張 絨，陳仲婷，劉賢釗，李慧芳

（無限極（中國）有限公司，廣東江門 529100）

許多中草藥能夠抑制微生物的生長，在不同配比的中草藥產(chǎn)品中，抑菌成分和作用程度各不相同，有抑菌成分時可能會導致供試品中的微生物無法檢出[1]。為消除抑菌成分的影響，需對不同產(chǎn)品建立適宜的微生物限度檢查方法。

本研究針對含有中草藥陳皮、茯苓等成分的保健食品樣品通過人為加入標準菌株，參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部通則（1105）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查[2]，對該樣品進行計數(shù)方法適用性試驗，以建立適宜的微生物限度檢查方法，保證檢驗方法的科學及準確性，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品含中草藥成分陳皮、茯苓片劑（21J05AAB01、21J05ABB01、21J05ACB01）。

1.1.2 試驗培養(yǎng)基及試劑

平板計數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司、北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；孟加拉紅瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司、北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；無菌生理鹽水（氯化鈉，AR，廣州化學試劑廠）；中和劑1：含3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉的PBS溶液；中和劑2：D/E中和肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；中和劑3：含3%吐溫+1%甘氨酸+1%硫代硫酸鈉的PBS溶液。

1.1.3 試驗菌株

金黃色葡萄球菌ATCC 653、銅綠假單胞菌ATCC 27853、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、白色念珠菌ATCC 10231和黑曲霉ATCC 16404，均來源于廣東省微生物菌種保藏中心（國家專利菌種保藏平臺）。

1.1.4 試驗設(shè)備及耗材

（1）設(shè)備：超凈工作臺（VS-1300-U）、生物安全柜（BSC-1300-II-B1）、生化培養(yǎng)箱（BF400）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-Ⅱ）、恒溫水浴箱（DK-S14）、均質(zhì)器（Pulisifier）、振蕩器（MS 3-basic）、移液器及無菌吸頭（Eppendorf）。

（2）耗材：無菌三角瓶、無菌培養(yǎng)皿和無菌試管均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 方法適用性試驗

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[3]和《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）[4]進行試驗。

（1）樣品制備。25 g樣品加入225 mL稀釋液（或含中和劑稀釋液）中充分溶解，混合均勻。

（2）試驗組。將試驗菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉制成一定濃度的菌懸液加入供試品中，使每 mL樣液中含菌量30～300 CFU。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。

作者要寫的關(guān)鍵詞是“幸福”,但用了形象化的筆觸,比如“心里卻急烈地跳動”“擠進他底心”“暈倒”“癡呆”等。并且用他想的曾經(jīng)“孤零”“單獨”“孤獨”的他來反襯,進一步凸顯此刻的幸福。

（3）樣品對照組。取制備好的樣液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

（4）菌液對照組。取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代樣液，按試驗組操作加入試驗菌液。

1.2.2 專屬性試驗

在供試品中接種一定數(shù)量的混合試驗菌，制成高、中、低3組濃度，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法檢驗。

1.2.3 重復性試驗

在供試品中接種一定數(shù)量的混合試驗菌，分別由2名不同實驗員在不同時間、不同條件下，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法分別進行菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢驗。

1.2.4 精密度試驗

1.2.5 耐用性試驗

在供試品中接種一定數(shù)量的混合試驗菌，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法分別進行菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢驗，比較2種不同供應(yīng)商的培養(yǎng)基培養(yǎng)后的試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果分析

2.1 方法適用性試驗結(jié)果

通過表1可知，供試品中含有一定的抑菌活性，當使用中和劑1（3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉）時，可以有效消除抑菌活性，使金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉有較好的回收PR值（PR值在0.5～2.0），而對枯草芽孢桿菌使用中和劑2（D/E肉湯）、調(diào)節(jié)pH 6.5～7.5、膜過濾以及使用中和劑3（3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉），試驗結(jié)果的回收PR值均＜0.5，之后的試驗項目取消對枯草芽孢桿菌的驗證。

表1 計數(shù)方法適用性試驗結(jié)果

2.2 專屬性試驗結(jié)果

通過表2、表3可知，當樣品加入低、中、高3個濃度的目標菌株時，菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的實驗回收率均≥70%，符合專屬性要求。

表2 菌落總數(shù)專屬性試驗結(jié)果

表3霉菌和酵母菌總數(shù)專屬性試驗結(jié)果

2.3 重復性試驗結(jié)果

通過表4、表5可知，參照《中國藥典》（2020版）四部（9201），以相對標準偏差評價方法重復性，不同人員菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的試驗結(jié)果的RSD值均小于15%，符合重復性要求。

表4 菌落總數(shù)重復性試驗結(jié)果

表5 霉菌和酵母菌總數(shù)重復性試驗結(jié)果

2.4 精密度試驗結(jié)果

通過表6、表7可知，參照《中國藥典》（2020版）四部（9201），以相對標準偏差評價方法的精密度，菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)通過高、中、低3個試驗菌濃度，每個濃度進行3次重復試驗的計數(shù)結(jié)果的RSD值均小于35%，回收率均大于70%，符合精密度要求。

表6 菌落總數(shù)精密度試驗結(jié)果

表7 霉菌和酵母菌總數(shù)精密度試驗結(jié)果

2.5 耐用性試驗結(jié)果

通過表8、表9可知，兩個供應(yīng)商的培養(yǎng)基的菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的試驗結(jié)果對數(shù)絕對值差均≤0.25，符合耐用性要求。

表8 不同供應(yīng)商菌落總數(shù)培養(yǎng)基的對比結(jié)果

表9 不同供應(yīng)商霉菌和酵母菌總數(shù)培養(yǎng)基的比對結(jié)果

3 結(jié)論

（1）該保健食品樣品按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016進行菌落總數(shù)、霉菌和酵母計數(shù)測定，方法適用性驗證結(jié)果均符合方法學要求。該樣品有一定的抑菌活性，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)可知，使用3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉作為中和劑，可以有效消除抑菌活性，回收率、重復性、專屬性、精密度和耐用性等均符合要求。

（2）驗證使用的枯草芽孢桿菌經(jīng)過添加3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉作為中和劑、D/E肉湯中和劑、調(diào)節(jié)pH值為 6.5～7.5、膜過濾等方式其驗證效果均不理想，表明該供試品對枯草芽孢桿菌有較強的抗菌活性，同時也表明該中草藥保健食品不易被枯草芽孢桿菌污染，所以建議取消對枯草芽孢桿菌的驗證試驗。

（3）中草藥成分復雜，抑菌成分各有不同，任何成分都有可能影響微生物限度檢查結(jié)果，本研究為微生物限度檢查方法適用性試驗的研究提供參考和研究思路，進一步保證方法完整和準確[5]。