梁玉潔，鄒俊波，張小飛，彭 磊，張 雪，陳志澤，郭東艷，楊艷君，周 曉，劉 琳，史亞軍*，雷根平

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院，咸陽 712046

潤(rùn)肺寧神方由當(dāng)歸、生白芍、柴胡、茯神、炒白術(shù)、炙百部、合歡皮、川芎、酸棗仁、知母與炙甘草11種藥材組成，用于治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)引起的失眠。處方中當(dāng)歸、甘草為君藥，具有抗抑郁、平喘[1-2]的功效；合歡皮、柴胡為臣藥，具有鎮(zhèn)靜催眠抗抑郁、抗失眠[3-4]的功效，酸棗仁養(yǎng)血安神、平肝理氣，善治虛煩不眠[5]。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)潤(rùn)肺寧神方進(jìn)行分析，并探討其治療COVID-19致失眠的機(jī)制，為其今后的治療提供參考。

1 方法

1.1 藥材成分靶點(diǎn)篩選

在TCMSP平臺(tái)(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)以類藥性(DL)和生物利用度(OB)作為篩選條件，檢索白術(shù)、柴胡、川芎、當(dāng)歸、茯神、甘草、合歡皮、生白芍、酸棗仁、知母和炙百部的潛在成分和靶點(diǎn)信息，以Batman(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)和CTD(https://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)作為補(bǔ)充，檢索藥材其余靶點(diǎn)信息。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

以“Sleep Initiation and Maintenance Disorders”、“COVID-19”為關(guān)鍵詞在Disgenet、GeneCards、CTD和Malacards數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET、https://www.genecards.org、https://ctdbase.org、https://www.malacards.org)搜索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥5.04、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥25.04為篩選條件，得到失眠相關(guān)的靶點(diǎn)信息，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集的靶點(diǎn)去重，得到失眠的相關(guān)基因。在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥6為篩選條件，得到COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)信息，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集的靶點(diǎn)去重，得到COVID-19的相關(guān)基因。

1.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)導(dǎo)入22個(gè)疾病刪去重復(fù)值的靶點(diǎn)，取交集，得到兩者共有靶點(diǎn)。導(dǎo)入藥材和2個(gè)疾病交集靶點(diǎn)，取交集，得到疾病和藥材共有靶點(diǎn)。在Excel表格中建立成分-靶點(diǎn)、疾病-靶點(diǎn)關(guān)系表，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1軟件，構(gòu)建出成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將Cytoscape篩選出的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)上(https://string-db.org/)，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。用Cytoscape 3.2.1軟件，導(dǎo)入蛋白相互作用.tsv文件，用度值篩選出潤(rùn)肺寧神方治療失眠的核心靶點(diǎn)。

1.5 GO分析和KEGG通路富集

在R軟件平臺(tái)安裝Cluster Profiler軟件包，對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析，再利用R平臺(tái)構(gòu)建交互網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對(duì)接

在處方治療COVID-19致失眠的網(wǎng)絡(luò)圖中選取5個(gè)核心靶點(diǎn)，用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)找出Score值靠前的靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，配體是對(duì)應(yīng)于靶點(diǎn)的化合物。在Drugbank平臺(tái)(https://go.drugbank.com/)找到靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的陽性藥并在Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載陽性藥物和靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)化合物的2D結(jié)構(gòu)，將靶點(diǎn)3D結(jié)構(gòu)、陽性藥2D結(jié)構(gòu)和對(duì)應(yīng)化合物導(dǎo)入Discovery Studio，用DOCK ligand(libDock)進(jìn)行分子對(duì)接，得到靶點(diǎn)、陽性藥和化合物的相互關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥材成分靶點(diǎn)篩選結(jié)果

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果得到潤(rùn)肺寧神方中共有藥材成分349種，其中白術(shù)17種、柴胡17種、川芎11種、當(dāng)歸120種、茯神5種、甘草92種、合歡皮15種、生白芍13種、酸棗仁12種、知母15種和炙百部32種。11種藥材去除重復(fù)值后包括靶點(diǎn)1 904個(gè)。

