吳靖娜，潘 南，陳曉婷，陳 貝，劉智禹,*

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013）

惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類身體健康和生命安全的常見疾病，目前化療仍是其主要的治療方法之一，然而，化療藥物在消滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)導(dǎo)致患者腸道炎癥反應(yīng)造成腸道菌群紊亂，破壞腸道上皮屏障作用及腸道的免疫作用，從而引起其他病癥，如骨髓抑制、肝損傷等疾??；此外，臨床診斷顯示，接受長期化療的患者會(huì)出現(xiàn)免疫抑制的狀況，導(dǎo)致機(jī)體對抗原的應(yīng)答能力出現(xiàn)抑制甚至缺失的現(xiàn)象，所以多數(shù)患者在治療期間會(huì)被給予適當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)劑來緩解免疫抑制現(xiàn)象。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是一種常用的化療藥物，其不僅會(huì)損傷機(jī)體的正常細(xì)胞，而且容易誘發(fā)機(jī)體的免疫功能低下，已成為建立免疫抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的常用藥物。免疫抑制是一種表現(xiàn)為臨時(shí)性或永久性的免疫應(yīng)答功能障礙的免疫反應(yīng)，大量研究表明，多糖可通過激活固有免疫細(xì)胞、適應(yīng)性免疫細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)和免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）的表達(dá)，從而提升機(jī)體的免疫功能，是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑，能夠以多靶點(diǎn)、多通道及多重效應(yīng)的方式從免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫活性物質(zhì)對機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控。如羊棲菜多糖對CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌有明顯的促進(jìn)作用；雙孢菇子實(shí)體多糖、菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖能夠恢復(fù)CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠胸腺和脾臟臟器指數(shù)，顯著提高免疫抑制小鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子和IgG的分泌水平，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，具有明顯的免疫增強(qiáng)能力；黑虎掌菌子實(shí)體多糖能夠促進(jìn)免疫抑制小鼠血清和脾臟中Ig和細(xì)胞因子的生成，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答作用，對CTX誘導(dǎo)的免疫抑制具有保護(hù)作用；香菇多糖能增強(qiáng)免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促使脾臟淋巴細(xì)胞增殖分化和血清溶血素形成，提高小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，降低血清中細(xì)胞因子IL-10的水平，提高血清Ig含量，逆轉(zhuǎn)CTX誘導(dǎo)的免疫抑制。因此，尋找食源性多糖并闡明其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性的具體作用機(jī)制，可以為食源性免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

海洋藻類含有豐富的活性物質(zhì)，從藻類中提取的多糖已被證明具有多種治療功效。紅毛藻（）屬于紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜屬植物，生長于亞寒帶至亞熱帶區(qū)域，我國的主要產(chǎn)地在福建莆田。目前，對于紅毛藻中多糖的研究主要集中在制備工藝及活性評價(jià)，如宋田源等的研究結(jié)果顯示紅毛藻中多糖具有潛在的降血壓、降血糖和降血脂的活性；詹慧等通過構(gòu)建酶活力和細(xì)胞模型，同樣證明了紅毛藻中多糖具有降血脂活性；余剛等的研究結(jié)果表明紅毛藻中多糖具有顯著的體外免疫誘導(dǎo)活性；孫惠潔和吳云輝等的研究結(jié)果顯示紅毛藻中多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基具有明顯的清除能力，具有一定的體外抗氧化活性；何萍萍等的研究結(jié)果顯示紅毛藻中多糖對HO誘導(dǎo)氧化損傷的Caco-2細(xì)胞具有保護(hù)作用；張一非等在優(yōu)化紅毛藻中多糖提取工藝基礎(chǔ)上，對其抗光氧化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多糖質(zhì)量濃度為0～200 μg/mL時(shí)具有抗人皮膚成纖維細(xì)胞光氧化損傷能力。本課題組前期從紅毛藻中提取獲得一種分子質(zhì)量約為333 kDa的紅毛藻多糖（polysaccharides，BFP），其主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5 種單糖組成。本研究通過腹腔注射CTX構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，從多個(gè)角度初步探討B(tài)FP對免疫抑制小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，以期為BFP開發(fā)成食源性免疫調(diào)節(jié)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性SPF級BALB/c小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

