盧俊浩，張 婷，張 鵬，木萬福，楊 龍，張建華，黃曉蓉,，寸 婕,，管俊嬌

(1.云南大學(xué)資源植物研究院，昆明 650504；2.云南省種子管理站，昆明 650031；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，昆明 650205；4.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南 元謀 651300；5.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，昆明 650205)

【研究意義】花菜類作物包括青花菜(BrassicaoleraceaL.var.italicPlenck)、花椰菜(B.oleraceaL.var.botrytisL.)和芥藍(lán)(B.oleraceaL.var.alboglabra)、結(jié)球甘藍(lán)(B.oleraceaL.var.capitataL.)等，由甘藍(lán)野生種經(jīng)過自然和人工的雙重選擇形成的不同的栽培類型[1]。該類作物起源于歐洲的地中海沿岸地區(qū)，19世紀(jì)起中國從國外引進(jìn)品種，經(jīng)多年馴化栽培，已育出若干地方特色品種[2]。由于花椰菜和青花菜含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì)及獨(dú)特的保健功能，多年來倍受消費(fèi)者的青睞，其栽培面積不斷加大，在蔬菜市場上占有越來越重要的地位[3]。種質(zhì)資源是遺傳育種的基礎(chǔ)。盡管目前中國是世界上最大的花椰菜和青花菜的生產(chǎn)國和消費(fèi)國，但是擁有的種質(zhì)資源非常匱乏，優(yōu)良新品種的選育進(jìn)程有一定程度滯緩[4]，亟需加強(qiáng)花菜類作物品種資源和材料的共享、交流和評價，重視對遺傳背景差異大、親緣關(guān)系遠(yuǎn)的種質(zhì)資源的發(fā)掘利用，對促進(jìn)花菜類作物種業(yè)的發(fā)展有重要指導(dǎo)意義。【前人研究進(jìn)展】前人利用不同分子標(biāo)記技術(shù)和不同來源結(jié)構(gòu)的種質(zhì)材料群體，導(dǎo)致對花菜類蔬菜的分析結(jié)果一致性不高，如姚雪琴等[5]利用SRAP技術(shù)分析花椰菜遺傳多樣性及與其近緣種親緣關(guān)系，認(rèn)為花椰菜和寶塔花菜親緣關(guān)系最近，青花菜次之，芥藍(lán)最遠(yuǎn)；熟性是影響花椰菜品種資源類群的主要因素。劉運(yùn)霞等[6]利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，將78份花椰菜材料按照熟性和花球性狀進(jìn)行了分類，為花椰菜育種提供理論依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】SSR分子標(biāo)記技術(shù)是一種具有操作簡單、重復(fù)性好、位點(diǎn)特異穩(wěn)定性強(qiáng)，并且為共顯性遺傳，能在近緣種屬之間通用等優(yōu)點(diǎn)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于玉米[7]、水稻[8]、馬鈴薯[9]、小麥[10]等大田作物的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)的研究，使新品種選育效率有較大提高。目前國內(nèi)花菜種質(zhì)資源匱乏，遺傳多樣性狹窄，主栽品種依賴進(jìn)口，亟需加快優(yōu)良新品種的選育進(jìn)程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用SSR標(biāo)記對96份花菜類作物種質(zhì)材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期揭示花菜品種間的遺傳差異和親緣關(guān)系，為提高優(yōu)異種質(zhì)資源利用效率和雜交親本的選配提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選取花椰菜、青花菜品種材料共96份(表1)。其中，花椰菜材料有72份，包括7份主栽品種材料(No.30、No.47、No.48、No.49、No.63、No.67、No.69)、29份松花菜親本自交系和36份松花菜雜交一代材料;青花菜材料有24份。

表1 96份供試材料基本信息

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 DNA的提取

采用改良CTAB法[11]提取植株幼嫩葉片總DNA，分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA純度、質(zhì)量和濃度檢測，稀釋DNA濃度至20～30 ng/μL，作為SSR電泳的模板。

1.3 引物的設(shè)計(jì)和篩選

依據(jù)前人[12-16]研究公布的甘藍(lán)類微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，經(jīng)過初篩，在每條染色體上均勻選擇1～3對，最終共篩選22對SSR熒光標(biāo)記引物(表2)用于遺傳多樣性檢測。引物由上海擎科生物有限公司提供。

