李銀匯，王文駿,2,3，呂瑞玲,2，劉東紅,2,3,*

（1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；2.浙江大學寧波研究院，浙江 寧波 315100；3.浙江大學馥莉食品研究院，浙江 杭州 310058）

食品安全問題關系人類生命健康，對于如何降低食品安全風險，不同時期的研究人員有不同的研究策略。傳統(tǒng)的熱加工容易破壞食品原有風味甚至產生苯并芘等致癌物質，家禽等在養(yǎng)殖過程中使用的抗生素若造成殘留則會促進耐藥菌的產生，它們對傳統(tǒng)熱加工有更高的耐受性?，F(xiàn)階段的食品加工處理傾向于最大限度保留食品的風味、營養(yǎng)、色澤，并保證食品微生物安全達標，因此非熱加工技術受到了越來越多的關注。

超聲波是一種超出人耳聽覺范圍、頻率高于20 kHz的機械波。目前研究中常用超聲波可以按頻率高低分為：低頻超聲（也稱功率超聲，20～100 kHz）、高頻超聲（100 kHz～10 MHz），其中高頻超聲包含診斷超聲（5～10 MHz）。作為一種新興的非熱加工技術，超聲波因其無殘留、可自動化、設備相對簡單等特點被廣泛應用于醫(yī)學診斷、距離測量、食品加工、材料切割等領域。

研究發(fā)現(xiàn)超聲波具有一定的殺菌效果，但單獨使用的效果有限。而超聲波與其他殺菌技術聯(lián)用的柵欄技術在提高殺菌效果方面有顯著的積極作用。殺菌劑具有殺菌譜廣、價格低廉等優(yōu)勢，有最廣泛的工業(yè)應用基礎，但殺菌劑也存在易產生有毒副產物、滲透性差等問題。實際上，超聲波和殺菌劑的聯(lián)用具有良好的協(xié)同殺菌效果，不僅可以減少殺菌劑的用量從而減少化學殘留和有毒有害物質的生成，還可以縮短殺菌處理時間，在實際生產中具有巨大的應用潛力。本文綜述超聲波空化效應、超聲波與殺菌劑聯(lián)用的殺菌機理和影響因素，以及它們在食品領域的應用，旨在為進一步研究基于超聲波與殺菌劑的聯(lián)用技術提供參考。

1 超聲波空化效應

空化閾值即發(fā)生超聲空化需要的最小聲壓，當超聲波在液體介質中傳播時，由于周期性的正負壓交替，施加的聲壓超過空化閾值，液體介質內分子間的吸引力不足以維持分子間距，導致分子之間產生空隙而形成空腔，當空腔中氣體足夠多時便形成了空化泡，空化泡在振蕩過程中經整流擴散逐漸長大，直至臨界尺寸時迅速崩潰，該過程即超聲空化?？栈莸谋罎⒂袃煞N類型，即穩(wěn)態(tài)空化和瞬時空化。穩(wěn)態(tài)空化發(fā)生在較小的聲壓條件下，空化泡一般不發(fā)生激烈的崩潰，當其非線性振蕩較為強烈時，穩(wěn)態(tài)空化泡周圍的液體隨之運動，伴有強剪切力。瞬時空化一般發(fā)生在聲壓足夠大時，瞬時空化泡被壓縮至極致，在反彈的過程中發(fā)生內爆，形成許多小空化泡，伴有剪切力、沖擊波、微射流等物理效應，并產生局部高溫（約5 000 K）和高壓，生成自由基等高氧化活性物質，引發(fā)隨后的一系列化學反應，這些作用最終導致細菌失活。

空化效應即氣泡成核作用，在聲壓幅值的負壓相超過空化閾值時發(fā)生。由于氣體溶解度與壓力成正比，負壓下溶解在液體中的氣體達到過飽和狀態(tài)，不能再溶解，就會產生許多氣泡。成核后，空化泡開始生長直至破裂（圖1），頻率在很大程度上決定了該過程的長短，研究表明空化泡的壽命會隨著頻率的增加而降低，由213 kHz時的0.35 ms降低到1 062 kHz時的0.10 ms?？栈鳛槌暤姆磻诵模瑫鹨幌盗形锢砘瘜W現(xiàn)象，本文著重介紹超聲穿孔、聲化學、聲致發(fā)光現(xiàn)象。

圖1 超聲空化泡生長周期示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the growth cycle of ultrasonic cavitation bubbles

