梅端果，方 芳，蒲小春

（1.愛優(yōu)諾營(yíng)養(yǎng)品有限公司，江西九江 332000；2.美廬生物科技股份有限公司，江西九江 332000）

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是一種醫(yī)用食品，主要應(yīng)用于術(shù)后恢復(fù)期、消化吸收障礙或患有特定疾病的人群，其在減少感染、糾正代謝失衡、增強(qiáng)各種治療手段的效果、促進(jìn)康復(fù)等方面具有重要意義[1-3]。氨基酸作為人體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸的測(cè)定對(duì)于食品營(yíng)養(yǎng)成分的評(píng)價(jià)具有重要意義。食物中含硫氨基酸的含量是蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，也是食品氨基酸模式的重要評(píng)價(jià)因素[4-6]。研究表明，含硫氨基酸具有防止褐變、調(diào)節(jié)風(fēng)味、改善質(zhì)地等食品感官作用，同時(shí)在生理調(diào)節(jié)功能方面有抗氧化、拮抗化學(xué)致癌物和解除蛋白酶抑制劑等功效[7]。因此，在特醫(yī)食品領(lǐng)域?qū)虬被岬臏?zhǔn)確測(cè)定具有重大意義。

目前，針對(duì)含硫氨基酸在常規(guī)水解中的不穩(wěn)定性和易氧化性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者為能準(zhǔn)確測(cè)定含硫氨基酸進(jìn)行了大量的研究。于淑新等[8]采用高效液相色譜法測(cè)定飼料中的含硫氨基酸；蒲云月[9]采用氨基酸分析儀法測(cè)定奶粉中的含硫氨基酸；楊元秀等[10]采用氨基酸分析儀測(cè)定飼料及其原料中的含硫氨基酸；熊南安等[11]采用反向高效液相色譜法檢測(cè)污泥中含硫氨基酸。本文建立了一種采用氧化水解的樣品處理方法并用全自動(dòng)氨基酸分析儀分析含硫氨基酸的檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確，能有效地減少胱氨酸和蛋氨酸的損耗，適用特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中含硫氨基酸的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：特殊醫(yī)學(xué)用途蛋白組件配方食品；麥芽糊精。

試劑：L-磺基丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（BePure，純度99.3%）；L-蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)sigma公司，純度100%）；30%雙氧水（光華科技，AR）；鹽酸（西隴科學(xué)，GR）；甲酸（光華科技，AR）；苯酚（西隴科學(xué)，AR）；氫氧化鈉（光華科技，AR）；偏重亞硫酸鈉（上海展云，AR）；日立茚三酮溶液；氨基酸分析儀PH系統(tǒng)緩沖液（KANTO）；一級(jí)水。

1.2 儀器設(shè)備

LA-8080高速氨基酸分析儀（日立）：茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀及570 nm和440 nm光度檢測(cè)器；SQP分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量0.01 mg）；BSA224S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量0.1 mg）；PHS-3C雷磁PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；QYYS-10A純水儀（重慶前沿水處理設(shè)備有限公司）；101-3A電熱鼓風(fēng)恒溫箱（上海錦屏）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 方法原理

樣品中的含硫氨基酸用過甲酸氧化和鹽酸溶液水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，經(jīng)離子交換色譜法分離，茚三酮柱后衍生，分光光度法檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.3.2 色譜條件

脫氨柱：4.6 mm×60 mm（填料#2622SC）（P/N 855-4506）；pH系統(tǒng)分析柱：4.6×40 mm（填料#2650L）（P/N 855-3523）；檢測(cè)波長(zhǎng)：570 nm和440 nm；進(jìn)樣量：20 μL；梯度洗脫及程序設(shè)定見表1。

表1 梯度洗脫及程序

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）磺基丙氨酸-蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制。準(zhǔn)確稱取磺基丙氨酸105.7 mg和蛋氨酸砜113.3 mg，加水溶解并定容至250 mL，濃度均為2.50 μmol·mL-1。

（2）混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00 mL置于50 mL容量瓶中，以0.02 mol·L-1鹽酸定容至刻度，混勻。磺基丙氨酸及蛋氨酸砜濃度均為50 nmol·mL-1。

1.3.4 樣品前處理

稱取試樣50～75 mg（約含蛋白質(zhì)7.5～25.0 mg，精確至0.1 mg），置于20 mL試管中，于冰水浴中冷卻30 min后加入已冷卻的過甲酸溶液（將過氧化氫+甲酸=1+9，混合，并按每毫升添加5 mg比例加入苯酚，于室溫放置1 h，置冰水浴中冷卻30 min，臨用現(xiàn)配）2 mL，加液時(shí)需將樣品全部潤(rùn)濕，但不要搖動(dòng)，蓋好瓶塞，連同冰浴一同置于0～4 ℃冰箱中，反應(yīng)16 h，實(shí)驗(yàn)做2個(gè)平行。

向反應(yīng)液中加入偏重亞硫酸鈉溶液0.5 mL，充分混勻后，直接加入鹽酸溶液17.5 mL置于110 ℃±2 ℃恒溫箱中水解，水解22～24 h。（注意：在水解開始時(shí)，不要封安瓿瓶瓶口，或旋動(dòng)水解管的管帽，待水解1 h后再封口或旋緊管帽，否則容易引起水解管爆裂）。取出安瓿瓶或水解管，冷卻，用水將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液中和至pH約2.2，并稀釋上機(jī)用0.02 mol·L-1鹽酸定容，離心，取上清液供儀器測(cè)定用。

2 結(jié)果與分析

2.1 特征峰的選擇

將濃度為2.5 μmol·mL-1的磺基丙氨酸及蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣分析，同時(shí)將濃度為50 nmol·mL-1磺基丙氨酸-蛋氨酸砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，進(jìn)行峰定位。磺基丙氨酸及蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1～圖3。

圖1 磺基丙氨酸色譜圖

圖2 蛋氨酸砜色譜圖

圖3 50 nmol·mL-1磺基丙氨酸-蛋氨酸砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 線性范圍及檢出限

按1.3.3步驟配制濃度分別為0 nmol·mL-1、10 nmol·mL-1、20 nmol·mL-1、50 nmol·mL-1、100 nmol·mL-1和200 nmol·mL-1的磺基丙氨酸-蛋氨酸砜混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)樣分析，以磺基丙氨酸（蛋氨酸砜）的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物含量為該化合物的檢出限，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物含量為該化合物的定量限。磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜都具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r值均大于0.999。

表2 磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.3 重復(fù)性與回收率

向本底中分別添加1 μmol、2 μmol和4 μmol的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行做6組，按1.3.4處理樣品并分析。由表3可知，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的回收率在95.2%～100.6%，RSD在1.1%～2.0%。該方法回收率較高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，重復(fù)性較好以及適用性較好。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 正確度

選用特殊醫(yī)學(xué)用途蛋白組件配方食品測(cè)定含硫氨基酸，同時(shí)送第三方機(jī)構(gòu)SGS進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表4。由表4可知，本中心與SGS的檢測(cè)偏差均小于10%，其方法正確度較好。

表4 正確度檢測(cè)結(jié)果匯總

3 結(jié)論

本文闡述了特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中含硫氨基酸的測(cè)定方法，采用氧化水解的前處理方法，極大地減少了含硫氨基酸的損耗，并用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行分析，既簡(jiǎn)便又快捷。本文建立的含硫氨基酸測(cè)定方法線性良好、方法回收率高、精密度好以及正確度較好，能高效、準(zhǔn)確地檢測(cè)特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中含硫氨基酸，使檢測(cè)值更接近真實(shí)值。