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

失眠靶點(diǎn)在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥5.04為條件找到相關(guān)靶點(diǎn)176個(gè)；在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥25.04為條件找到相關(guān)靶點(diǎn)1 208個(gè)；Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)中找到15個(gè)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)去除重復(fù)靶點(diǎn)后共有1 337個(gè)。COVID-19靶點(diǎn)在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)找到339個(gè)；在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以Score≥6為條件找到相關(guān)靶點(diǎn)1 250個(gè)；在Malacards數(shù)據(jù)庫(kù)中找到10個(gè)，3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)去除重復(fù)靶點(diǎn)后共有1 505個(gè)。將2個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0作圖，共有交集靶點(diǎn)404個(gè)，見圖1，疾病與藥材交集250個(gè)，見圖2。

圖1 疾病與疾病之間的共同靶點(diǎn)

圖2 疾病與藥材之間的共同靶點(diǎn)

2.3 成分-靶點(diǎn)-藥材網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將成分-靶點(diǎn)、疾病-靶點(diǎn)關(guān)系表導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中，用Network Analyer計(jì)算出平均值為9.358，取平均值和最大值為區(qū)間，選出核心靶點(diǎn)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-藥材網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖包括節(jié)點(diǎn)138個(gè)，邊線969條，見圖3。由圖3可知處方治療COVID-19致失眠為多成分、多靶點(diǎn)的聯(lián)合作用。

圖3 成分-靶點(diǎn)-藥材網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析

將藥材和疾病的共同靶點(diǎn)上傳至String中，Organism設(shè)置為Homo sapiens，得蛋白與蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4，該網(wǎng)絡(luò)有59個(gè)節(jié)點(diǎn)、671條相互作用關(guān)系，平均度值22.7。下載PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù).tsv文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1中以Degree值排序，選出平均度值大于22.746的核心靶點(diǎn)33個(gè)，見圖5，節(jié)點(diǎn)越大表示其相關(guān)性越強(qiáng)、越重要。其中最為重要的有AKT1、INS、TP53、IL-6、JUN、CASP3、TNF、CAT、PTGS2和CXCL8等。

圖5 靶點(diǎn)與靶點(diǎn)相互關(guān)系

2.5 GO分析和KEGG通路富集分析

用R語言的Cluster Profiler軟件執(zhí)行GO和KEGG，共富集并排列了2 430條路徑，其中KEGG有170條路徑，前10條路徑見表1。COVID-19致失眠病理發(fā)展與人類巨細(xì)胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路等有關(guān)。見圖6和表2，可以了解到這些路徑上的靶點(diǎn)如ATK1、RELA、IL1B、CXCL8和CASP3等是同時(shí)作用于許多不同的路徑。通過Cluster Profiler軟件包構(gòu)建圍棋交互網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)反映了圍棋術(shù)語之間的關(guān)系，見圖7，圓點(diǎn)顏色越紅越大表示該路徑與病理發(fā)展越明顯。

表1 KEGG通路富集前10條路徑

圖6 疾病、藥材靶點(diǎn)的KEGG相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 數(shù)字所表示的靶點(diǎn)

圖7 核心靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

GO分析可分為細(xì)胞組分(cellularcomponent, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物過程(biological process, BP)3部分。GO分析結(jié)果在生物過程中富集2 114條路徑，在細(xì)胞組分中富集41條路徑，在分子功能上富集了105條路徑，表3列舉了前10條路徑。