BFP由課題組自制。

CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶測試盒 南京建成生物工程研究所；胎牛血清、預(yù)染蛋白Marker 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基 美國Corning公司；YAC-1細(xì)胞、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-2、IgG、IgA、干擾素-γ（interferon-γ，INF-γ）、核因子（nuclear factor，NF）-κB酶聯(lián)免疫吸附測試（enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）試劑盒、磁珠法總RNA提取試劑盒、SYBR Premix Ex試劑盒上海美軒生物科技有限公司；麗春紅染色液 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL） 美國Millipore公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 瑞士Roche公司；Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、IL-6、TNF-α抗體武漢三鷹生物科技有限公司；TLR9抗體、核苷酸結(jié)合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）1抗體、NOD2抗體 英國Abcam公司；細(xì)胞激活劑、固定破膜套裝（固定/濃縮工作液、孵育緩沖液）、抗鼠CD3、CD25、CD19、CD4、CD8、IL-17抗體 美國BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan MK3酶標(biāo)儀、311二氧化碳培養(yǎng)箱、Fresco低溫冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀 美國BD公司；Scepter細(xì)胞計(jì)數(shù)器美國Millipore公司；7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；165-8001小型垂直電泳槽、164-5050基礎(chǔ)電泳儀、170-3930小型轉(zhuǎn)印槽 美國Bio-Rad公司；164-5050超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)小鼠4～5 周齡，體質(zhì)量（18±2）g，維持每天12 h的交替光照，25 ℃恒溫環(huán)境，充足食物和水供給，在SPF級動(dòng)物房中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。60 只小鼠隨機(jī)分為6 組，每組10 只。分組：生理鹽水組（空白對照組）、CTX免疫抑制組（模型組）、低劑量BFP處理組、中劑量BFP處理組、高劑量BFP處理組、香菇多糖（陽性對照組）。給藥方式：前3 d每天進(jìn)行1 次腹腔注射，空白對照組小鼠腹腔注射100 μL生理鹽水，模型組、陽性對照組和低、中、高劑量BFP處理組小鼠腹腔注射100 μL CTX（40 mg/kg）；第4天開始，各組分別灌胃100 μL生理鹽水、香菇多糖（40 mg/kg）、低劑量BFP（100 mg/kg）、中劑量BFP（200 mg/kg）、高劑量BFP（400 mg/kg），連續(xù)灌胃4 周。

頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，進(jìn)行自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活性和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)；用2 mL生理鹽水灌洗小鼠腹腔2 次，吸出腹腔液，進(jìn)行腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力檢測；收集小鼠全血，對淋巴細(xì)胞分群情況進(jìn)行檢測；將小鼠血液3 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集小鼠血清，測定IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ、IgA和IgG水平；收集結(jié)腸組織，檢測NF-κB、TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、IL-6和TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平。

1.3.2 增強(qiáng)免疫力的指標(biāo)測定

增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)參照《允許保健食品聲稱的保健功能目錄 非營養(yǎng)素補(bǔ)充劑（2020年版）（征求意見稿）》中“有助于增強(qiáng)免疫力功能檢測方法”，采用細(xì)胞免疫、體液免疫功能和非特異性免疫中單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性多個(gè)維度進(jìn)行綜合評價(jià)。NK細(xì)胞活性評價(jià)采用乳酸脫氫酶測定法；腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力采用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)法測定；碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α采用小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)中校正吞噬指數(shù)法測定；血清溶血素水平采用凝血法測定；T細(xì)胞增殖率采用ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的MTT法測定。