1.1 超聲穿孔

超聲穿孔現(xiàn)象，即超聲波產生的機械應力使細胞膜滲透性瞬時可逆地增加形成孔穴的現(xiàn)象。超聲穿孔主要與空化泡崩潰前的周期性振蕩、崩潰后產生的剪切應力有關（圖2）。這些孔的直徑從幾十納米到幾百納米不等，小分子可以通過這些瞬時孔被動擴散進出細胞?？茖W研究已經在形態(tài)學上觀察到高強度低頻的超聲波處理細菌會導致孔的形成，低強度高頻超聲波則沒有明顯損傷。聲穿孔現(xiàn)象在藥物遞送、食品微生物殺菌等領域研究較多。例如，陳麗娟等利用超聲（1 MHz）結合微泡可逆地有限開放腦膠質瘤血腦屏障，對腦組織無明顯損傷。楊梅利用高強度聚焦超聲誘導小鼠皮膚形成微孔，實現(xiàn)了經皮遞送乙肝疫苗。Khadhraoui等研究了超聲波提取迷迭香葉片中迷迭香酸的機理，結果表明超聲波可能通過包括超聲穿孔在內的6 個鏈解構機制中發(fā)揮作用。

圖2 超聲穿孔示意圖Fig. 2 Schematic diagram of sonoporation

1.2 聲化學

聲化學即由聲空化產生自由基并引發(fā)一系列次級化學反應的效應。Suslick將聲化學廣義地分為同質、異質兩類，前者涉及鍵斷裂或自由基形成導致的化學反應，后者代表由增強的傳質作用而提高化學反應性的聲化學效應。自由基產率是聲化學效應中的重要部分，盡管單個空化泡中產生的自由基數(shù)量與頻率呈負相關趨勢，但在整個反應體系內的自由基產率是先隨頻率升高而后再下降的，因為在反應體系內，當頻率升高時，空化泡的壽命變短，其內的自由基將遷移至氣泡外從而引發(fā)產生更多的自由基。除自由基的含量外，過氧化氫、氧氣的含量等都會影響聲化學效應的強弱，故常用反應分子物質的量與超聲波能量的比值來反映聲化學效應的強弱，單位為mol/J。

大量研究表明聲化學效應在200～300 kHz最強。另外，聲化學效應的強弱還取決于空化泡內部溫度、空化閾值、空化泡數(shù)量、空化泡壽命等因素。一方面，根據氣泡動力學，隨著聲波頻率的增加，空化泡崩潰時達到的最高溫度下降；空化閾值隨頻率的增大而增大，使得非均勻聲場中產生空化泡的活躍區(qū)域變窄，這兩個因素導致聲化學效應變弱；另一方面，隨著超聲波頻率的增加，波長變短，對應的活躍區(qū)間隔也變短，駐波場中的空化泡密度增加；空化泡的壽命在高頻率聲場中變短，更多自由基可以從空化泡中逸出，與介質中的其他物料發(fā)生反應，這兩個因素導致聲化學效應增強。

1.3 聲致發(fā)光

聲致發(fā)光是指超聲過程中空化泡破裂瞬間產生高溫高壓導致的閃光現(xiàn)象。聲致發(fā)光可以分為單氣泡聲致發(fā)光和多氣泡聲致發(fā)光。前者是由單個穩(wěn)定振蕩的氣泡在駐波的波腹處發(fā)生的閃光，它源于空化泡坍塌時內部的發(fā)射的等離子體；后者是是由液體中的許多空化泡共同產生的閃光，它不僅源于內部等離子體發(fā)射，還包括空化泡坍塌時發(fā)生的化學發(fā)光，但仍存在爭議。

聲致發(fā)光產生的閃光可以催化金屬氧化物等聲敏劑產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）從而發(fā)揮抗菌作用。Zhang Lingling等利用ZnO納米流體與超聲波聯(lián)用處理大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)超聲波的存在誘導了更多ROS的產生，同時還可以分散聚集的ZnO，促進ZnO粒子產生自由基。較低的頻率和較高的功率密度下抑菌效果更好，這可能是由于在這些情況下坍塌的空化泡有更多的勢能，而這些勢能將促進化學反應的進行以及轉化為熱、光和聲能，進一步催化聲敏劑來起到殺菌效果。但若聲敏劑的吸收光譜范圍與超聲波產生的瞬時閃光的光譜范圍沒有較好重疊，則有可能削弱兩者聯(lián)用的效果，這還有待進一步的研究證明。