1.4 PCR體系與毛細(xì)管電泳熒光檢測

PCR總反應(yīng)體系為10 μL，包括2×mix混合液5 μL、10 mol/L正向引物0.3 μL、10 mol/L反向引物0.3 μL、樣品DNA 1 μL、超純水3.4 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管熒光電泳系統(tǒng)AB3730XL DNA分析儀(Applied Biosystems，USA)上檢測。用GeneMapper Ver.3.7(Applied Biosystems，USA)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和校正，讀出每個樣品各位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用軟件Popgen 32和軟件PowerMarker 3.25計(jì)算對應(yīng)引物的觀察等位基因數(shù)(Na)，有效位點(diǎn)數(shù)(Ne)、Shannon’s 信息指數(shù)(I)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、多態(tài)性指數(shù)(PIC)、基因多樣性(GD)和Nei’s遺傳距離，并按非加權(quán)配對法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。分析結(jié)果使用在線軟件iTOL(https://itol.embl.de/)進(jìn)行優(yōu)化。以軟件Structure 2.3.4推斷材料構(gòu)成群體的遺傳結(jié)構(gòu)，采用混合模型設(shè)置K值范圍為1～10，每個K值運(yùn)算重復(fù)10次，將MCMC(Markov Chain Monte Carlo)設(shè)置10000次迭代，初始burn-in次數(shù)為50000次，計(jì)算Q值。參考Evanno等[17]的統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行分析計(jì)算ΔK，由ΔK來確定最優(yōu)群體數(shù)K。

表2 22對SSR引物基本信息

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果顯示，22對SSR引物在96份材料的DNA樣品中共擴(kuò)增出91個等位位點(diǎn)，平均每對引物為4.136個位點(diǎn)(表3)。96份材料的群體有效等位基因數(shù)(Ne)變異范圍在1.043～3.489，平均為2.246；Shannon’s信息指數(shù)(I)和基因多樣性(GD)的變異范圍分別為0.101～1.720和0.041～0.766，平均值分別為0.909和0.496；觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的變異范圍分別為0～0.573和0.041～0.766，平均值分別為0.278和0.496；22對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性信息含量(PIC)值變異范圍在0.040～0.735，平均值為0.443，其中PIC值大于0.5的高多態(tài)性引物有10對，表明該10對引物在96份材料群體中的擴(kuò)增多態(tài)性較高，可用于花菜類種質(zhì)資源的鑒定和研究。

2.2 群體的遺傳多樣性分析

根據(jù)96份種質(zhì)材料的花球性狀，將其分為2個組群，即組群1：青花菜和西蘭苔(24份)和組群2：花椰菜(72份)。對2個組群SSR標(biāo)記多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(表4)，組群1和組群2的觀察等位基因數(shù)值(Na)分別為2.727和3.091；有效等位基因數(shù)(Ne)分別為1.910和1.841；Shannon’s 指數(shù)(I)分別為0.675和0.667。表明經(jīng)過高強(qiáng)度的人工選擇，花菜類作物2個組群的遺傳多樣性均不夠豐富。

2.3 聚類分析

利用軟件PowerMarker計(jì)算Nei’s遺傳距離，按非加權(quán)配對法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示全部材料可劃分為2個組群(圖1)，第Ⅰ組為1份西蘭苔材料和23份青花菜材料。西蘭苔來源于青花菜與芥藍(lán)的雜交后代，親緣關(guān)系較近，被聚到同一組內(nèi)。其中“女神”(No.19)與“NS女神”(No.68)遺傳距離最小僅為0.0080，為不同來源的同一品種；其次是“翡翠11號”(No.55)和“雅翠91”(No.66)遺傳距離為0.0130；“貝綠美”(No.50)和“祥云90”(No.63)的遺傳距離最大，為0.6896。

表3 22對SSR標(biāo)記引物遺傳信息統(tǒng)計(jì)

表4 群體材料的遺傳多樣性

第Ⅱ組包括全部的花椰菜材料。作為親本的29份自交系分別被聚到了4類亞群，第1類僅1份材料No.17，第2類中有11份材料，第3類中有4份，第4類中有7份。在各類中的自交系材料彼此之間的遺傳距離較小，如No.21與No.22遺傳距為0.0418，為同一個品系分出來的不同材料，僅1個性狀上存在差異，表現(xiàn)為一個葉片有蠟質(zhì)，一個無蠟質(zhì)。雜交親本配組時，用不同類中的材料進(jìn)行雜交，可獲得雜種優(yōu)勢。材料No.17與其他28份材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，利用這個材料與其他材料雜交，更有可能獲得突出的雜種優(yōu)勢。

綜上，96份花菜種質(zhì)資源總體遺傳多樣性較低，但部分材料存在較大的遺傳多樣性，為供試材料在雜交親本選配利用方面提供了參考。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用均勻分布在花菜基因組9條染色體上的22對SSR標(biāo)記引物對96份種質(zhì)材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。由圖2-A和圖2-B可以看出，隨著K值的增加，lnP(D)值也持續(xù)增加，當(dāng)K=2時，ΔK出現(xiàn)明顯的峰值，最大值為1658.48，表明可以將96份花菜資源劃分為2個組群(圖3)：第1組群(圖3紅色部分)共24份，包括23份青花菜雜交一代品種和1份西蘭苔材料；第2組群(圖3綠色部分)共72份，為全部的花椰菜材料。