1.3.3 相關(guān)細(xì)胞因子和免疫球蛋白質(zhì)量濃度的測定

按試劑盒說明書操作，采用ELISA法定量測定血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ）、IgA、IgG的質(zhì)量濃度，每組3 個(gè)平行。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)分析淋巴細(xì)胞分群

每管加入100 μL全血，并分別加入10 μL相應(yīng)的抗體（CD3/CD4/CD8、CD3/CD19和CD4/CD25），振蕩，室溫避光20 min。加入1 mL溶血素試劑，振蕩后室溫避光10 min，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，振蕩。加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline（PBS），pH 7.2、0.01 mol/L），振蕩，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，振蕩。加入500 μL PBS，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析CD3CD4T細(xì)胞、CD3CD8T細(xì)胞、CD4CD25T細(xì)胞、CD3CD19B細(xì)胞的比例，計(jì)算CD4T細(xì)胞/CD8T細(xì)胞（即CD4/CD8）。每組6 個(gè)平行。

每管加入100 μL全血，然后加入1 mL溶血素，振蕩后室溫避光10 min，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加入2 mL PBS，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液。加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取200 μL細(xì)胞懸液，加入0.4 μL細(xì)胞激活劑混勻，37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞。1 200 r/min離心5 min后棄去培養(yǎng)基，用100 μL PBS重懸細(xì)胞，加入5 μL CD4抗體，室溫放置30 min。加入2 mL PBS，1 500 r/min離心5 min棄去上清液。加入1 mL固定/濃縮工作液（固定濃縮液與稀釋液體積比1∶3），室溫放置30 min。加入2 mL孵育緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入2 mL孵育緩沖液重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min。取100 μL上清液，加入5 μL IL-17抗體，室溫避光放置30 min。加入1 mL孵育緩沖液，1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入500 μL PBS，上機(jī)檢測，分析CD4IL-17T細(xì)胞的比例。每組6 個(gè)平行。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測小鼠結(jié)腸組織中、（、、、、、）、NOD樣受體（nucleotide oligomerization domain-like receptor，）（和）、細(xì)胞因子（和）mRNA相對表達(dá)水平的變化，每組3 個(gè)平行。

取50 mg結(jié)腸組織切成小塊后，液氮研磨成粉狀，按照磁珠法總RNA提取試劑盒的操作說明提取總RNA。按照SYBR Premix Ex試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系20 μL，樣品管和內(nèi)參管均設(shè)3個(gè)復(fù)管。反應(yīng)條件為50 ℃、10 min反轉(zhuǎn)錄，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)。以為內(nèi)參基因，采用2法比較各組mRNA相對表達(dá)水平的差異。

實(shí)驗(yàn)所用引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物Table 1 Primer sequences used for amplification of target and internal reference genes

1.3.6 Western blot分析

收集小鼠的結(jié)腸組織，Western blot方法檢測小鼠結(jié)腸組織NF-κB、TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9）、NLR（NOD1和NOD2）以及細(xì)胞因子（IL-6和TNF-α）的相對表達(dá)水平，每組3 個(gè)平行。

把20 mg結(jié)腸組織剪切成小塊，加入200 μL RIPA裂解液，經(jīng)勻漿機(jī)充分勻漿后，12 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每孔加入20 μL上樣液，留一孔加入10 μL預(yù)染的Marker，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，加入5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育24 h，TBST洗膜3 次，每次5 min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜5 次，每次15 min，加入ECL試劑反應(yīng)發(fā)光后，暗室中用X膠片感光、顯影、定影，采集圖像，Quantity-one軟件分析灰度值。蛋白相對表達(dá)水平為目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值之比。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFP對免疫抑制小鼠非特異性免疫的影響

