萬敬強，郭振東，馬永霞，謝萍

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院 心內(nèi)科,甘肅 蘭州 730000）

0 引言

風(fēng)濕性心臟?。╮heumatic heart disease，RHD），是由A組B溶血性鏈球菌感染所致（多為咽頰炎），其機制與鏈球菌感染后異常免疫反應(yīng)有關(guān)，心瓣膜受損是風(fēng)濕熱最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，主要累及二尖瓣和主動脈瓣。本病早期可無癥狀，隨著瓣膜狹窄與關(guān)閉不全的逐漸加重，最終發(fā)展為頑固性心力衰竭，需要外科換瓣治療[1]。目前主要治療方式為定期肌肉注射抗生素控制疾病的發(fā)展，盡管如此，仍有部分患者預(yù)后不良，最終發(fā)展為心力衰竭。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RHD占所有心血管死亡的1.6%，每年全球約30萬人死于RHD[2]。西醫(yī)對風(fēng)濕性心臟病的發(fā)病機制認(rèn)識不明，可能機制與鏈球菌感染后異常免疫反應(yīng)有關(guān)，迄今為止，無特效藥物，現(xiàn)迫切需要開發(fā)毒副作用較小的藥物。

沙棘廣泛分布于我國西北、華北等地，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗氧化、利肝、降脂、保護(hù)心血管等藥理活性[4]。沙棘中發(fā)揮保護(hù)心血管作用的當(dāng)屬黃酮類物質(zhì)，其主要通過調(diào)節(jié)Ca2+信號通路、ROS信號通路等信號途徑，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等過程，來改善心功能[5]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥理學(xué)和生物信學(xué)的結(jié)合學(xué)科，通過網(wǎng)絡(luò)分析，闡明藥物-疾病-通路的潛在關(guān)系，為中醫(yī)藥新藥研發(fā)與老藥新用提供一定的理論基礎(chǔ)[3]。與此同時，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)旨在闡明中藥整體性和人體疾病之間的對應(yīng)關(guān)系，與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治的原則相吻合[6]。因此，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析沙棘治療風(fēng)濕性心臟病的可能靶點和分子通路，為臨床研究提供依據(jù)。

1 方法和資料

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件來源

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究以網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫平臺為主[7]，本文所用數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址見表1。

表1 本文所用數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址

1.2 方法

1.2.1 沙棘中目標(biāo)化合物篩選

以“沙棘”為關(guān)鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索，以O(shè)B≥30%和DL≥0.15為限定條件。利用PubChem數(shù)據(jù)庫查詢以上活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和PubChem CI[8]。

1.2.2 沙棘活性成分作用靶點收集

通過TCMSP檢索獲得沙棘活性成分對應(yīng)的靶點。將每種成分對應(yīng)的靶點以表格形式保存至EXCEL中，分類去重處理后，讓數(shù)據(jù)更有條理性，以便后續(xù)的統(tǒng)計操作。利用UniProt知識庫，搜索獲得沙棘活性成分靶點對應(yīng)的基因，選擇分類為Human/Homo（人類）的基因，保存至相應(yīng)蛋白靶點之后[9]。

1.2.3 風(fēng)濕性心臟病相關(guān)基因檢索

將風(fēng)濕性心臟病、風(fēng)濕性心肌炎等詞輸入pharmaGKB、Disgenet、OMIM數(shù) 據(jù) 庫，篩 選 出疾病潛在靶點，下載搜索結(jié)果并保存為EXCEL格式。

1.2.4 藥物作用靶標(biāo)與風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)的獲取

將沙棘活性成分作用靶點對應(yīng)的基因集復(fù)制粘貼至新的EXCEL中，剔除重復(fù)項后與RHD的相關(guān)靶點取交集，從而篩選出沙棘治療RHD的共同靶點。

1.2.5 沙棘活性成分靶標(biāo)構(gòu)建

將Pelargonidin、canthaxanthine、carotenoid、cislycopene、delta-Carotene、ergosta-7-en-3-betaol、ergostenol、gamma-carotene、LAN、Mandenol、rhein、24-epicampesterol、beta-carotene、isorhamnetin、beta-sitosterol、Schottenol、CLR、quercetin等活性成分的靶標(biāo)上傳到 Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建沙棘活性成分靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 靶標(biāo)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在STRING數(shù)據(jù)庫首頁，選擇“Multiple Proteins”選項，在List of Name欄輸入沙棘和風(fēng)濕性心臟病的交集靶標(biāo)，Organism選擇為“Homo Sapiens”，然后點擊Search進(jìn)入，在Setting選項欄選擇將相互作用閾值設(shè)置為“Medium Confidence（中等置信度）”0.4[10]，獲得藥物與疾病靶標(biāo)相互作用關(guān)系，將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)出EXCEL中。最后利用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的制作。

1.2.7 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

將沙棘和風(fēng)濕性心臟病疾病的交集靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，Select Identifier選擇“OFFICIAL_ GENE_SYMBOL”,List Type選 擇“Gene List”，Organism選 為“Homo Sapiens”，點擊Functional Annotation Tool后 再 選 取“Gene Ontology”下 的“GOTERM_BP_DIRECT”以 及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，然后再應(yīng)用微生信平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 沙棘有效成分篩選

以O(shè)B ≥ 30%、DL ≥ 0.18 為篩選條件，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩得到18種沙棘的活性成分。如表2所示。

表2 沙棘治療RHD主要活性成分及靶點

2.2 沙棘活性成分的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)包括472條邊和18個節(jié)點，連接數(shù)較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中起著舉足輕重的作用，可能是核心活性成分或者關(guān)鍵靶點。其中異鼠李素（isorhamnetin）、大黃酸（cislycopene）、槲皮素（quercetin）、亞油酸乙酯（Mandenol）等具有較強的藥理活性。