2 殺菌劑及其與超聲波聯(lián)用的殺菌機理

超聲波與殺菌劑聯(lián)用時，主要通過以下途徑起殺菌作用：一是超聲波可以將團聚的細菌細胞簇打散，有助于殺菌劑接近細胞表面而提高殺菌效率，同時，超聲波本身的機械剪切、熱效應和聲化學效應也可以破壞細菌；二是超聲波可以提高化學試劑的滲透效率，使化學試劑更易滲透到細胞內部而提高殺菌效率；三是超聲波可以通過誘導部分殺菌劑生產更多具有殺菌活性的物質來提升殺菌效率。常見的殺菌劑主要有含氯試劑、過氧化物、季銨化合物（quaternary ammonium compounds，QACs）等，各項聯(lián)用技術的殺菌機理總結如圖3所示，下面具體分小節(jié)展開討論。

圖3 超聲波聯(lián)合殺菌劑的殺菌機理Fig. 3 Mechanism of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

2.1 含氯試劑

含氯試劑具有殺菌譜廣、生產成本低、應用范圍廣等特點，常見的含氯試劑有氯氣、次氯酸鈉、次氯酸鈣、二氧化氯、次氯酸以及微酸性電解水等含氯混合物。含氯殺菌劑能穿過細胞壁進入細胞內，同時釋放ROS，導致蛋白質側鏈氧化和去折疊化，并與核酸發(fā)生反應導致氧化損傷。超聲波單獨使用時，其振動過程產生的機械作用可以促進細菌、生物被膜從果蔬等產品表面脫離，減少產品表面的微生物負載。Tan等使用20 kHz的超聲波處理鼠傷寒沙門氏菌60 s，發(fā)現(xiàn)在保持細胞活性的前提下，菌體的鞭毛量顯著下降至55%，該菌的附著量減少了10%～15%，這可能是因為細菌的鞭毛被破壞后，細菌不足以運動到與基質表面足夠近的距離來完成附著。這一發(fā)現(xiàn)為超聲波聯(lián)合殺菌劑提升殺菌效果提供了一種潛在可能性，即超聲處理可以通過將細菌從待潔凈表面轉移至含有殺菌劑的液體環(huán)境中的方式來提升殺菌效果。

已有研究發(fā)現(xiàn)，超聲波和含氯試劑聯(lián)用時存在協(xié)同效應。一方面，由于超聲波的機械作用和聲化學效應，細胞膜的選擇透過性被破壞，可能會增強殺菌劑對細菌的滲透作用；另一方面，空化效應也能促進溶液中微生物團簇的分解，增加殺菌劑與微生物的接觸。而在這些外界的強刺激下，細胞也可能為“自?！倍鞒鲆恍┓e極響應。Yu Hang等研究發(fā)現(xiàn)，超聲波與二氧化氯聯(lián)合處理金黃葡萄球菌時，超聲波破壞了細胞膜結構，同時也激活了細胞內機械敏感通道（如MscS和MscL），進而促進了二氧化氯進入細胞內，二者共同脅迫引起細胞的輔助基因調節(jié)系統(tǒng)（accessory gene regulator，Agr）上調基因，這可能導致金黃色葡萄球菌間的黏連性下降，使得生物被膜更松散；另外，和基因的下調抑制了生物被膜的形成；和基因與細胞裂解的能力密切相關，相比于二氧化氯單獨處理，聯(lián)用處理使基因上調1.82 倍，基因下調1.52 倍，使得金黃色葡萄球菌細胞更容易被裂解。這說明聯(lián)合處理對細菌細胞結構的影響是多方面的，且對細菌有較好的致死作用。

但是，含氯試劑易與水中雜質反應生成DBPs并危害公共健康，如與水中的含氮化合物（包括氨）反應，生成三鹵甲烷等致癌物。另外，超聲波有一定的脫氣和降解作用，這會導致聯(lián)用時有效氯含量降低。故現(xiàn)有研究嘗試使用其他更安全的殺菌劑來替代含氯化合物。