由圖1A可知，與空白對照組相比，模型組小鼠NK細(xì)胞活性極顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量BFP處理組極顯著地增強(qiáng)NK細(xì)胞活性（＜0.01）；高劑量BFP的增強(qiáng)作用與陽性對照組相當(dāng)，NK細(xì)胞活性高達(dá)57.36%。由圖1B可知，與空白對照組相比，模型組小鼠巨噬細(xì)胞中性紅吞噬能力極顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，低劑量BFP處理組能略微提高巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；中、高劑量組對巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的促進(jìn)效果達(dá)到極顯著水平（＜0.01）。由圖1C、D可知，與空白對照組相比，模型組小鼠碳廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α均極顯著降低（＜0.01）；與模型組相比，中、高BFP處理組可極顯著提高碳廓清指數(shù)K（＜0.01）；低、中、高BFP處理組均能顯著或極顯著提高吞噬指數(shù)α（＜0.05、＜0.01）。

圖1 BFP對免疫抑制小鼠免疫功能的影響Fig. 1 Effect of BFP on the immunity of immunosuppressed mice

2.2 BFP對免疫抑制小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫的影響

由表2可知，與空白對照組相比，模型組小鼠T細(xì)胞增殖率、CD4T細(xì)胞比例、CD4/CD8均極顯著降低；與模型組相比，低劑量BFP處理組能促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖，但效果不顯著（＞0.05）；中劑量BFP處理組的增殖效果達(dá)到顯著水平（＜0.05）；高劑量BFP處理組達(dá)到極顯著水平（＜0.01），細(xì)胞增殖率高達(dá)18.58%，增殖效果與陽性對照組相當(dāng)；與模型組相比，低、中劑量BFP干預(yù)能夠顯著提高血液中CD4T細(xì)胞的比例（＜0.05），高劑量BFP處理組可以極顯著提高血液中CD4T細(xì)胞的比例（＜0.01）；與模型組相比，低、中劑量BFP處理能夠降低CD8T細(xì)胞比例，但效果不顯著（＞0.05），而高劑量BFP干預(yù)顯著下調(diào)CD8T細(xì)胞比例（＜0.05），并顯著提高CD4/CD8。與空白對照組相比，模型組小鼠輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）17（CD4IL-17T細(xì)胞）比例極顯著升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）（CD4CD25T細(xì)胞）比例無顯著變化；與模型組相比，低、中、高BFP處理均能夠顯著或極顯著降低Th17（CD4IL-17T細(xì)胞）的比例（＜0.05、＜0.01），而對Treg（CD4CD25T細(xì)胞）比例沒有顯著影響（＞0.05）；中、高劑量BFP干預(yù)極顯著降低了免疫抑制小鼠血液中CD3CD19B細(xì)胞的比例（＜0.01）。

表2 BFP對免疫抑制小鼠T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的影響Table 2 Effect of BFP on T lymphocytes and B lymphocytes in immunosuppressed mice

由圖2可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清溶血素水平極顯著降低；與模型組相比，低、中BFP處理組對血清溶血素水平的影響不顯著（＞0.05）；而高劑量BFP對其的促進(jìn)效果達(dá)到極顯著水平（＜0.01），且略高于陽性對照組。

圖2 BFP對免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影響Fig. 2 Effect of BFP on serum hemolysin level in immunosuppressed mice

由圖3可知，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ）、IgA和IgG的質(zhì)量濃度極顯著下降（＜0.01）；與模型組相比，低、中、高BFP劑量處理組均能極顯著促進(jìn)IL-2、IL-6、TNF-α和INF-γ的釋放（＜0.01），極顯著提高IgA和IgG的產(chǎn)生（＜0.01）。

圖3 BFP對免疫抑制小鼠血清中IgA（A）、IgG（B）、IL-2（C）、IL-6（D）、INF-γ（E）和TNF-α（F）質(zhì)量濃度的影響Fig. 3 Effect of BFP on IgA (A), IgG (B), IL-2 (C), IL-6 (D), INF-γ (E)and TNF-α (F) levels in serum of immunosuppressed mice

