余詠詩，劉 輝,2,

（1.佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528225；2.佛山科學技術(shù)學院醫(yī)學院，廣東佛山 528000）

幾個世紀以來，乳酸桿菌作為一種能發(fā)酵食物的益生菌，已成為開發(fā)食品配方和益生菌產(chǎn)品最常用的微生物之一。隨著對乳酸桿菌研究的不斷深入，乳酸桿菌的生理機制和生物特性被廣泛開發(fā)與利用。通過對乳酸桿菌的基因進行修飾，從而開發(fā)出具有更優(yōu)良性質(zhì)的可用于食品、藥物生產(chǎn)的新型乳酸桿菌，是目前研究的熱點之一。因此，高效的基因修飾技術(shù)是必不可缺的工具。

近年來，CRISPR-Cas9技術(shù)以效率高、簡便、成本低等特點在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療藥物等領(lǐng)域中大放異彩。但美中不足的是，該技術(shù)的效率、精確性還有待提高，同時消費者和工業(yè)界對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的安全性也持有懷疑的態(tài)度，因此經(jīng)過基因修飾的產(chǎn)物會受到嚴格的監(jiān)管。但從科學的角度來看，基因編輯的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌是很有潛力的，且國內(nèi)外也已經(jīng)允許了一部分應用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯植物的使用。因此，利用CRISPR-Cas9技術(shù)對乳酸桿菌進行改造是一個值得關(guān)注的研究方向。

目前，CRISPR-Cas9技術(shù)在乳酸桿菌中的應用較少?，F(xiàn)有研究主要集中在對乳酸桿菌自身CRISPRCas系統(tǒng)的分析和研究，而對乳酸桿菌原位基因修飾的研究報道并不多見。與傳統(tǒng)的菌株改良方法相比，CRISPR-Cas9技術(shù)可極大地提高乳酸桿菌靶向位點的正確性并做到無痕基因組修飾，通過此技術(shù)獲得的菌株甚至有可能比通過傳統(tǒng)的隨機誘變方法獲得的菌株更為安全。隨著基因編輯技術(shù)的逐漸成熟，以及大眾接受程度的增加，CRISPR-Cas9技術(shù)編輯過的乳酸桿菌將會廣泛地應用到人體健康、食品工業(yè)等領(lǐng)域。本文對部分乳酸桿菌和CRISPR-Cas9技術(shù)進行介紹，對CRISPR-Cas9技術(shù)在乳酸桿菌中的應用與存在的問題進行綜述，并展望未來CRISPRCas9技術(shù)運用到乳酸桿菌的發(fā)展趨勢，期望為國內(nèi)乳酸桿菌生物工程化的研究與開發(fā)提供一些思路。

1 乳酸桿菌的概述

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指能利用可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌。這類細菌是一種分布極為廣泛、具有豐富多樣化的物種，以桿菌或球菌為主。乳酸菌至少包括18個屬，由200多種已被正式認可的物種和亞種組成，其中乳酸桿菌（）最為重要。乳酸桿菌不僅是人類體內(nèi)的共生菌之一，而且在人類健康和食品工業(yè)等方面也起到了不可或缺的作用。

早在公元3世紀，乳酸桿菌就已經(jīng)開始被人類用于發(fā)酵食物，而對乳酸桿菌長期的研究和應用早已證明了一些乳酸桿菌是安全的、具有多種功能作用的益生菌，因此它們也被廣泛應用于保健食品，促進人體健康。其中，最典型的是乳酸桿菌可以防治乳糖不耐癥（喝鮮奶時出現(xiàn)的腹脹、腹瀉等癥狀），因為乳糖會被乳酸桿菌產(chǎn)生的乳糖酶所降解形成更容易吸收的小分子狀態(tài)，使得乳糖不耐受患者可以接受乳制品。同時，乳酸桿菌可以增加腸道有益菌群，改善人體胃腸道功能，恢復人體腸道內(nèi)的菌群平衡，形成抗菌生物屏障，維護人體健康。此外，乳酸桿菌可抑制脂肪酸的吸收，進而減少體脂增加。Jang等利用動物喂養(yǎng)實驗的方法分別對小鼠進行口服灌胃鼠李糖乳桿菌和生理鹽水的處理，以評估鼠李糖乳桿菌（）對肝臟脂質(zhì)積聚和造成肥胖的慢性作用，結(jié)果表明口服鼠李糖乳桿菌的小鼠腸道顯著減少了對脂肪酸的吸收。