2.2 過氧化物

過氧化物是一類化學分子結構中包含有過氧基（—O—O—）的強氧化劑，因其強氧化性且殺菌范圍廣而廣泛用于醫(yī)療、食品、水處理、水產養(yǎng)殖、家庭防護等。常見的過氧化物殺菌劑有過氧化氫、過氧乙酸、無機過氧酸鹽、過碳酰胺、單過氧鄰苯二甲酸鎂等。過氧化物的氧化作用可以造成細菌膜脂質、蛋白質、核酸等的氧化損傷。另外，其強氧化性的另一部分還可能來自于分解過程中產生的活性衍生物，如自由基。以過氧乙酸為例，其可通過3 種途徑產生自由基：一是在酸性環(huán)境中過氧乙酸的末端氧發(fā)生質子化，脫去一分子水，最終形成帶有多余電子的乙酸根離子；二是給出一個電子后形成過氧酰基自由基；三是由外加能量破壞過氧化物或O—H后解離產生自由基。另一種重要的過氧化物，即HO，其與過渡金屬鐵離子共同參與Fenton反應也可以產生大量自由基。這些自由基可以對蛋白質和酶的巰基（—SH）以及二硫鍵（—S—S—）起到極強的破壞性作用，從而影響了由激酶、磷酸酶和轉錄因子控制的細胞內穩(wěn)態(tài)環(huán)境。

通常，細菌的抗氧化性由強到弱為細菌芽孢＞革蘭氏陽性菌＞革蘭氏陰性菌，且細菌存活率隨氧化劑濃度或用量的增加而下降。另外，在氧化水平較低的情況下，細菌胞內的過氧化氫酶或其他過氧化物酶的存在會增加細菌對氧化的耐受性。但與超聲波聯(lián)用后，即使氧化劑濃度較低，也可以達到較好的殺菌效果，特別是聯(lián)用后自由基水平的增加大大提高了殺菌效率。Rubio-Clemente等采用高級氧化工藝（advanced oxidation processes，AOPs），對飲用水中的病原體大腸桿菌進行紫外/HO、紫外/超聲和紫外/超聲/HO處理，發(fā)現(xiàn)紫外/超聲/HO體系處理5 min即可使大腸桿菌完全失活（檢測限為1 CFU/100 mL）。該研究還發(fā)現(xiàn)，超聲波聯(lián)合HO處理的細菌去除率相比于單獨超聲作用時增加了62.16%，這是因為超聲波的空化效應促進了HO熱分解產生更多的羥自由基。Giannakis等利用超聲波和Fenton反應聯(lián)合處理廢水，單獨超聲波或Fenton反應處理時細菌數(shù)量分別可減少27.9%和24.4%，聯(lián)合處理使細菌數(shù)量減少82.1%，達到兩種單獨處理下細菌減少量之和的1.57 倍，Giannakis等認為其協(xié)同效應是因為HO重組并不斷引發(fā)新的Fenton反應，同時，超聲波使細胞膜的滲透性暫時性地提高，F(xiàn)e更易進入細菌細胞內，促進Fenton反應產生更多自由基，造成活性物質的氧化損傷，最終導致細菌失活。

2.3 無機金屬氧化物

無機金屬氧化物因其良好的抗菌性、化學穩(wěn)定性、低毒性、不使細菌產生耐藥性等優(yōu)勢而被廣泛研究。無機金屬氧化物的殺菌機理研究較多的主要有3 種：一是因靜電作用聚集在細胞表面，影響物質交換；二是滲透入細胞內，與胞內含硫蛋白質以及DNA等含磷化合物相互作用，影響細菌的呼吸鏈、分裂等過程，最終導致死亡；三是通過形成高氧化活性的自由基氧化細菌細胞。在實際研究中，這3 種機理往往同時存在。

近年來，金屬氧化物納米顆粒（nanoparticles，NPs）優(yōu)良的光催化活性是研究的熱點。在光催化下，NPs吸收能量，在導帶產生負電子，在價帶產生帶正電的空穴，自由電子可以攻擊周圍的氧和水分子，形成ROS，介導細菌死亡。而超聲波的聲致發(fā)光效應可以為NPs提供光催化環(huán)境。Zhang Lingling等利用聲光催化ZnO納米流體，發(fā)現(xiàn)聲光催化可以提高ROS水平，而上清液中鋅離子的濃度卻沒有增加，與此同時，聲光催化下大腸桿菌的失活效率提高了約20%，Zhang Lingling等指出聲光催化下大腸桿菌失活效率的提高主要是因為ROS水平提高而不是鋅離子。Rahman等開發(fā)了一種使用Fe/ZnO NPs的可見光輔助聲光催化方法對志賀氏菌進行處理，也得到了類似的結論，他們還發(fā)現(xiàn)該方法會影響細菌細胞的脂肪酸組成，并減弱細菌形成生物被膜的能力。

