張雪嬌

（鐵嶺市檢驗檢測認證服務中心，遼寧 鐵嶺 112000）

鹽酸克倫特羅是一種β受體激動劑類藥物[1]，臨床上多用于治療哮喘病，因其兼具促進畜禽生長、改善畜禽瘦肉比例等[2-3]功能而應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中。鹽酸克倫特羅在畜禽體內殘留，人食用畜禽產品后會引起心悸、惡心、高血壓、心律失常等癥狀，嚴重者甚至導致死亡[4]。因此，我國規(guī)定嚴禁在飼料中添加鹽酸克倫特羅。

劉文光[5]建立了包括克倫特羅在內的16種β-受體激動劑類藥物在豬、牛、羊毛發(fā)及尿液中的超高效液相色譜串聯(lián)質譜的多殘留檢測方法。周小清等[6]建立了中空纖維膜三相液相微萃取富集濃縮豬尿及牛奶中的痕量鹽酸克倫特羅，后續(xù)采用高效液相色譜/紫外對其進行定量分析。周珊珊等[7]驗證了ELISA方法檢測豬尿中克倫特羅殘留量的可行性，結果顯示，此方法的定性檢出限為0.147 μg/L，定量檢出限為0.490 μg/L；添加0.5、1.0、5.0 μg/L的克倫特羅標準液的變異系數(shù)分別為2.29%、6.97%、2.73%，平均回收率分別為91.8%、102.4%、99.7%。王麗娜等[8]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法并對克倫特羅在絨山羊體內殘留消除規(guī)律進行了研究，結果顯示，停藥40 d后，兩試驗組殘留量均降至10 μg/L以下，肝臟含量約33 μg/kg，腎臟約5 μg/kg，其余組織均未檢出。本試驗研究了不同給藥濃度的鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液和主要組織中的殘留規(guī)律，以期為相關研究及畜產品安全監(jiān)管工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗從300只健康的遼寧絨山羊群中隨機選取66只體重約30 kg、發(fā)育正常、中等體況的絨山羊，在遼寧省內某縣絨山羊場內飼養(yǎng)。

1.2 試驗材料

鹽酸克倫特羅粉劑（執(zhí)法部門辦案罰沒）。

主要儀器：超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀（waters Quattro premier XE）、高速冷凍離心機（Thermo Fisher公司）、固相萃取儀（J.T baker公司）、旋轉蒸發(fā)儀（BUCHI公司）、超純水器（Millipore公司）、渦旋儀（北京昊諾斯科技有限公司）；恒溫振蕩器（金壇市中大儀器廠）；分析天平（感量分別為0.01、0.000 1 g）、OA-SYS氮吹儀、PRO250均質器等。

主要試劑：甲醇、甲酸、氨水、高氯酸、MCX固相萃取小柱等。

1.3 試驗設計

66只試驗絨山羊中隨機抽取6只作為對照組，其余60只隨機分為A組和B組，每組設10個重復，每個重復3只。每個重復編號與絨山羊的耳標號相對應。

各組均為常規(guī)方式圈養(yǎng),飼喂配合日糧，自由飲水。對照組飼喂不含鹽酸克倫特羅的日糧，自由采食；A組每日15：00飼喂添加150 μg/kg·BW鹽酸克倫特羅的日糧，B組飼喂添加300 μg/kg·BW鹽酸克倫特羅的日糧，兩試驗組均在飼喂添加鹽酸克倫特羅日糧前停食3 h，保證絨山羊將含藥日糧全部吃下，連續(xù)給藥25 d后停藥。停藥后飼喂正常日糧。

試驗共60 d，分為兩階段：第一階段為給藥期25 d，第二階段為停藥期35 d。

1.4 試驗方法

本試驗中尿液及各組織樣本中鹽酸克倫特羅含量的檢測，均采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-10]。

1.4.1 尿液采集

于飼喂鹽酸克倫特羅24 h后，A組、B組各隨機選取6只絨山羊，整個試驗期內每天采集尿液進行鹽酸克倫特羅檢測；對照組6只絨山羊全部采集尿液，進行鹽酸克倫特羅檢測，不足6只時全部采集。

1.4.2 組織樣品采集

分別在停藥的第1、3、5、7、10、15、20、25、30、35 d，于A組和B組中各隨機選取3只絨山羊宰殺，取肝臟、肺臟、腎臟、肌肉等4種組織樣品，每種組織采樣量250 g左右，對肝臟、肺臟、腎臟、肌肉中鹽酸克侖特羅殘留進行檢測。

2 結果與分析

2.1 給藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度（見表1）

給藥階段同時檢測對照組絨山羊，結果顯示，對照組絨山羊尿液均未檢出鹽酸克倫特羅殘留。

由表1可知，A組和B組均在飼喂24 h內于尿液中檢測到鹽酸克倫特羅。隨著飼喂天數(shù)增加，鹽酸克倫特羅在絨山羊體內的不斷地吸收和代謝，絨山羊體內鹽酸克倫特羅殘留量隨之增加，鹽酸克倫特羅在尿液中的檢出濃度呈逐漸上升的趨勢。

表1 飼喂階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度Tab.1 Residual concentration of clenbuterol hydrochloride in cashmere goat urine during administration 單位：μg/L

