高寧寧，李曉慧，康利允，梁 慎，常高正，李海倫，王慧穎，王 琰，徐小利，趙衛(wèi)星

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所, 鄭州 450002)

【研究意義】西瓜(Citrulluslanatus)屬葫蘆科，我國(guó)是世界上最大的西瓜產(chǎn)地。近年來(lái)，小果型西瓜以皮薄、含糖量高、口感細(xì)膩等特點(diǎn)，受到消費(fèi)者的廣泛歡迎[1]。西瓜是異花授粉植物，西瓜雜交種的生產(chǎn)以人工去雄為主，套袋處理、人工授粉，工作量大且雜交種子易不純，利用西瓜雄性不育系能夠解決這一難題[2]。我國(guó)小果型西瓜發(fā)展較晚，種質(zhì)資源相對(duì)匱乏，對(duì)小果型西瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，拓寬小果型西瓜的遺傳基礎(chǔ)，更好地創(chuàng)新和利用小果型西瓜種質(zhì)資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前的分子標(biāo)記方法有RFLP、SCAR、RAPD、CAPS、SSR和SRAP等，SRAP分子標(biāo)記是一種基于PCR技術(shù)的新型標(biāo)記系統(tǒng)，具有簡(jiǎn)便高效、重復(fù)性好、高共顯性等特點(diǎn)[3]。SRAP標(biāo)記在小麥[4-5]、黃瓜[6]、油菜[7]、甜瓜[8-10]等作物上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，SRAP標(biāo)記在西瓜上的應(yīng)用主要在遺傳圖譜構(gòu)建[11]、基因關(guān)聯(lián)分析[12]、品種純度鑒定[13-14]等方面。此外，利用SRAP分子標(biāo)記分析西瓜種質(zhì)遺傳多樣性也有相關(guān)報(bào)道，張愛(ài)萍等[15]采用SRAP技術(shù)對(duì)64份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果表明多數(shù)西瓜育種材料間同源性較高。李嚴(yán)等[16]利用20對(duì)SRAP引物組合標(biāo)記分析了20個(gè)西瓜雜交種的遺傳多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)西瓜的SRAP多態(tài)性水平相對(duì)低。Yaciolu等[17]利用27對(duì)引物對(duì)256個(gè)土耳其西瓜進(jìn)行了SRAP標(biāo)記，產(chǎn)生了210個(gè)標(biāo)記用于遺傳分析。李朋飛等[18]運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分析了80份西瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性，多態(tài)性最高達(dá)45.5%，研究表明供試西瓜材料遺傳背景狹窄?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，SRAP分子標(biāo)記對(duì)小果型西瓜雄性不育和可育種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的研究未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用SRAP標(biāo)記對(duì)雄性不育和可育小果型西瓜進(jìn)行親緣關(guān)系分析，為其特異種質(zhì)資源的合理利用提供理論基礎(chǔ)，加快小果型西瓜新品種的選育進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的45份小果型西瓜種質(zhì)為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所從世界各地收集及經(jīng)過(guò)多年創(chuàng)新的品種(系)。其中，1～9號(hào)為雄性不育材料，10～45號(hào)為正常雄性可育材料(表1)。

表1 供試45 份小果型西瓜品種

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 待供試45份西瓜材料長(zhǎng)至兩葉一心，取幼嫩葉片100 mg，放入破碎儀中破碎，利用改良的CTAB法[19]提取西瓜DNA，用分光光度計(jì)測(cè)量提取樣品的DNA濃度，并稀釋至30 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SRAP擴(kuò)增及電泳檢測(cè) SRAP反應(yīng)采用15 μL體系：2×Master Mix 7.5 μL (試劑購(gòu)自BioTeke公司)，30 ng/μL DNA 1 μL，0.4 μmol/L正、反向引物各0.4 μL，雙蒸水5.7 μL，擴(kuò)增程序參考黃春瓊等[20]的方法。選取雄性不育PV-2和雄性可育的西瓜材料MW002對(duì)441對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選(表2)，利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，具體操作參考梁寶萍等[21]的方法，篩選擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性高的引物。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

人工讀帶將圖譜上出現(xiàn)條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用NTSYS-pc 2.1e軟件中的UPGMA方法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，利用模塊Treeplot對(duì)統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析；用PopGen Version 3.2軟件計(jì)算不同類型小果型西瓜材料的遺傳變異指數(shù)，包括觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、遺傳距離和遺傳一致度，利用Cophenetic相關(guān)性方法對(duì)相似系數(shù)矩陣和聚類分析結(jié)果的吻合度進(jìn)行檢驗(yàn)。

表2 引物核苷酸序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP標(biāo)記多態(tài)性分析