乳酸桿菌不僅對人體有著許多有益的功能，同時也是食品工業(yè)中的重要菌種，能賦予食品獨特的風味以及改善食品的品質(zhì)和營養(yǎng)成分。唐立偉等研究了鼠李糖乳桿菌（）、瑞士乳桿菌（）、副干酪乳桿菌（）等四種典型的乳酸桿菌在乳品發(fā)酵過程中的pH、酸度變化、貨架期內(nèi)的活菌數(shù)變化及耐胃酸的能力，結(jié)果表明發(fā)酵乳產(chǎn)酸快但貨架期短，而和的發(fā)酵乳貨架期穩(wěn)定性優(yōu)良。此外，乳酸桿菌在養(yǎng)殖業(yè)中也發(fā)揮了重要作用，唾液乳桿菌（）可以改善雞的生長性能，有效增加體重和免疫器官的相對重量，而且還可減輕熱應激引起的器官損傷以及增強傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease virus, IBDV）疫苗免疫后的免疫應答。

上述研究結(jié)果表明，乳酸桿菌不僅能促進人體健康，在發(fā)酵食品中的工業(yè)應用和養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域同樣也占據(jù)著非常重要的地位。表1列出了一些乳酸桿菌的代表菌種及其在食品加工中的應用。

表1 部分乳酸桿菌的菌種及其在食品加工中的應用Table 1 Some Lactobacillus strains and their application in food processing

2 CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)及作用機制

基因編輯是能精確插入、刪除、替換生物體中含有遺傳信息的基因序列的新興技術(shù)，而CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc-finger nuclease，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nuclease，TALENs）等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)。短短幾年內(nèi)，CRISPR-Cas9技術(shù)風靡全球，成為現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里面效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術(shù)之一，也是當今最主流的基因編輯系統(tǒng)。前兩代基因編輯技術(shù)都需要構(gòu)建結(jié)合蛋白和Fok I核酸內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)域組成的復雜系統(tǒng)。ZFNs作為第一代基因編輯技術(shù)，鋅指蛋白能識別特定的3個連續(xù)堿基對，由Fok I核酸內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)域負責切割DNA，其設(shè)計依賴上下游序列，脫靶率高，具有細胞毒性，且這項技術(shù)專利被美國Sangamo壟斷，因此自問世以來無大規(guī)模應用。第二代的TALENs與ZFNs類似，TALENs由TALE基序串聯(lián)成決定靶向性的DNA識別模塊，一個TALE基序識別一個堿基對，特異性高，細胞毒性比ZFNs低。但TALENs存在較多的重復序列，需要大量測序工作，且模塊組裝過程繁瑣。而CRISPR-Cas9技術(shù)除了靶向精準、脫靶率低、細胞毒性低等特點外，另一個顯著優(yōu)勢是它能夠同時編輯多個基因，利用多個gRNAs靶向不同的基因，為復雜的多基因編輯研究開辟了新的可能性。

CRISPR是1987年由石野良純等在大腸桿菌（）基因組中意外發(fā)現(xiàn)的一系列串聯(lián)重復DNA片段，這些片段含29個保守堿基且被另一段含32個堿基的可變序列隔開，但當時對這種結(jié)構(gòu)的生物學功能不得而知。九十年代，隨著研究者在多種細菌和古細菌基因組中都發(fā)現(xiàn)了這種特殊的重復片段，因此在2000年將其統(tǒng)稱為短規(guī)律性間隔重復（Short regularly spaced repeat, SRSR）序列。直到2002年，Jansen等對這種特殊結(jié)構(gòu)進行深入研究后，正式將這種結(jié)構(gòu)命名為成簇規(guī)律性間隔短回文（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列。隨后研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多與CRISPR序列功能相關(guān)聯(lián)的基因，并將其統(tǒng)稱為CRISPR-相關(guān)因子（CRISPR-associated，Cas）。最初對于CRISPR-Cas功能的假設(shè)是其可能參與細胞的DNA限制性保護和復制子分配等過程。然而在2005年，有研究者提出CRISPR-Cas是一種適應性免疫系統(tǒng)的假說，且這個假說在2007年成功被Barrangou等驗證。Barrangou等發(fā)現(xiàn)這個系統(tǒng)可以將新的噬菌體DNA整合到CRISPR陣列中，這使它們被同樣的病毒再次入侵時細菌就有了抗性，使其免遭攻擊。Bolotin等在研究嗜熱鏈球菌（）的基因組時，發(fā)現(xiàn)了一個不尋常的CRISPR基因座。盡管這個CRISPR陣列與先前報道的系統(tǒng)相似，但它不僅缺少一些已知的Cas基因，又包含新的Cas基因，包括編碼大分子蛋白質(zhì)的基因。Bolotin等預測該基因表達的蛋白具有核酸酶活性，這個基因就是Cas9。自此，對CRISPR-Cas9系統(tǒng)相關(guān)的研究開始增加。