目前對NPs和超聲波聯(lián)用的研究處于起步階段，其殺菌機理研究并不深入，還需進一步研究。

2.4 季銨化合物

QACs，即一個帶正電的氮原子與4 個相同或不相同的脂烴基或芳烴基共價連接的化合物，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有殺菌效果，能抑制細菌芽孢的生長但不能抑制其萌發(fā)。帶正電的氮使QACs容易與細菌表面產生靜電吸引而吸附到細胞膜上破壞其電荷分布，同時QACs的長烷基鏈能滲透細胞膜，與DNA結合，其鏈長在C～C范圍內可達到最佳殺菌效果。但是細菌自身編碼的多種外排泵、細胞膜成分的改變等會提高細菌對QACs的耐受性。

超聲波與QACs聯(lián)用常被用于去除生物被膜，聯(lián)用后既能減少QACs用量，又能保持一定的生物被膜清除能力。單核細胞增生李斯特氏菌（以下簡稱單增李斯特菌）是一種易在與食品接觸的塑料、鋼材等表面形成生物被膜的常見菌。Torlak等聯(lián)合超聲波與苯扎氯銨處理聚苯乙烯表面的單增李斯特菌生物被膜，結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理1 min的殺菌效果優(yōu)于相同濃度下苯扎氯銨單獨處理5 min的效果，說明聯(lián)合處理可以減少殺菌所需時間；同時，Torlak等還發(fā)現(xiàn)在處理5 min條件下，聯(lián)合超聲波與100 mg/L苯扎氯銨的殺菌效果優(yōu)于單獨使用400 mg/L苯扎氯銨的殺菌效果，說明聯(lián)合處理可以降低苯扎氯銨的使用量。Torlak等推測兩者的協(xié)同效應可能是超聲波提高了傳質效率，促進了苯扎氯銨向生物被膜的傳輸，破壞了細菌細胞膜脂質雙層，通過解離導致細胞質泄漏，最終清除生物被膜。Berrang等也得到了相似的結果。

2.5 酸

酸作為廣譜殺菌劑在生產生活中應用廣泛，其中大多為有機酸。有機酸以非解離的形式進入細菌細胞內并解離，產生的陰離子和質子促使細胞排出過多的質子，該過程消耗了維持胞內pH值穩(wěn)態(tài)的能量，最終導致細胞死亡。當pH值相同時，無機酸的解離常數(shù)高于有機酸，無機酸完全解離，在胞外對細菌影響相對較小，而有機酸未解離，可以進入細胞內發(fā)揮作用，因此pH值越低，未解離形式的酸所占比例越高，抗菌效果也就越好。

據報道，超聲波聯(lián)合乳酸、檸檬酸或蘋果酸處理生菜葉片，可使單增李斯特菌和大腸桿菌對數(shù)值減少約2.5（lg（CFU/g）），比單一有機酸處理額外減少0.8～1.0（lg（CFU/g））。聯(lián)合處理提升殺菌效果的原因可能是超聲空化效應將細菌從生菜葉上剝離下來，增加了有機酸與生菜葉褶皺內細菌的接觸，提升了酸的作用效率。

2.6 精油

精油作為從芳香植物中提取的天然抗菌劑，具有顯著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗寄生蟲活性。精油可以抑制細菌胞外多糖和蛋白的分泌、調節(jié)基因的轉錄水平來抑制生物被膜的形成、干擾膜電位、陰礙DNA合成，抑制多種酶系統(tǒng)，影響細菌糖代謝途徑。

超聲波處理可減小精油液滴尺寸，增大液滴的比表面積，增加液滴與微生物的接觸面積，從而達到協(xié)同殺菌效果。精油也可在細菌細胞的磷脂雙分子層中堆積，使其對超聲波更敏感。另外，為了改善精油的水不溶性、提高化學穩(wěn)定性和生物利用度，研究人員常將其制成乳液。He Qiao等聯(lián)合超聲波（3.33 W/mL）與百里香精油納米乳液處理金黃色葡萄球菌3 min，與兩者單獨處理的加和相比，殺菌量對數(shù)值顯著增加了1.44（lg（CFU/mL）），He Qiao等認為協(xié)同效應產生的原因可能是超聲波處理使細菌細胞膜損傷導致表面疏水性降低，進一步提高了精油乳液與細菌的互作機率，兩者的聯(lián)用使得胞內物質大量流失、細胞膜失去膜電位、膜成分變性最終導致細菌死亡。