利用篩選出的20對(duì)清晰穩(wěn)定且多態(tài)性較高的引物，對(duì)45份小果型西瓜進(jìn)行SRAP標(biāo)記，共獲得265條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物組合可擴(kuò)增到17.4條，其中多態(tài)性條帶13.25條，多態(tài)性比率為76.1%(表3)。me20-em5組合多態(tài)性條帶最多，為28條(圖1)，me12-em13、me12-em14和me21-em13引物組合擴(kuò)增多態(tài)率可達(dá)85%以上，me20-em20多態(tài)率最低，為52.2%。

2.2 不同類型西瓜種質(zhì)間遺傳變異分析

雄性不育和雄性可育小果型西瓜的Na參數(shù)分別為1.5460、1.7241，總體值為1.7557；Ne參數(shù)分別為1.2464、1.2887，總體值為1.3053；H參數(shù)分別為0.1562、0.1836，總體值為0.1954；I參數(shù)分別為0.2451、0.2918，總體值為0.3106(表4)。以上結(jié)果表明，供試45份小果型西瓜的遺傳多樣性較為豐富，雄性可育小果型西瓜遺傳多樣性指數(shù)均高于雄性不育型，說(shuō)明雄性可育小果型西瓜的遺傳變異較雄性不育型豐富。雄性不育和雄性可育小果型西瓜種質(zhì)的遺傳一致度為0.9348，遺傳距離為0.0674

表3 SRAP擴(kuò)增引物及擴(kuò)增多態(tài)率

表4 不同類型西瓜品種(系)遺傳多樣性指數(shù)

(表5)，表明兩種類型小果型西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系較近。雄性不育類型中，來(lái)自美國(guó)和河南的遺傳差異最大，遺傳一致度為0.7635，遺傳距離為0.2699，來(lái)自新疆和海南的遺傳差異最小，遺傳一致度為0.9608，遺傳距離為0.0400；雄性可育類型中，來(lái)自日本和河南的遺傳差異最大，遺傳一致度為0.7267，遺傳距離為0.3192，來(lái)自山東和河南的遺傳差異最小，遺傳一致度為0.9575，遺傳距離為0.0435(表6)。

2.3 聚類結(jié)果分析

利用NTSYS軟件分析45份小果型西瓜種質(zhì)的親緣關(guān)系，得出供試小果型西瓜的遺傳相似系數(shù)值為0.57～0.94(表7)。來(lái)自新疆的雄性不育小果型西瓜‘GMS3’和雄性可育小果型西瓜‘M6’的遺傳相似系數(shù)最小，為0.57，表明這兩份種質(zhì)間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。來(lái)自河南的雄性可育小果型西瓜中的‘斯維特2號(hào)’和‘禮品5’的遺傳相似系數(shù)最大，為0.94，表明這兩份種質(zhì)間的親緣關(guān)系最近。雄性不育類型中來(lái)自新疆的‘GMS3’和美國(guó)的‘PV-1’之間的遺傳相似系數(shù)最小(0.68)；雄性可育類型中來(lái)自陜西的‘MW008’和海南的‘X3’、山東的‘A20-3’之間的以及來(lái)自新疆的‘M6’和‘MW006’、河南的‘禮品5’之間的遺傳相似系數(shù)最小(0.64)，說(shuō)明這5組的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表5 不同類型西瓜品種(系)遺傳一致度和遺傳距離

表6 不同地區(qū)西瓜品種(系) 遺傳一致度和遺傳距離

續(xù)表6 Continued table 6

表7 45個(gè)西瓜種質(zhì)相似系數(shù)

利用NTSYS軟件對(duì)20對(duì)SRAP引物檢測(cè)到的348個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，通過(guò)UPGMA方法進(jìn)行聚類，以遺傳系數(shù)0.73為界，可將45份小果型西瓜種質(zhì)分為4個(gè)類群(圖2)，雄性不育小果型西瓜均集中在第Ⅰ類群，雄性可育小果型西瓜分布在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類群。第Ⅰ類群包含9個(gè)品種，均為雄性不育類型；第Ⅱ類群包含7個(gè)品種，第Ⅲ類群包含26個(gè)品種，第Ⅳ大類包含3個(gè)品種，均為雄性可育類型。

Cophentic關(guān)聯(lián)性能夠衡量遺傳相似系數(shù)和UPGMA聚類結(jié)果之間的相關(guān)程度。通過(guò)Cophentic相關(guān)性檢驗(yàn)得出兩個(gè)矩陣間的相關(guān)系數(shù)為0.75，表明遺傳相似系數(shù)矩陣與UPGMA聚類結(jié)果矩陣之間有密切的相關(guān)性。