表3 GO分析BP、CC、MF前10條路徑

表3(續(xù)) GO分析BP、CC、MF前10條路徑

2.6 分子對(duì)接分析

為進(jìn)一步研究機(jī)制，選取網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的5個(gè)核心靶點(diǎn)PTGS2、AR、PPARG、NOS2和HSP90AA1，并將靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的化合物進(jìn)行分子對(duì)接，得分越高表示其結(jié)合活性越高，結(jié)果見表4。其中PTGS2與β-谷甾醇、AR與1-甲氧基菜豆素、PPARG與1-甲氧基菜豆素、NOS2與3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定以及HSP90AA1與脫水淫羊藿素結(jié)合活性高。用Discovery Studio進(jìn)行陽性藥物驗(yàn)證和分子對(duì)接，并選取表4中得分最高的化合物與陽性藥物比較，結(jié)果見表5。核心靶點(diǎn)與核心成分、陽性藥物的對(duì)接結(jié)果見圖8，可以看出，5個(gè)核心靶點(diǎn)與核心成分對(duì)接的得分結(jié)果均高于與陽性藥物的分?jǐn)?shù)。

表4 核心靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化合物結(jié)合活性得分

表4(續(xù)) 核心靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化合物結(jié)合活性得分

表5 核心靶點(diǎn)與核心成分、陽性藥物的結(jié)合活性得分對(duì)比

注：A.PTGS2-塞來昔布；B.PTGS2-β-谷甾醇；C.AR-7-羥基-4-甲基-3-(2-羥基乙基)香豆素；D.AR-1-甲氧基菜豆素；E.PPARG-二十碳五烯酸；F.PPARG-1-甲氧基菜豆素；G.NOS2-瓜氨酸；H.NOS2-3′-羥基-4′-O-甲基光甘草定；I.HSP90AA1-格爾德霉素；J.HSP90AA1-脫水淫羊藿素。

3 討論

由新型冠狀病毒感染所致的COVID-19具有傳染性強(qiáng)、傳播迅速、死亡率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康[6]。疫情爆發(fā)后，雷根平院長(zhǎng)作為陜西援鄂抗疫中醫(yī)醫(yī)療隊(duì)隊(duì)長(zhǎng)，在江夏方艙醫(yī)院開展抗疫工作，提出了分別針對(duì)COVID-19病人不同癥狀的江夏系列方，用過處方的大多數(shù)患者癥狀都有了顯著改善。

國(guó)際疾病分類第十版將失眠定義為睡眠啟動(dòng)和維持障礙以及早醒[7]。中醫(yī)認(rèn)為引起失眠的原因是陰衰陽盛、心脾肝腎氣血不足[8]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用多種生物學(xué)信息庫(kù)以及Cytoscape軟件等構(gòu)建了潤(rùn)肺寧神方和失眠的成分-靶點(diǎn)-藥材網(wǎng)絡(luò)和靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和重要通路進(jìn)行富集分析。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，潤(rùn)肺寧神方成分主要集中在人類巨細(xì)胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、AKT1、INS、TP53、IL6、JUN、CASP3、TNF、CAT、PTGS2和CXCL8等通路或靶點(diǎn)。

人類巨細(xì)胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)與機(jī)體免疫功能和神經(jīng)功能相關(guān)[9-10]，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)與血管損傷、炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化息息相關(guān)，通路激活可導(dǎo)致活性氧過量產(chǎn)生、NF-κB活化、黏附分子和細(xì)胞因子表達(dá)增加[11]，NF-κB可使IL-6和TNF-α釋放增加。ATK1是一組蛋白質(zhì)合成信號(hào)靶蛋白，通過評(píng)估發(fā)現(xiàn)，AKT1可通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路增加肌蛋白合成，恢復(fù)呼吸肌，還可抑制AKT磷酰化，減少支氣管平滑肌增殖，從而減輕氣道重塑[12-13]。ATK1參與代謝、增殖、生長(zhǎng)以及血管的生成等過程的調(diào)節(jié)。研究表明AKT1多態(tài)性在漢族人抑郁癥、焦慮癥方面起重要作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，被流感病毒感染的肺部，致炎因子激活中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，釋放TNF炎性細(xì)胞因子使機(jī)體發(fā)生炎性細(xì)胞反應(yīng)和組織損傷。TNF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)分泌并促使白細(xì)胞與之黏著，還能激活間質(zhì)組織蛋白水解酶的釋放及中性粒細(xì)胞的聚集，從而發(fā)揮治療疾病作用[15]。TNF-α為參與炎癥過程的關(guān)鍵因子之一，參與機(jī)體免疫、炎癥反應(yīng)、抗腫瘤、神經(jīng)元調(diào)控等過程，是免疫和神經(jīng)系統(tǒng)的連接信使，通過炎癥因子的釋放可以使免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)睡眠，失眠可導(dǎo)致體內(nèi)TNF-α含量變高，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)TNF-α含量可以改善睡眠。IL-6是具有抗炎和促炎功能的細(xì)胞因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理損害過程和促進(jìn)大腦釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子上均發(fā)揮作用。IL-6在人體的分泌與睡眠規(guī)律一致，與睡眠的正常密切相關(guān)[16]。IL-6還可誘導(dǎo)T細(xì)胞分化，促進(jìn)炎性誘導(dǎo)因子釋放，參與肺炎病理過程[17]。