圖1 沙棘與風(fēng)濕性心臟病交集靶點Venn圖

2.3 沙棘與風(fēng)濕性心臟病靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

沙棘與風(fēng)濕性心臟病共同靶標(biāo)共包括37個節(jié)點，如圖2。Degree值越大則節(jié)點顏色越深，且節(jié)點越接近圖中圓心，如圖3。沙棘治療風(fēng)濕性心臟病的靶標(biāo)中Degree值排名前4位的靶標(biāo)為STAT3、AKR1C3、TNF、MMPs。

圖2 沙棘活性成分網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）

圖3 沙棘治療風(fēng)濕性心臟病共同靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 活性成分對應(yīng)靶標(biāo)的GO生物過程分析

2.4 GO生物過程和KEGG通路富集分析

沙棘治療風(fēng)濕性心臟GO富集分析發(fā)現(xiàn)，沙棘作用途徑大多與膠原蛋白代謝過程、細(xì)胞外基質(zhì)分解、MAPK的激活、基因表達(dá)調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ促進(jìn)器轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等有關(guān)；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，沙棘可調(diào)節(jié)TNF信號通路、代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、HIF-1信號通路等來發(fā)揮作用。

3 討論

在沙棘-活性成分-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)，一種活性成分作用于多個靶標(biāo)、通路，這恰巧體現(xiàn)中醫(yī)的整體優(yōu)勢。其中槲皮素、異鼠李素屬于黃酮類化合物，具有較強的抗氧化活性，可直接清除心肌組織中的超氧歧化物、自由基、過氧化氫等氧化性物質(zhì)，刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生超氧歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等還原性物質(zhì)，從而發(fā)揮抗炎抗氧化功能，保護(hù)心肌組織。研究表明槲皮素可通過抑制ROS過度生成而抑制P38-MAKP介導(dǎo)的心肌纖維化的發(fā)生[11]；槲皮素通過改善糖尿病大鼠心肌組織的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡而減輕心肌損傷[12]；研究表明，異鼠李素通過影響線粒體凋亡途徑和激活Nrf2/ARE信號通路來保護(hù)心肌細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的損傷[13]。異鼠李素通過抑制氧化應(yīng)激、線粒體凋亡途徑和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑改善阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷[14]。有研究表明大黃酸要用價值高，研發(fā)前進(jìn)廣泛，大黃酸具有抗腫瘤、抗纖維化、調(diào)脂、降血糖、抗菌抗病毒等廣泛的藥理活性，廣泛應(yīng)用于心血管疾病[15]。

圖4 活性成分對應(yīng)靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

風(fēng)濕性心臟病PPI網(wǎng)絡(luò)中靶標(biāo)STAT3、TNF、MMP1、MMP3、MMP9、IGFBP3、MAPK14 高表達(dá)。STAT3作為信號傳感器和活化劑是由多種生長因子和細(xì)胞因子參與的關(guān)鍵信號蛋白，能夠引起不同的生物結(jié)果，包括細(xì)胞生長、分化和存活[16]。AKR1C3是醛酮還原酶超家族的家族成員之一,目前研究發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤發(fā)病密切相關(guān)。TNF-α作為炎性指標(biāo)，在多種惡性腫瘤、各器官功能衰竭、感染性疾病[17]等病理條件下均升高。其中MMP家族矩陣金屬蛋白酶 （MMPs）是蛋白分解酶家族，在細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組件的降解和合成中非常重要[18]。IGFBP-3是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和纖維化等細(xì)胞過程的基本蛋白質(zhì)，執(zhí)行各種生理功能[19]。MAPK14作為p38MAPK信號通路的關(guān)鍵分子，是多種激活下游多種炎癥的核心環(huán)節(jié)，在病原微生物感染引起的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[20]。上述關(guān)鍵靶標(biāo)其中TNF-α、MAPK14介導(dǎo)了炎癥因子的合成與釋放，說明沙棘在風(fēng)濕性心臟病治療中發(fā)揮抗炎具有重要意義。IGFBP-3、MMPs與纖維化通路密切相關(guān)，表明沙棘在治療RHD晚期頑固性心力衰竭中具有重要意義。

GO 生物過程主要集中于氧化應(yīng)激、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積、膠原蛋白活化、MAKP通路。KEGG通路分析結(jié)果顯示:通路主要涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路，關(guān)于TNF信號通路，TNF-α抑制β-腎上腺素能受體，負(fù)反饋導(dǎo)致交感神經(jīng)激素分泌增加，進(jìn)一步促進(jìn)機體釋放促炎因子，加重了組織細(xì)胞損傷，同時激活心肌肥厚和心力衰竭的信號通路[17]。HIF-1α是一種氧敏感轉(zhuǎn)錄因子，在常氧條件下極易被降解，因此，當(dāng)發(fā)生心肌缺血時，受損的心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞可釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等一系列細(xì)胞炎性因子引起局部炎癥反應(yīng)，從而加重組織損傷[21]。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建沙棘治療RHD的“成分-靶點-通路”作用機制。結(jié)果表明，沙棘主要是以黃酮類化合物槲皮素、異鼠李素等18種活性成分為物質(zhì)基礎(chǔ)，以STAT3、TNF、MMP1、MMP3、MMP9、IGFBP3、STAT3、MAPK14等8個蛋白作為主要作用靶點，經(jīng)由TNF信號通路，HIF-1α信號通路等抗炎抗氧化相關(guān)通路起到治療作用。因此，本文預(yù)測的沙棘“多成分-多靶點-多通路”的作用機制，可為進(jìn)一步深入開展沙棘治療風(fēng)濕性心臟病作用機制研究提供新的路徑和方向。