作用，適量的鉀元素會促進磷元素的吸收與積累，過量則會抑制。

如圖2所示，在處理后2 d，與對照相比，T1、T2、T3、T4處理后菠蘿葉片鉀元素含量顯著提高；處理后4 d，與對照相比，T2處理后菠蘿葉片鉀元素含量顯著提高；處理后6 d，與對照相比，T1處理后菠蘿葉片鉀元素含量顯著提高。以上結(jié)果說明，T1、T2、T3、T4處理只在短期內(nèi)對菠蘿葉片鉀元素含量的吸收與積累有一定的促進作用。

2.2 NaH2PO4處理對菠蘿葉片磷轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響

如圖3所示，T4處理后不同時間，AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4、AcPHT6基因的表達水平出現(xiàn)顯著差異。從各基因的變化模式上看，AcPHT6基因的表達水平顯著升高，AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因的表達水平均顯著下降，AcPHT1、AcPHT5基因的表達水平無顯著變化。AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因在施肥處理后基因表達水平顯著降低，可能因為這些基因與缺磷響應(yīng)有關(guān)；AcPHT6基因的表達水平在施肥處理后顯著升高，推測該基因可能參與磷的轉(zhuǎn)運分配。

2.3 KCl處理對菠蘿葉片鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響

如圖4所示，在T2處理后的不同時間，AcNa/

H1、AcKUP1、AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表達水平均出現(xiàn)顯著差異。從各基因的變化模式上看，除AcNa/H2基因的表達水平無顯著差異外，其余基因表達水平均顯著降低，其中AcKUP1、AcNHX基因表達水平逐漸下降，AcNa/H1、AcHKT、AcKUP2基因表達水平表現(xiàn)出先升高后又下降的變化趨勢。處理后4 d，AcNa/H1、AcHKT、AcKUP2基因表達水平的差異達到最大。AcKUP1、AcNHX基因在施肥處理后基因表達水平顯著下降，該基因可能與缺鉀響應(yīng)有關(guān)。

2.4 K2HPO4處理對菠蘿葉片磷鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達的影響

K2HPO4含有磷和鉀兩種營養(yǎng)元素。T1和T3的濃度不同，其P含量和K含量也不同；T3與T4處理對磷轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達水平的影響存在差異。如圖5所示，T3處理后，除AcPHT6基因的表達水平表現(xiàn)出先下降后升高的變化趨勢外，其余磷轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的表達水平均呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，其中AcPHT1、AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因的表達水平在處理后4 d達到最高，顯著高于其他兩個處理時間；AcPHT6基因的表達水平在處理后6 d基因表達水平顯著升高。

T1與T2處理后對鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達水平的影響也有差異。T1處理后(圖6)，AcKUP1基因表達水平呈先升高后下降變化趨勢，AcNa/H1和AcNa/H2基因的表達水平表現(xiàn)出先下降后升高的變化趨勢，AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表達水平逐漸升高。處理后6 d，AcNa/H2、AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表達水平顯著升高。AcNHX、AcHKT、AcKUP2基因的表達水平在施肥處理后顯著升高，這些基因可能參與了植物體內(nèi)鉀元素的轉(zhuǎn)運與利用。

3 討 論

磷是植物生長發(fā)育過程中所必需的大量元素，是AMP、ADP和ATP中的重要組成成分，光合作用過程中許多輔酶如NAD+、NADP+中也含有磷元素；鉀是重要肥力因子，參與調(diào)控植物的很多生理代謝過程，且可提高光合作用強度，促進植物體內(nèi)淀粉和糖形成，改善植物產(chǎn)品品質(zhì)，增強植物抗逆性[10]。植物在生長發(fā)育過程中需要不斷從外界吸收養(yǎng)分，以滿足自身生命活動的需求，在植物生長發(fā)育的各個階段，對養(yǎng)分的種類、需求量都是不同的。近年來，國內(nèi)外針對‘卡因’和‘臺農(nóng)4號’等菠蘿品種建立了氮、磷、鉀施肥量與產(chǎn)量三元二次模型，這些施肥模型的研究對菠蘿的合理施肥具有重要的指導(dǎo)意義，但菠蘿對養(yǎng)分的吸收同時也受到品種、土壤理化性質(zhì)和管理模式等的綜合影響[11]，其內(nèi)部機制也會存在差異。