群體百分比Q值越大，說明該資源材料遺傳背景相對單一，否則認(rèn)為該資源材料遺傳背景相對較復(fù)雜[18]。群體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示，96份花菜材料的Q值均大于0.6，說明該花菜資源的遺傳結(jié)構(gòu)較為單一，可以清楚的劃分到不同組群中。群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果與聚類分析的結(jié)果基本一致。

3 討 論

3.1 SSR標(biāo)記評價

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在花菜類作物中得到應(yīng)用，其中SSR標(biāo)記是應(yīng)用較多的技術(shù)之一[19]。本試驗(yàn)毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果顯示，22對引物在96份材料中共擴(kuò)增出91個等位位點(diǎn)，平均每對引物為4.136個；22對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的PIC值平均值為0.443，其中大于0.5的高多態(tài)性引物有10對。一方面表明毛細(xì)管電泳檢測的靈敏度較高，另一方面表明所選引物在96份材料群體中的擴(kuò)增多態(tài)性較高，可用于花菜類種質(zhì)資源的鑒定和研究。前人的研究中，SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米、水稻中的實(shí)際應(yīng)用價值也得到了驗(yàn)證[20-21]。SSR標(biāo)記技術(shù)具有操作簡便、多態(tài)性高、成本較低[22]，在種質(zhì)遺傳多樣性研究中有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 不同種質(zhì)材料的遺傳多樣性

種質(zhì)資源是進(jìn)行新品種選育的重要因素，遺傳基礎(chǔ)過于狹窄往往會制約種質(zhì)創(chuàng)新。本研究中，“西蘭苔貝綠美”(No.50)來源于青花菜與芥藍(lán)的雜交后代，與青花菜雜交種遺傳距離更近，聚到青花菜組內(nèi)?；ㄒ穗s交種“亞松20007”(No.73)、“亞松20008”(No.74)、“亞松19001”(No.86)分別與主栽品種“強(qiáng)雪”(No.47)、“慶揚(yáng)90”(No.48)、“亞非100”(No.49)之間的遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近，相互滲透，具有相似的遺傳背景。目前大部分的品種都由個別自交系培育而來，加上在人為選擇和環(huán)境不適宜導(dǎo)致所選育出的品種遺傳相似度較高，品種遺傳多樣性低，遺傳差異小[23]。盛小光等[15]研究表明，花椰菜和青花菜被清晰地分到了兩個極端，兩者之間沒有交叉，群體內(nèi)的遺傳變異豐度低，是經(jīng)過長期高強(qiáng)度的人工選擇后，形成了相對獨(dú)立的栽培類型；劉春晴等[24]將青花菜、松花菜、緊花菜和芥藍(lán)145份材料，按親緣關(guān)系分成了4個類群，類群內(nèi)品種間的遺傳多樣性較低，與本研究結(jié)果一致。因此，在今后的研究中，需要擴(kuò)大群體的范圍，盡可能挑選遺傳背景不同、親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的材料作為親本，提高雜種優(yōu)勢，選育出優(yōu)良創(chuàng)新品種。也可以利用SSR標(biāo)記構(gòu)建花菜類作物種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜，以更高效地區(qū)分該類作物地品系或品種，對雜交種純度鑒定和品種保護(hù)等方面具有重要意義。

3.3 遺傳距離聚類和Structure模型聚類結(jié)果比較

種質(zhì)遺傳聚類方法有多種，包括遺傳遺傳距離法、相似系數(shù)法、模型聚類法等，選擇不同的方法也會導(dǎo)致分析結(jié)果不同[25]。本研究通過Nei’s遺傳距離按非加權(quán)配對法(UPGMA)將96份花菜材料劃分為2個組群，分別包括24份青花菜和72份花椰菜材料，從聚類分析圖上來看，花椰菜和青花菜被清晰地分到了兩個組群，進(jìn)一步說明了這兩個組群是相對獨(dú)立的栽培類型。同時基于Structure模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析也將這些材料分為兩個組群。這與前人[15,23]的研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，Structure軟件的群體結(jié)構(gòu)分析可以避免人為因素對類群劃分的影響，進(jìn)而對材料群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行校正，有利于研究種質(zhì)間的遺傳關(guān)系，將類群劃分更加細(xì)致[26]。而結(jié)合聚類分析和Structure模型聚類法能更準(zhǔn)確地確定多份種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

4 結(jié) 論

本研究選用22對SSR引物，利用毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)對96份青花菜、花椰菜材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，96份種質(zhì)材料群體內(nèi)遺傳多樣性不豐富，根據(jù)遺傳距離并按UPGMA的方法聚類，可以將96份材料劃分為花椰菜和青花菜2個組群，與Structure模型群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致?；ㄒ俗越幌当环值搅?個亞群，但在各亞群中材料之間的遺傳距離較小，雜交組配時，可以選用不同亞群的自交系進(jìn)行組配，以獲得更大的雜交優(yōu)勢。本試驗(yàn)為青花菜、花椰菜在雜交親本選配、育種研究等方面提供了參考。