2.7 氣體

一些氣體如臭氧、二氧化碳、二氧化氯等溶于液體介質中可用于殺菌，它們都作用于細胞膜和細胞質，但在具體作用機理上有所差別。臭氧具有較高的氧化電位（2.07 eV），經鏈衰減可以產生羥自由基和ROS，主要攻擊細胞壁上的脂質、蛋白、酶以及胞內的酶和核酸，但關于臭氧分子與自由基在殺菌機制中哪一種為主要途徑并不明確。高壓二氧化碳作為“一般認為安全”、環(huán)境友好的新型殺菌技術，具有無毒、價格低廉、易于獲取的優(yōu)點。二氧化碳可以通過降低胞內外pH值、改變細胞膜流動性、影響酶促反應等方式提高殺菌效率。二氧化氯也是一種強氧化性氣體，作為氯氣的有效替代物，其活性為氯氣的2.5 倍，可通過改變細胞膜透性造成胞內物質外流導致細菌死亡，且不產生致癌物。

超聲波與氣體殺菌劑聯(lián)用產生協(xié)同效果的原因主要為超聲波促進了氣體與細菌的接觸或對細菌細胞的滲透。Yu Hang等采用超聲波（20 kHz、60 W）和質量濃度1、4 mg/L的二氧化氯聯(lián)合處理金黃色葡萄球菌生物被膜時均產生了明顯的協(xié)同效果，Yu Hang等認為一方面超聲波促進了二氧化氯對細菌的滲透作用；另一方面超聲波促進了二氧化氯氣體的均勻分布，為空化泡提供了更多成核位點，有利于局部升壓和熱點的產生。而超臨界二氧化碳與超聲波聯(lián)用時，超聲波的機械攪拌作用提高了二氧化碳的溶解度，導致細胞內pH值下降加快，從而加速細菌失活最終導致死亡。

3 超聲波聯(lián)合殺菌劑對殺菌效果的影響因素

3.1 殺菌劑的種類

殺菌劑種類不同，其殺菌機理也存在差異，故在超聲波與不同種類殺菌劑聯(lián)用時效果也有差異。?ístková等發(fā)現(xiàn)在5 種化學試劑和低頻超聲波處理朝井桿菌屬（）生物被膜的過程中，以過氧乙酸為主要成分的復配試劑單獨使用時效果最好，而聯(lián)用時，以二氧化氯為主要成分的復配試劑和超聲波顯示出更好的清除效果。Palanisamy等發(fā)現(xiàn)過氧化氫與超聲波的聯(lián)用效果優(yōu)于氫氧化鈉與超聲波的聯(lián)用效果。

3.2 超聲參數(shù)

超聲參數(shù)主要包括超聲頻率、超聲功率（或振幅）、作用時長。目前應用最多的超聲頻率為20 kHz，因為研究發(fā)現(xiàn)，在功率超聲條件下（頻率20～100 kHz、功率10～1000 W/cm），超聲波產生的剪切力等機械作用對細菌細胞有很強的破壞效果。一方面，功率超聲在傳播過程中會引起液體介質激烈振蕩；另一方面，功率超聲的空化效應會產生剪切力、沖擊波、微射流、湍流等機械作用，都會破壞細菌細胞。當超聲頻率一定時，超聲波對細菌的破壞效果隨功率增加、作用時間延長呈現(xiàn)增強的趨勢。如遲媛等聯(lián)合超聲波和次氯酸鈉處理腐敗菌，致死率隨著超聲功率、處理時長的增加而提高，且高功率下的聯(lián)合處理有顯著的協(xié)同殺菌效果，這可能是由于在一定范圍內超聲強度的增加增強了空化效應，提高了對細菌外層結構的破壞強度，促進次氯酸鈉直接作用于細菌而加速細菌死亡。可見，空化效應強度受超聲參數(shù)調節(jié)，對殺菌效率有重要影響，較好的殺菌效果需在施加聲壓高于空化閾值且空化效應較強時實現(xiàn)。許多研究表明，低頻超聲發(fā)生空化效應所需的空化閾值低于高頻超聲，低頻超聲條件下的殺菌效果也往往優(yōu)于高頻超聲。