目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)被分為I、II和III型三種主要類型，而 CRISPR-Cas9屬于 II型系統(tǒng)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在適應性免疫時遵循著三個步驟：間隔序列的獲取，crRNA的形成與干擾（圖1）。具體步驟表現(xiàn)為當外源病毒或質(zhì)粒DNA進入細胞時，細胞通過專門的Cas蛋白將外源DNA序列剪成小片段并整合到連續(xù)的DNA片段中，形成一個新的CRISPR間隔序列。然后這個新的間隔序列被轉(zhuǎn)錄成CRISPR RNA前體（Pre-crRNA）和反式激活RNA（Trans-activating RNA，tracrRNA），然后在核糖核酸酶 III（Ribonuclease III，RNaseIII）的作用下形成成熟的crRNA。最后crRNA協(xié)同tracrRNA通過特異性的方式引導Cas9蛋白去切割入侵的目標DNA以達到免疫干擾的效果。在Cas9蛋白被證實能對特定的DNA進行靶向斷裂后，Jinek等的研究指出，可以將CRISPR-Cas9系統(tǒng)中的crRNA和tracrRNA融合在一起，形成一個單一的合成導向RNA，即單導向 RNA（Single-guide RNA，sgRNA），進一步簡化了系統(tǒng)，為CRISPR-Cas9技術(shù)廣泛應用于基因靶向和基因編輯奠定了基礎(chǔ)。之后陸續(xù)有研究者將這種技術(shù)應用于基因編輯技術(shù)。總的來說，CRISPR-Cas9技術(shù)由于具有實驗簡單，操作容易，用時短等優(yōu)勢，已經(jīng)被研究者們廣泛應用在植物、小鼠和人類細胞中，并進行了臨床試驗。

圖1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)適應性免疫的簡化步驟Fig.1 Simplified steps for adaptive immunity of CRISPR-Cas9 system

3 CRISPR-Cas9技術(shù)應用于乳酸桿菌基因的編輯

3.1 CRISPR-Cas9技術(shù)改造乳酸桿菌

多年來，乳酸桿菌早已被用作為微生物工廠，用于生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物以及生物催化劑。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)去打造更優(yōu)質(zhì)的菌種，其目的在于改良乳酸桿菌的性狀、提升產(chǎn)物的質(zhì)和量，或者降低乳酸桿菌釋放污染物和有害物污染環(huán)境的風險。

利用CRISPR-Cas9技術(shù)可以把乳酸桿菌打造成具有優(yōu)良性狀的菌株。Goh 等將細胞表面相關(guān)的果糖糖苷酶基因敲入無法代謝低聚果糖（Fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）的中，重組菌株能在含有FOS的mMRS培養(yǎng)基中生長，這表明了重組菌株擁有了對果糖的代謝能力。CRISPR-Cas9系統(tǒng)還可以被編輯成選擇性地靶向乳酸桿菌中的抗生素耐藥基因，Hidalgo-Cantabrana等利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲掉乳酸桿菌的與抗生素耐藥性有關(guān)的基因，從而減少和轉(zhuǎn)移了乳酸桿菌的抗生素耐藥性。