A組在飼喂藥物后第10 d，尿液中鹽酸克倫特羅濃度達到第一次峰值為5 324 μg/L，之后呈較平穩(wěn)的態(tài)勢；在飼喂后第21 d出現(xiàn)第二次峰值，為3 868 μg/L。B組在給藥24 h內尿液中鹽酸克倫特羅濃度即達到1 332 μg/L；飼喂后第9 d，尿液中濃度達到第一次峰值，為1 1487 μg/L；之后尿液中鹽酸克倫特羅濃度也呈較平穩(wěn)的變化趨勢，于飼喂后第22 d出現(xiàn)第二次峰值6 889 μg/L，之后尿液中鹽酸克倫特羅的濃度逐漸降低。

2.2 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度（見表2）

停藥后35 d內每天檢測對照組絨山羊尿液中鹽酸克倫特羅殘留的濃度，結果顯示仍未檢出。

由表2可知，停藥后，兩試驗組絨山羊尿液中殘留的鹽酸克倫特羅濃度持續(xù)降低，至第35 d后，A組殘留濃度約6 μg/L，B組殘留濃度約9 μg/L。同一時間點A組中出現(xiàn)個別鹽酸克倫特羅殘留濃度大于B組,應由絨山羊個體差異和采食不均導致。

表2 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊尿液中的殘留濃度Tab.2 Residual concentration of clenbuterol in cashmere goat urine during drug withdrawal 單位：μg/L

2.3 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊不同組織中的殘留濃度（見表3）

停藥后第1、35 d，對照組各宰殺3只絨山羊，采集肝臟、肺臟、腎臟、肌肉4種組織，進行鹽酸克倫特羅殘留檢測。結果顯示，對照組絨山羊的4種組織中均未檢出鹽酸克倫特羅。

由表3可知，停藥后第30 d，兩試驗組絨山羊肝臟中仍可檢出鹽酸克倫特羅殘留，B組肌肉中檢出量為2 μg/kg；停藥后第35 d，兩試驗組絨山羊除肝臟中仍可檢出鹽酸克倫特羅殘留外，其他組織殘留濃度均為0。

表3 停藥階段鹽酸克倫特羅在絨山羊不同組織中的殘留濃度Tab.3 Residual concentrations of clenbuterol in different tissues of cashmere goats during drug withdrawal 單位：μg/kg

3 討論

3.1 尿液中鹽酸克倫特羅消長規(guī)律

本研究中，飼喂鹽酸克倫特羅后24 h后，A組、B組絨山羊尿液中均即可檢出鹽酸克倫特羅殘留。在給藥階段，兩組絨山羊尿液中鹽酸克倫特羅濃度始終保持在較高水平；停藥后鹽酸克倫特羅殘留濃度隨時間推移呈逐漸下降趨勢，但消除速度緩慢，停藥35 d后尿液中仍可檢出。結果表明，活體采集尿液監(jiān)測是一種有效的監(jiān)管手段。

本研究在絨山羊尿液中檢測到高濃度的鹽酸克倫特羅殘留，表明尿液是鹽酸克倫特羅排泄的主要途徑[11]，絨山羊體內吸收的鹽酸克倫特羅濃度越高，尿液中排出的鹽酸克倫特羅殘留量越高。飼喂開始后，鹽酸克倫特羅在體內開始吸收、分布、代謝、排泄。第一個峰值出現(xiàn)是由于鹽酸克倫特羅吸收出現(xiàn)飽和，大量鹽酸克倫特羅排泄到尿液中；隨后β-受體數(shù)量和結合位點增多，產生應激現(xiàn)象，使尿液中鹽酸克倫特羅濃度降低。第二個峰值出現(xiàn)是由于組織中鹽酸克倫特羅開始排泄，大量鹽酸克倫特羅直接排泄到尿液中。此外，重復多次飼喂鹽酸克倫特羅可在絨山羊體內造成蓄積，導致給藥第25 d后，尿液中鹽酸克倫特羅的殘留量高于喂藥后第1 d的殘留量。

3.2 鹽酸克倫特羅在組織中消除規(guī)律

本試驗結果表明，肝臟是絨山羊鹽酸克倫特羅殘留濃度最高的組織，其殘留量顯著高于腎臟、肺臟和肌肉組織。在停藥階段，4種組織中的鹽酸克倫特羅殘留濃度均呈下降趨勢，其中腎臟、肺臟和肌肉的殘留濃度下降很快，肝臟中鹽酸克倫特羅代謝較慢，至試驗結束時仍可檢出。受試驗條件限制，本研究未能測試出停飼鹽酸克倫特羅后什么時間可在絨山羊體內代謝完全，仍有待進一步研究。此外，有研究表明，鹽酸克倫特羅在眼睛中蓄積量最大[12]，但在實際工作中，監(jiān)管采樣環(huán)節(jié)采集眼睛樣本比較困難，故主要將肝臟作為監(jiān)管檢測的靶組織。

4 結論

本試驗結果表明，飼喂含不同濃度鹽酸克倫特羅的日糧1 d后均可在尿液中檢測到鹽酸克倫特羅殘留；飼喂25 d及停藥后1 d，在肝臟、腎臟、肺臟、肌肉4種組織中均可檢出鹽酸克倫特羅殘留。各組織中鹽酸克倫特羅殘留量差異顯著，以肝臟中含量最高，肌肉中含量最低。

鹽酸克倫特羅在4種組織中消除的速度各不相同，在停藥第30 d后，兩試驗組腎臟、肺臟和肌肉中鹽酸克倫特羅殘留濃度基本降至0，肝臟中仍有較高濃度殘留。4種組織中，鹽酸克倫特羅在肝臟中消除最慢。因此，肝臟可作為監(jiān)管監(jiān)測的靶組織。