3.3 細菌的特性

殺菌效果不僅取決于外界脅迫，還取決于細菌的特性，包括細胞形態(tài)和大小、基因型、細胞濃度、生長周期、膜結構等。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢比營養(yǎng)細胞、革蘭氏陽性細菌比革蘭氏陰性細菌、球狀細菌比桿狀細菌對外界環(huán)境刺激有更高的抗性。其中，芽孢有多層致密結構，具有較強的抗逆性，能在多種極端條件刺激下維持活性。革蘭氏陽性菌的細胞壁有一層較厚（20～80 nm）的肽聚糖層，不利于通過直接接觸方式起作用的殺菌技術發(fā)揮效果。革蘭氏陰性菌則有脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）和磷脂提供機械強度。不同大小的細菌對聯(lián)合處理有不同的耐受程度，如相比于常見的大腸桿菌，細胞更小的缺陷短波單胞菌（）對超聲波聯(lián)用超臨界二氧化碳處理的耐受性更低。通常不同尺寸的細菌耐受性也不同，尺寸大的細菌往往比尺寸小的細菌對超聲波更敏感，這可能是因為前者具有更大的表面積，因此受到更多的超聲作用。

殺菌效果還受細菌胞內信號傳導系統(tǒng)響應的影響。如在微氣泡存在下，低頻超聲與陽離子抗菌肽人β防御素聯(lián)用處理耐抗生素葡萄球菌，控制葡萄球菌生物被膜形成的基因表達提高，基因和基因表達被抑制，導致耐抗生素葡萄球菌生物被膜形成能力下降，抑菌效果提高。另外，細菌包膜應激響應（bacterial envelope stress responses，ESRs）系統(tǒng)也可影響殺菌效果。在革蘭氏陰性菌中定義了5 種ESRs，分別是（sigma factor）、Cpx（conjugative pilus expression）、Bae（bacterial adaptive respons）、Psp（phage shock protein）、Rcs（regulator of capsule synthesis）響應系統(tǒng)。然而，關于聯(lián)用后細菌基因水平變化的研究較少，仍需進一步探索從分子水平揭示聯(lián)用技術具有協(xié)同效果、無明顯作用或導致拮抗作用的機理，以及細胞的響應通路，為解決微生物安全問題提供更多參考。

3.4 介質的特性

液體介質通常為含水體系，超聲波的空化效應可引起水分子裂解，并借由液體的振動傳播能量，該過程中介質溫度上升，而溫度的變化可能會影響細菌細胞膜的狀態(tài)；殺菌劑則需以液體介質作為媒介接觸細菌達到殺菌效果，故介質的黏度、固形物含量、溫度等均會影響殺菌效果。介質黏度是表示流體流動時陰力大小的指標，當液體黏度高時，其傳質效率低，殺菌難度提高，效果變差。對于超聲空化而言，其強度受介質黏度影響，產生空化泡需要克服介質分子間力，若介質黏性較大，則難以產生空化。介質中含有的固形物除了有提高介質黏度不利于超聲波傳播外的特性外，細菌也可附著在大而粗糙的固形物表面，如果蔬的表面縫隙、與食品直接接觸的粗糙鋼材表面，更“隱蔽”的同時還能形成生物膜，降低殺菌劑與細菌的接觸概率及超聲波的作用效果。另外，介質中的固體微粒也可以為超聲波提供成核位點，提高空化活性，增強殺菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，牛乳中含有的乳糖有助于細菌合成滲透保護劑或通過結合自身的游離羥基與細菌細胞磷脂層的極性頭部而提高抗性。介質的酸堿性也會影響超聲波聯(lián)合殺菌劑的殺菌效果。當介質中酸性較強時，殺菌效率更高，如de Freitas等使用145.54 μmol/L乳酸鏈球菌素聯(lián)合超聲波處理志賀氏菌15 min，結果發(fā)現(xiàn)在pH 4.5時的殺菌效率高于在pH 6.5時的殺菌效率，這可能是低pH值影響了細菌細胞的穩(wěn)定性。另外，介質內含物還可以作為細菌損傷后的修復材料，包括已經死亡的個體也可以為活細胞提供養(yǎng)分，如Yamamoto等的研究表明在不添加營養(yǎng)物的條件下，大腸桿菌菌液（含10CFU/mL死菌和10CFU/mL活菌）25 ℃下1 d內活菌數(shù)可恢復至10～10CFU/mL，Yamamoto等認為這是因為活細胞吸收了死細胞。