在食品工業(yè)中，乳酸桿菌常常被用于生產(chǎn)胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS），EPS 由于可賦予發(fā)酵乳制品特殊的質(zhì)構(gòu)和風味，從而廣泛用于食品的增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及持水。為了進一步利用乳酸桿菌生產(chǎn)EPS的能力，有必要對其結(jié)構(gòu)與功能基因進行深入了解以達到優(yōu)化生產(chǎn)的目的。Song等使用CRIPSR-Cas9技術(shù)對的EPS生物合成基因進行了敲除，研究結(jié)果表明敲除后菌株的EPS產(chǎn)量明顯降低。Mayer等鑒定出約翰遜氏乳桿菌（）中的一種假定基因細菌烯醇糖基轉(zhuǎn)移酶（FI9785-242，242）對EPS-1的合成很重要，在FI9785基因組中利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除基因以構(gòu)建菌株Δ242，而菌株Δ242細胞沉淀和上清液中均未檢測到EPS-1。Dertli等研究報道指出，F(xiàn)I9785 能夠產(chǎn)生兩種不同的EPS，分別是EPS-1和EPS-2，該研究進一步鑒定出了與EPS合成相關(guān)的基因簇，而其中的基因是合成EPS-1和EPS-2的關(guān)鍵基因。這些或許是乳酸桿菌EPS生物合成的機制的一部分，為利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建菌體外生產(chǎn)合成EPS提供了一個新的思路。Zhou等采用CRISPR-Cas9技術(shù)對進行了無縫基因組編輯，設(shè)計并構(gòu)建了可以產(chǎn)生n-乙酰氨基葡萄糖的菌株，在未引入外源標記基因和質(zhì)粒的情況下，最終菌株的生產(chǎn)n-乙酰氨基葡萄糖的量為797.3 mg/L。Dato等研究表明釀酒酵母（）腺苷甲硫氨酸同工酶 2（S-adenosylmethionine2，SAM2）的表達量與L-乳酸的合成量相關(guān)，利用CRISPR-Cas9技術(shù)除掉菌株的基因后，菌株的乳酸產(chǎn)量比正常菌株平均增加了5.4%，并且敲除掉基因基本不會影響菌株的活力?？偟膩碚f，通過對乳酸桿菌生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的基因結(jié)構(gòu)運用生物工程的方法進行優(yōu)化，是一種非常有效且具有前景的策略手段。

除產(chǎn)生有益物質(zhì)外，乳酸桿菌也會產(chǎn)生一些對人體有害的物質(zhì)，例如D-乳酸。因為人和動物體內(nèi)并不存在D-乳酸脫氫酶，因此不能分解代謝D-乳酸，人體攝入過多D-乳酸會導致出現(xiàn)代謝紊亂，甚至中毒的癥狀。通常來說，乳酸桿菌會同時產(chǎn)生兩種乳酸，分別是L-乳酸和D-乳酸，而調(diào)控生產(chǎn)這兩種乳酸的關(guān)鍵基因是一個D-乳酸脫氫酶基因和 L-乳酸脫氫酶基因。研究表明，通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除或替換掉是降低乳酸桿菌生產(chǎn)D-乳酸的一種有效方法。張一凡通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了一株被敲除掉基因、過表達L-乳酸脫氫酶的突變菌株，發(fā)現(xiàn)突變菌株產(chǎn)生L-乳酸的產(chǎn)量提高了16.3%，光學純度也由95.2%提升至99.0%，大大提高了高純度L-乳酸的產(chǎn)量，降低了D-乳酸的生成。上述的研究表明利用CRISPR-Cas9技術(shù)可有效降低乳酸桿菌中對人體有害物質(zhì)的產(chǎn)生。

盡管D-乳酸對人體有害，但不能否認它在生物可降解塑料工業(yè)中的價值。隨著基因編輯技術(shù)的進步，通過基因工程打造合適的乳酸桿菌用于生產(chǎn)D-乳酸在近幾年也成為了研究熱點之一。Huang等研究表明的同源基因和在過表達的情況下能讓菌株生產(chǎn)更多D-乳酸。Assavasirijinda等將的基因通過CRISPR-Cas9技術(shù)導入工程化的嗜堿芽孢桿菌（）菌株，并通過破壞負責合成胞外多糖的關(guān)鍵基因，以增加產(chǎn)量并簡化下游生產(chǎn)過程。Ozaki等通過CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)將中的基因?qū)胫晾蹙屏阎辰湍福ǎ?，并通過CRISPR基因敲除破壞了菌株中競爭D-乳酸合成相關(guān)的丙酮酸脫氫酶的基因和和編碼L-乳酸的基因，顯著促進了菌株利用葡萄糖轉(zhuǎn)化生成D-乳酸的效率。

近年來，基于CRISPR-Cas9技術(shù)去修飾編輯菌株，改善其性狀、將其改造作為“生產(chǎn)工廠”來產(chǎn)生所需物質(zhì)的報道越來越多。而乳酸桿菌作為一種公認的益生菌，利用CRISPR-Cas9技術(shù)對其合理化改造將會是未來的研究的主要的方向。