陳菁等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施10%、15%過磷酸鈣浸出液3次增加了菠蘿前期葉片磷含量；蘇苑君等[13]研究表明，在0.6 mmol/L NaH2PO4水平下，生菜全生育期總礦質(zhì)元素吸收量最大。黃美華等[14]研究表明，不同磷肥施用量對塊莖氮、磷積累無顯著影響，但鉀積累隨著施磷量的增加呈先增加后減少的趨勢。周厚基等[15]研究表明增施磷、鉀肥對促進果樹新梢枝條生長具有重要作用。本研究結(jié)果表明，在菠蘿中，含有磷元素與鉀元素的處理較只含單一磷元素或鉀元素的處理更能促進葉片對磷元素和鉀元素的積累。

基因表達受環(huán)境條件和植物自身遺傳特性的影響，可以反映作物的真實生長和代謝狀態(tài)。磷轉(zhuǎn)運蛋白 (Phosphate transporter)能夠控制植物對磷的吸收和轉(zhuǎn)運，對提高植物磷利用率具有重要作用。Liu等[16]通過番茄的分根實驗發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)植株的全部根系處于低磷脅迫時才有LePt1,LePt2的表達，并且分根植株的基因的總表達量介于所有根系完全供給充足磷和所有根系處于磷饑餓的植株之間。這些發(fā)現(xiàn)表明調(diào)控磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的信號來自于植物的莖，并且該信號可能于莖中磷濃度有關(guān)，可能受植物體內(nèi)部信號機制的調(diào)控。AcPHT6基因在植物體內(nèi)磷元素含量降低的情況下基因表達水平上升，可能為高親和力磷轉(zhuǎn)運蛋白。在磷匱乏條件下，部分擬南芥的PHT1基因可顯著上調(diào)表達，它們可能通過PHR1介導(dǎo)的途徑參與磷響應(yīng)調(diào)控[17]。水稻整個發(fā)育過程都受到OsPHT2;1基因表達的調(diào)控，該基因的表達還在一定程度上影響了PHT1基因的表達[18]，說明這些基因并不是單獨起作用。從T3和T4處理的對比看，處理后4 d，AcPHT1、AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4、AcPHT5基因的表達在T3處理下表現(xiàn)出更高水平，外界鉀離子可能影響植物對磷元素的吸收，進而影響植物磷轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白基因的表達水平。韓利紅等[19]鑒定分析了菠蘿PHT1家族基因，發(fā)現(xiàn)該家族基因啟動子區(qū)含有大量與植物生長發(fā)育、響應(yīng)激素和脅迫信號相關(guān)的順式作用元件，推測該家族基因受多種信號調(diào)控，在植物生長發(fā)育、應(yīng)對環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮作用，但它在菠蘿體內(nèi)的生物學(xué)功能還未進行驗證。本研究結(jié)果表明，除AcPHT6基因外，其余磷轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的表達水平均在T3處理下高于T4處理，推測外源鉀元素可能會影響植物對磷元素的吸收，進而影響相關(guān)磷轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達水平，這與施肥處理后菠蘿葉片磷元素含量的結(jié)果一致。

目前，已在多種植物中開展了磷、鉀吸收和調(diào)控機制的研究，但只在少數(shù)模式植物中取得了突破性的進展。植物中磷、鉀相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白對應(yīng)養(yǎng)分的吸收、分配、轉(zhuǎn)運往往并非受單一因素控制，而是受多種因素共同作用，且在不同植物中表達模式也有差異。本文對菠蘿中的磷、鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白基因在不同磷、鉀源影響下的表達模式進行了研究，為菠蘿植株磷、鉀元素的吸收及轉(zhuǎn)運機制研究奠定了基礎(chǔ)，但相關(guān)機制仍需進一步借助組學(xué)、生物信息學(xué)和基因工程等相關(guān)技術(shù)進行更深入的探究。

4 結(jié) 論

T1、T2、T3、T4處理只在短期內(nèi)對菠蘿葉片鉀元素含量的吸收與積累有一定的促進作用；除AcNa/H1基因外，T1處理后，其余鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達水平都高于T2處理，部分鉀轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的基因表達水平可能受磷供應(yīng)的調(diào)控；AcKUP1、AcNHX基因在T2處理后基因表達水平顯著下降，這些基因可能與缺鉀響應(yīng)有關(guān)；T3、T4處理對菠蘿葉片磷元素的吸收與積累有一定的促進作用。AcPHT2、AcPHT3、AcPHT4基因在T4處理后基因表達水平顯著降低，可能因為這些基因與缺磷響應(yīng)有關(guān)；AcPHT6基因的表達水平在T4處理后顯著升高，推測該基因可能參與磷的轉(zhuǎn)運分配。