2.3 BFP對免疫抑制小鼠腸道組織中免疫相關(guān)細(xì)胞表面受體及細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

如表3所示，與空白對照組相比，CTX處理后，模型組小鼠結(jié)腸組織中和的mRNA相對表達(dá)水平顯著增加（＜0.05），而其他和變化不顯著（＞0.05），免疫相關(guān)因子（、）的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于空白對照組（＜0.05）。與模型組相比，中、高劑量BFP組干預(yù)顯著下調(diào)了和的轉(zhuǎn)錄水平（＜0.05），同時(shí)，中、高劑量組基因表達(dá)水平較模型組顯著降低（＜0.05），低、中、高劑量的基因表達(dá)水平較模型組均顯著降低（＜0.05），但是和mRNA相對表達(dá)水平的變化趨勢與血清中IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度變化趨勢不同。

表3 BFP對小鼠結(jié)腸組織中TLR、NLR以及免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)水平的影響Table 3 Effect of BFP on the relative mRNA expression levels of TLR, NLR and immune-associated cytokines in the colon of mice

采用免疫印跡進(jìn)一步驗(yàn)證免疫相關(guān)細(xì)胞表面受體及細(xì)胞因子的變化，結(jié)果如圖4所示。與空白對照組相比，CTX處理后，模型組小鼠結(jié)腸組織中TLR2、TLR4、IL-6和TNF-α的蛋白相對表達(dá)水平極顯著提高（＜0.01）；而經(jīng)低、中、高劑量BFP干預(yù)后，TLR2和TLR4蛋白相對表達(dá)水平較模型組均極顯著降低（＜0.01），IL-6和TNF-α的蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，與基因表達(dá)檢測結(jié)果一致。

圖4 BFP對免疫抑制小鼠結(jié)腸組織中TLR2（A）、TLR4（B）、IL-6（C）和TNF-α（D）蛋白相對表達(dá)水平的影響及其免疫印跡圖（E）Fig. 4 Effect of BFP on the relative protein expression levels of TLR2 (A),TLR4 (B), IL-6 (C) and TNF-α (D) in the colon of immunosuppressed mice and their western blot (E)

3 討 論

機(jī)體免疫系統(tǒng)是關(guān)聯(lián)免疫器官、免疫細(xì)胞以及免疫分子的極其復(fù)雜的防御體系，分為特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫防御體系包括B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。研究表明臨床常用的抗癌藥物CTX可以通過抑制免疫相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，降低NK細(xì)胞，脾臟T、B淋巴細(xì)胞，白細(xì)胞的活性，以及減弱腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，從而達(dá)到免疫抑制的目的。因此，本研究采用CTX作為免疫抑制造模藥物，通過口服BFP，從非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫等多維度探討B(tài)FP增強(qiáng)免疫抑制小鼠免疫能力的作用機(jī)理。

NK細(xì)胞在機(jī)體免疫中發(fā)揮著重要的免疫監(jiān)視作用，當(dāng)它接觸靶細(xì)胞后在其表面釋放細(xì)胞毒性顆粒，能非特異性地殺傷各種腫瘤細(xì)胞，而吞噬細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）也是非特異性免疫的關(guān)鍵參與者。因此，NK細(xì)胞的活性以及細(xì)胞吞噬功能常用于評估機(jī)體的非特異性免疫狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFP干預(yù)能夠活化CTX所致免疫抑制小鼠NK細(xì)胞，并能提高巨噬細(xì)胞吞噬能力，增加小鼠碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α，這些結(jié)果說明口服BFP能有效提高免疫抑制小鼠的非特異性免疫。