3.2 CRISPR-Cas9技術(shù)應用于乳酸桿菌基因編輯存在的問題

大多數(shù)天然的乳酸桿菌都屬于“公認安全”標準（Generally recognized as safe，GRAS）的范疇，因此，這類乳酸桿菌在食品工業(yè)、醫(yī)藥等方面已經(jīng)被廣泛運用。但目前還沒有轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌被美國食品藥品監(jiān)督管理局認定為GRAS，主要是因為乳酸桿菌基因組被改造后，其遺傳的穩(wěn)定性、對人體潛在的安全性尚未得知，且現(xiàn)有的基因編輯技術(shù)依然存在問題缺陷，如目標損壞、脫靶編輯、低效率等問題，即使是目前最先進的第三代基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9也不能保證每次都能完美地打造出產(chǎn)品。

如何提高準確率，避免脫靶是目前基因編輯技術(shù)面臨的最大挑戰(zhàn)。雖然CRISPR-Cas9相較于ZFNs和TALENs技術(shù)對靶向基因操作更加簡單便捷，CRISPR-Cas9只需要將引導RNA序列與特定的靶區(qū)匹配，就可以將Cas酶引導到該位點，引入雙鏈斷裂，但同樣存在脫靶的風險，影響基因編輯成功率。在利用CRISPR-Cas9打造乳酸桿菌時，可能會發(fā)生靶向位點的大量缺失、基因組重排列、切割位點遠端病變等脫靶效應，從而使乳酸桿菌產(chǎn)生有害物質(zhì)或造成乳酸桿菌的死亡，甚至會打造成一種有害的微生物。而當這些有害物質(zhì)或者重組的有害微生物沒有及時處理，被意外或人為地釋放到自然界中，有可能會打破生態(tài)平衡，最終對人類造成嚴重的威脅。其中一個影響脫靶的重要原因是CRISPR-Cas9系統(tǒng)依賴于內(nèi)源性DNA修復因子不能被有效地控制，也不能預測該因子產(chǎn)生的錯誤。為了解決缺乏穩(wěn)健的DNA修復機制的問題，Goh等在乳酸桿菌中的非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）的DNA損傷修復機制中，利用化膿性鏈球菌（）的切口酶變體Cas9在嗜酸乳桿菌（）中進行靶向基因刪除和插入，從而減少因為雙鏈斷裂引起的死亡。盡管現(xiàn)在已有科學家研究開發(fā)出緩解脫靶問題的方法，但是造成脫靶有著許多因素的影響，如細胞類型、CRISPRCas9組件的表達水平、傳遞方法等，一個因素或多個因素共同影響都會導致脫靶。目前，CRISPR-Cas9系統(tǒng)號稱能實現(xiàn)多個基因的編輯，但在大規(guī)模地打造乳酸桿菌的過程中，其精確性、效率仍然有上升的空間。Leenay等在中使用CRISPRCas9技術(shù)進行基因編輯，但多次編輯同一位點并不總是成功的，編輯的結(jié)果也會因運用的方法和打造的菌株種類而產(chǎn)生差異?？偟膩碚f，有效地解決脫靶問題，同時提高基因編輯的效率和精確性，是研究者們目前亟待解決的問題。

CRISPR-Cas9技術(shù)修飾乳酸桿菌仍需要面對許多挑戰(zhàn)，且該技術(shù)的有些機制人類尚未完全掌握，如潛在靶位點識別機制和原間隔序列鄰近基（Protospacer-adjacent motif，PAM）依賴的基礎(chǔ)等。盡管目前從科學的角度看，轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌有著更加合理、優(yōu)良的性狀，能成為代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)工廠，但人們依然對轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌聞之色變，認為其已被基因操控，對人體產(chǎn)生的風險是一個未知數(shù)。因此，在廣泛應用轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌之前，政府和科學家們都要進行批判性的風險評估。隨著CRISPR-Cas9技術(shù)地不斷發(fā)展，科學家們需要不斷地研究克服技術(shù)缺陷，這將會打造出更加穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌。

3.3 CRISPR-Cas9技術(shù)應用于乳酸桿菌未來展望

3.3.1 改善乳酸桿菌的抗脅迫性 乳酸桿菌被廣泛地應用于食品工業(yè)的過程中，需要面對在生產(chǎn)、儲存和分配過程中所形成的物理、化學多種脅迫，影響乳酸桿菌發(fā)揮生理功能。乳酸桿菌作為發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中，其穩(wěn)定性影響著發(fā)酵工藝，而作為益生菌被人體食用后，則需要在對腸道的惡劣條件中存活才能發(fā)揮其活性。因此，運用CRISPR-Cas9技術(shù)對乳酸桿菌的基因進行改造，使乳酸桿菌具有更強的穩(wěn)定性，從而適應不同條件的生存環(huán)境。