為了進(jìn)一步說明靶點(diǎn)蛋白與其配體化合物的結(jié)合活性，選取潤(rùn)肺寧神方治療COVID-19致失眠網(wǎng)絡(luò)圖中度值前5個(gè)靶點(diǎn)PTGS2、AR、PPARG、NOS2與HSP90AA1。在DrugBank中找到靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的5個(gè)陽性化合物塞來昔布、7-羥基-4-甲基-3-(2-羥基乙基)香豆素、二十碳五烯酸、瓜氨酸和格爾德霉素。靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分化合物是該靶點(diǎn)的配體。分子對(duì)接結(jié)果表明蛋白與配體的結(jié)合活性高于陽性藥的得分。在這些核心靶點(diǎn)中，PTGS2參與前列腺素E2生產(chǎn)的重要過程，前列腺素E2在運(yùn)動(dòng)性調(diào)節(jié)、增殖、抗凋亡等方面發(fā)揮重要作用，可在炎癥因子的誘導(dǎo)下增加表達(dá)量。PPARG是過氧化物酶體增殖物激活受體亞家族的成員，該基因編碼的蛋白質(zhì)參與免疫、炎癥等過程[18]。HSP90AA1蛋白在抑郁患者中表達(dá)增加[19]。作為一氧化氮合酶的NOS2表達(dá)異常時(shí)可使NO含量升高，啟動(dòng)機(jī)體氧化應(yīng)激，加重炎癥反應(yīng)[20]。

有證據(jù)表明，山柰酚對(duì)急性肺損傷等炎性癥狀有潛在的治療作用[21]。山柰酚、槲皮素均有鎮(zhèn)靜、催眠作用[22-23]。槲皮素可以通過抑制炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，抑制TNF-α降低炎癥水平[24]。異鼠李素具有抗炎作用，可通過抑制TNF-α、IL-6發(fā)揮保護(hù)急性肺損傷的作用[25]。β-谷甾醇可抑制TNF-α的生成與釋放發(fā)揮抗炎作用[26]。β-谷甾醇可以順利透過血腦屏障，沉積于腦細(xì)胞膜上。還可通過增加去甲腎上腺素、5-羥色胺及其代謝產(chǎn)物改善抑郁癥狀[27]。

綜上所述，潤(rùn)肺寧神方治療COVID-19致失眠的機(jī)制可能是通過槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇等化學(xué)成分作用于IL-6細(xì)胞因子、抑制TNF-α的釋放等。推測(cè)潤(rùn)肺寧神方通過抑制IL-6、抑制TNF-α等發(fā)揮治療COVID-19致失眠的作用。預(yù)測(cè)了處方治療疾病的潛在靶點(diǎn)和生物過程及其機(jī)制。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，后期仍需對(duì)COVID-19致失眠及其相關(guān)治療藥物進(jìn)行全面深入地研究。