淋巴細(xì)胞分為介導(dǎo)細(xì)胞免疫的T淋巴細(xì)胞（CD3）和介導(dǎo)體液免疫的B淋巴細(xì)胞（CD19）。成熟T淋巴細(xì)胞主要定居在外周免疫器官和血液中，可經(jīng)過血液、組織液等進(jìn)行循環(huán)，主要以殺傷靶細(xì)胞或釋放免疫相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，而T淋巴細(xì)胞的增殖分化是機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的前提。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，中、高劑量BFP處理能促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖（＜0.05）。T淋巴細(xì)胞在胸腺中分化為成熟T細(xì)胞，即CD4T細(xì)胞和CD8T細(xì)胞。CD4T細(xì)胞可促使B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的增殖，調(diào)控免疫細(xì)胞之間的相互作用，在免疫調(diào)節(jié)中處于中心地位，而CD8T細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，可殺傷靶細(xì)胞，一般認(rèn)為，CD4/CD8降低即提示機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。CD4T細(xì)胞在局部微環(huán)境中經(jīng)抗原刺激及細(xì)胞因子的調(diào)控作用，分化為多種不同的細(xì)胞亞群，共同參與機(jī)體免疫應(yīng)答，目前研究較多的亞群有Th1、Th2、Th17和Treg亞群，它們相互作用共同維持機(jī)體的免疫平衡，其中Th17主要介導(dǎo)固有免疫，其可分泌具有促炎作用的細(xì)胞因子IL-17，而Treg主要介導(dǎo)負(fù)向調(diào)控應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，瑪咖多糖能夠促進(jìn)CD4T細(xì)胞增殖；海膽多糖可對抗CTX引起的CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞比例以及CD4/CD8的下降，從而起到增強(qiáng)免疫的作用；絞股藍(lán)粗多糖能夠提高CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠血清和脾臟中的CD4T細(xì)胞和CD4/CD8；黑靈芝多糖可促進(jìn)免疫低下小鼠小腸CD4T細(xì)胞的表達(dá)，提高CD4/CD8，強(qiáng)化機(jī)體細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)Th17/Treg平衡的恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BFP能夠提高免疫抑制小鼠CD4T細(xì)胞并增加CD4/CD8，降低Th17的比例，但是Treg比例沒有顯著差異（＞0.05）。這些結(jié)果說明BFP能有效改善由CTX引起的小鼠免疫功能下降。

體液免疫是指活化的B淋巴細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，漿細(xì)胞又分泌特異性抗體從而清除抗原并產(chǎn)生記憶細(xì)胞保護(hù)機(jī)體的免疫應(yīng)答過程。B淋巴細(xì)胞作為專職的抗原提呈細(xì)胞，發(fā)揮著連接固有免疫和獲得性免疫的作用，其特異性表面標(biāo)志為CD19分子。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，BFP干預(yù)降低了CD3CD19B細(xì)胞的比例。血清溶血素水平反映機(jī)體形成抗體的能力，常用于評價(jià)機(jī)體體液免疫功能，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，高劑量BFP處理后免疫抑制小鼠的血清溶血素水平極顯著升高（＜0.01）。Ig是血清和體液中具有抗體活性的一類蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫環(huán)境，包括IgA、IgG、IgM等多種類型，其分泌量可以反映體液免疫系統(tǒng)的狀況。本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠血清中IgA和IgG的質(zhì)量濃度極顯著下降（＜0.01），低、中、高BFP劑量處理組均能極顯著提高IgA和IgG的釋放量（＜0.01），這些結(jié)果說明BFP能有效改善由CTX引起的小鼠體液免疫功能下降。

細(xì)胞因子不僅能夠單獨(dú)起效，還能與其他細(xì)胞因子相互協(xié)同或相互制約，從而在機(jī)體免疫應(yīng)答時(shí)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。細(xì)胞因子大部分是小分子物質(zhì)，是通過刺激免疫細(xì)胞及某些非免疫細(xì)胞合成分泌而成，可參與多種免疫功能。比如IL-2是引起T細(xì)胞增殖分化的主要細(xì)胞因子，其表達(dá)水平是衡量機(jī)體細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)之一；IL-6能夠調(diào)節(jié)包括T、B淋巴細(xì)胞等在內(nèi)的免疫細(xì)胞功能，在體液免疫中發(fā)揮著重要作用；IFN-γ屬于II型干擾素，主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)主要組織相容性復(fù)合體分子表達(dá)、抗原提呈、抑制Th2細(xì)胞等功效。由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α是免疫防護(hù)的重要介質(zhì)，能夠通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促使多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞活性，與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。本研究采用ELISA法檢測小鼠血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子（IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ）的質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)CTX免疫抑制小鼠血清中的IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ質(zhì)量濃度極顯著下降（＜0.01），經(jīng)低、中、高劑量BFP處理后均能極顯著促進(jìn)IL-2、IL-6、TNF-α和INF-γ的釋放（＜0.01），表明BFP能夠通過促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。