4 超聲波聯(lián)合殺菌劑在食品工業(yè)中的應用

超聲波聯(lián)合殺菌劑在果蔬表面清洗、肉制品保鮮、乳制品殺菌等方面均有應用，表1整理了部分研究。在果蔬加工中，兩者聯(lián)用可有效去除農藥殘留，抑制多酚氧化酶、過氧化物酶和細胞壁降解酶的活性，穩(wěn)定細胞壁多糖，并除去表面微生物來減緩腐爛。Bal等用水楊酸（1 mmol/L）、超聲波（32 kHz）以及超聲波與水楊酸聯(lián)合處理甜櫻桃果實（10 min），貯藏40 d后腐爛率分別為13.5%、10.8%、3.8%，而對照組腐敗率高達24.4%。Mustapha等將超聲波分別與二氯異氰尿酸鈉、過氧乙酸、過氧乙酸、過氧化氫聯(lián)用，其中40 mg/L過氧乙酸、5%過氧化氫及超聲波聯(lián)用可使櫻桃番茄表面微生物對數(shù)值減少3.07～3.10（lg（CFU/g））。同樣地，超聲波與殺菌劑也可用于肉類表面除菌，同時，超聲波還可以起到肉嫩化的作用。乳制品中牛奶常被作為研究對象，微生物可以附著在脂肪球上而增加殺菌難度，聯(lián)合技術可以有效滅活牛奶中的微生物群。如Shamila-Syuhada等將5 種腐敗菌、致病菌接種至牛奶中（初始菌量約為8.1（lg（CFU/mL））），采用超聲波（24 kHz、125 μm振幅）和過氧化氫（質量分數(shù)0.01%）聯(lián)用處理10 min即可殺滅接種菌，最大程度維持牛奶品質。食品加工過程中涉及許多塑料管道、不銹鋼器材等，對這些表面的清潔也是食品質量安全控制的重要一環(huán)。Yu Hang等聯(lián)合超聲波（20 kHz、60 W）和二氧化氯（4 mg/L）用于清除4 種與食品直接接觸材料表面的金黃色葡萄球菌生物被膜，處理10 min后金黃色葡萄球菌失活率為99.03%，體現(xiàn)出協(xié)同效果（單獨超聲波處理為15.86%，單獨二氧化氯處理為82.62%），Yu Hang等發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理通過介導群體感應信號分子、細胞間黏附和多糖細胞間黏附素產生減少了生物被膜的形成，腸毒素的分泌也被抑制，且接觸材料表面越粗糙，聯(lián)合處理的生物被膜清除率越低。

表1 超聲波聯(lián)合殺菌劑殺菌的研究Table 1 Selected studies of microbial killing by combined treatment of ultrasound with bactericides

5 結 語

超聲波作為一項有潛力的非熱加工技術，具有綠色、無污染的特點，但在單獨使用時殺菌效果不理想，需要提高處理強度來彌補，高強度超聲下大量能量以熱能形式耗散造成浪費，也會縮短儀器壽命；殺菌劑應用廣泛，但也存在單獨使用滲透性不高、濃度高易產生有毒副產物等問題，而殺菌劑聯(lián)合超聲波進行殺菌處理，往往可以達到協(xié)同殺菌效果，既可以解決單獨超聲波殺菌效果不佳的問題，還可以彌補殺菌劑的不足。聯(lián)合殺菌技術目前雖已在果蔬表面清洗、肉制品保鮮、乳制品殺菌方面有一定的應用，但是由于其提高了體系的復雜程度，目前對協(xié)同殺菌機理的研究并不深入，導致其應用受限，在今后的研究中可以下列工作為重點：1）明確微生物的應急響應機制，結合基因組學、轉錄組學、蛋白組學等多組學對聯(lián)合技術影響微生物的分子機制進行整合分析；2）明確超聲波空化效應的動力學，優(yōu)化超聲波空化參數(shù)，實現(xiàn)空化程度精確調控，既可以明確在殺菌效果中空化效應所占比重，又可以為實現(xiàn)工業(yè)化生產提供技術參考；3）確定通用的基礎細菌模型、統(tǒng)一的關鍵殺菌技術參數(shù)，使各項研究結果之間能夠互相比較，并整合結果建立數(shù)據庫，為創(chuàng)建新的殺菌模型提供數(shù)據支持；4）開展在食品基質中的實際應用實驗，明確聯(lián)合技術與食品基質之間的相互作用關系，為工業(yè)化應用提供依據。