3 討 論

SRAP分子標(biāo)記多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、能夠反映品種間的遺傳差異，是分析植物親緣關(guān)系和遺傳多樣性最常用的標(biāo)記之一[22]。本研究利用篩選出的20對(duì)穩(wěn)定且多態(tài)性較高的SRAP引物，對(duì)45份小果型西瓜進(jìn)行標(biāo)記，獲得348個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶265條，多態(tài)性比率為76.1%，多態(tài)率較高。本研究結(jié)果高于徐曉婷等[23]對(duì)95個(gè)F6重組自交系小果型西瓜的SRAP標(biāo)記(21.8%) 和Wang等[24]對(duì)61份中國(guó)西瓜種質(zhì)資源的SRAP分析(52.24%)，這可能與選擇群體有關(guān)；但是低于Solmaz等[25]對(duì)93份土耳其西瓜的標(biāo)記結(jié)果(97.3%)，可能是由研究對(duì)象的數(shù)量和種類不同導(dǎo)致。綜上表明，SRAP能夠有效地分析基因型狹窄的種質(zhì)資源。

雄性不育型供試小果型西瓜的多樣性參數(shù)Na、Ne、H、I值(1.5460、1.2464、0.1562、0.2451)均比雄性可育型的參數(shù)值(1.7241、1.2887、0.1836、0.2918)低，表明雄性可育型小果型西瓜的遺傳多樣性比雄性不育型的豐富。群體的樣本量不同，對(duì)遺傳多樣性的分析結(jié)果也有一定影響。群體內(nèi)的SRAP遺傳多樣性指數(shù)總值(1.7557、1.3053、0.1954、0.3106)高于高寧寧等[26]對(duì)51份不同抗性西瓜的標(biāo)記總值(1.6766、1.3033、0.1878、0.2931)，但低于尚曉星等[27]對(duì)玫瑰香系葡萄種質(zhì)資源的SRAP分析多樣性指數(shù)(1.7914、1.3791、0.2269、0.3488)和郭祿芹等[28]對(duì)167份西瓜的SSR遺傳多樣性標(biāo)記指數(shù)(4.86、2.20、0.27、0.94)，可能由研究者利用的分子標(biāo)記種類以及作物種類不同等因素所致。雄性不育和可育兩個(gè)群體間的遺傳距離為0.0674，表明兩群體間的遺傳差異較小。但筆者仍然能夠明顯發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)群體間有一定的差異，雄性不育類型中，來(lái)自美國(guó)和河南的遺傳差異最大，遺傳距離為0.2699；雄性可育類型中，來(lái)自日本和河南的遺傳差異最大，遺傳距離為0.3192，說(shuō)明國(guó)外引進(jìn)的品種與國(guó)內(nèi)品種差異較大。另外，來(lái)自新疆的雄性不育小果型西瓜‘GMS3’和雄性可育型‘M6’兩者的遺傳相似系數(shù)較小(0.57)，遺傳差異最大。可見(jiàn)，SRAP分子標(biāo)記能夠展現(xiàn)供試材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

本研究使用UPGMA聚類方法將 45份小果型西瓜種質(zhì)劃分為4大類，9份雄性不育小果型西瓜均集中在第Ⅰ大類，36份雄性可育小果型西瓜分布在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ大類，分類結(jié)果與遺傳多樣性遺傳參數(shù)結(jié)果一致，表明雄性可育小果型西瓜遺傳多樣性更豐富一些。通過(guò)Cophentic相關(guān)性檢驗(yàn)得出遺傳相似系數(shù)矩陣與UPGMA聚類結(jié)果矩陣間的相關(guān)系數(shù)為0.75，表明兩個(gè)矩陣之間的關(guān)聯(lián)性強(qiáng)，SRAP標(biāo)記分析得出的結(jié)果可信度較高。

豐富的種質(zhì)材料是新品種選育的基礎(chǔ)，明確了種質(zhì)的遺傳背景和群體結(jié)構(gòu)，才能有效而充分地利用[29]。該研究表明，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)研究小果型西瓜種間的親緣關(guān)系和遺傳差異是準(zhǔn)確可靠的，對(duì)小果型西瓜特殊種質(zhì)的利用、雜交親本的合理選擇具有很好的參考價(jià)值。今后還需要進(jìn)一步增加新種質(zhì)以豐富雜交后代的變異程度。

4 結(jié) 論

利用篩選出的20對(duì)SRAP引物能夠準(zhǔn)確地展現(xiàn)45份供試小果型西瓜種質(zhì)間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，為小果型西瓜種質(zhì)的合理利用和雜交親本的有效選擇提供了理論基礎(chǔ)。供試小果型西瓜種質(zhì)之間總體遺傳差異較小，雄性可育比雄性不育小果型西瓜的遺傳多樣性豐富，引進(jìn)的國(guó)外品種與國(guó)內(nèi)品種差異較大。因此，需要轉(zhuǎn)育融入更多新基因，從而提高小果型西瓜的遺傳多樣性，拓寬遺傳背景。