模式識別受體是非特異性免疫中免疫受體的代表，入侵的微生物或抗原物質(zhì)可以被宿主腸道黏膜上特定模式識別受體識別，引起免疫反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌和多種免疫細(xì)胞的分化，它們是連接非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵橋梁。其中TLR和NLR是兩類重要的模式識別受體，TLR位于細(xì)胞表面或胞內(nèi)吞噬體膜，而NLR分布于胞質(zhì)溶膠，共同借助識別細(xì)胞外和進(jìn)入胞內(nèi)的病原體相關(guān)分子模式而啟動(dòng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)免疫應(yīng)答。多糖是具有空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜大分子，存在活性中心，可作為配體被模式識別受體識別并激活其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終可能會(huì)起到調(diào)控細(xì)胞免疫功能和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。如黃芪多糖、當(dāng)歸多糖等多種中藥多糖可以通過TLR4活化轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，激活下游信號通路，調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)最終發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。豬苓多糖通過TLR4受體識別，可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟及分泌細(xì)胞因子IL-12、IL-10。本實(shí)驗(yàn)對小鼠腸道中部分、以及其下游部分促炎細(xì)胞因子（、）的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示BFP顯著下調(diào)了、的mRNA表達(dá)水平（＜0.05），而對其他和的表達(dá)并沒有顯著影響；此結(jié)果與白術(shù)多糖和豬苓多糖的結(jié)果剛好相反，可能是因?yàn)椋藭r(shí)多糖是通過調(diào)控機(jī)體TLR受體的表達(dá)情況或其通路蛋白活性來發(fā)揮提高免疫力的活性，比如褐藻多糖硫酸酯通過抑制TLR4的表達(dá)及抑制NF-κB通路的激活而減緩炎癥病程進(jìn)展。同時(shí)，腸道組織中促炎細(xì)胞因子（、）mRNA表達(dá)水平的變化趨勢與血清中不一致。這可能是由于CTX對腸道黏膜損傷主要以促炎為主，表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的增加，而外周免疫系統(tǒng)中細(xì)胞因子的釋放來源于脾臟和胸腺等全身性免疫系統(tǒng)的控制，CTX造成了免疫抑制，即表現(xiàn)為細(xì)胞因子水平的降低。此外免疫應(yīng)答分為抗原識別、淋巴細(xì)胞增殖活化和效應(yīng)階段，在脾臟、胸腺完成應(yīng)答程序之后，腸道免疫應(yīng)答正好處于效應(yīng)階段。對其蛋白表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，BFP顯著抑制了小鼠結(jié)腸組織中TLR2、TLR4、IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)，這與基因測定結(jié)果一致。因此，推測BFP可能通過TLR2/TLR4下游相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)軸起到免疫功能保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

BFP對CTX誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的非特異性免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫具有良好的調(diào)節(jié)作用，能夠有效改善CTX所致的小鼠免疫功能抑制情況。同時(shí)，BFP能夠下調(diào)免疫抑制小鼠腸道相關(guān)免疫細(xì)胞表面受體（TLR2、TLR4）基因和蛋白的表達(dá)水平，降低免疫相關(guān)因子（IL-6、TNF-α）基因和蛋白的表達(dá)水平，綜上，推測BFP可能通過TLR2/TLR4下游相關(guān)信號通路調(diào)節(jié)軸改善小鼠的腸道免疫環(huán)境進(jìn)而起到免疫功能的保護(hù)作用，而具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。