乳酸桿菌在工業(yè)發(fā)酵時自身會產(chǎn)生有機酸，常常面臨酸脅迫，導致乳酸桿菌的細胞活力和發(fā)酵產(chǎn)量降低。谷氨酸脫羧酶（The glutamate decarboxylase，GAD）系統(tǒng)是乳酸桿菌最重要的抗酸系統(tǒng)之一。正因為GAD的抗酸能力的存在，乳酸桿菌才能在酸脅迫環(huán)境下抑制雜菌生長的同時自身也能夠正常發(fā)酵生長。Gong等在研究短乳桿菌（）的GAD系統(tǒng)時，發(fā)現(xiàn)的GAD系統(tǒng)中潛在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因所表達的GadR蛋白一旦失活，會極大地降低制藥工業(yè)中的一種重要化合物—-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）的產(chǎn)生，同時也降低了的耐酸性。該研究表明GadR是調(diào)控的耐酸性和GABA合成的正反饋調(diào)節(jié)劑?？梢灶A想的是，通過CRISPR-Cas9構(gòu)建高表達GadR的乳酸桿菌是增強菌種抗酸性及工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)GABA的有效方法。Gong等研究表明中的氮代謝全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因表達的GlnR蛋白能夠影響細菌的抗酸性和GABA的產(chǎn)生。該研究證實了GlnR是一種負調(diào)控GAD表達的蛋白，能夠降低細菌的抗酸性和GABA的轉(zhuǎn)化合成。因此，通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除掉基因也是一種增強菌株抗脅迫能力的有效方法。

溫度也是影響乳酸桿菌活性的重要條件之一。在食品工業(yè)中，為了保持食品的安全衛(wèi)生，發(fā)酵食品常常需要經(jīng)過加熱、巴氏消毒法進行殺菌，這也導致乳酸桿菌的數(shù)量和細胞活力急速下降，因此提高乳酸桿菌的抗熱性在食品生產(chǎn)加工中尤為重要。熱休克反應（Heat shock response，HSR）是乳酸桿菌面對熱壓力產(chǎn)生的防御適應反應，誘導熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）的基因表達，形成如小熱休克蛋白、Clp ATP酶等幫助受損細胞蛋白重新折疊的分子蛋白和ClpP、FtsH等來降解不可逆轉(zhuǎn)的受損蛋白質(zhì)的蛋白酶，從而改善乳酸桿菌對外界熱變化的適應性。Chastanet等證實，HSP中的基因和基因受到三級應激基因阻遏物CtsR和HrcA的雙重調(diào)控作用。當發(fā)生熱休克反應，HrcA會失活，同時CtsR調(diào)控ClpEP復合物進行表達，進而ClpEP復合物把CtsR降解。因CtsR是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄抑制因子，當CtsR被降解后，其控制Clp ATP酶才能全部表達來提高乳酸桿菌對熱的適應性。Desmond等對的操縱子進行PCR擴增誘導表達，當重組菌株受到熱應激時，生產(chǎn)過量GroESL蛋白，大大提高耐熱性。因此，可以通過CRISPR-Cas9技術(shù)修飾HSPs相關(guān)基因，增強對HSPs的誘導，從而使乳酸桿菌能在高溫下保持活性。

在食品加工中改善乳酸桿菌的抗脅迫性是非常有必要的。在外界的壓力下，乳酸桿菌的抗脅迫性越強，就越能在食品加工中保持細胞活性，從而在開發(fā)的產(chǎn)品中展現(xiàn)出其獨特的生理功能。

3.3.2 利用CRISPR-Cas9技術(shù)增強乳酸桿菌的抗菌活性 乳酸桿菌被廣泛用于食品和制藥工業(yè)中，很大原因是乳酸桿菌具有良好的抗菌活性，而乳酸桿菌的抗菌機制很復雜，其中很重要的一個方面則是能產(chǎn)生細菌素。細菌素是核糖體合成的蛋白質(zhì)或短肽鏈，具有一定的抗菌活性，可以通過與特定的表面受體相互作用導致細胞的破裂，從而抑制特定的或有著相關(guān)結(jié)構(gòu)的菌株的生長，因此可被食品工業(yè)用于生物防腐。

目前研究最多且應用最廣泛的乳酸鏈球菌細菌素（Nisin，亦稱乳鏈菌肽）被認為是食品和制藥工業(yè)中用于防止食物變質(zhì)和雜菌污染生長的重要化合物。近年來，隨著對細菌素研究的深入，通過生物工程的方法對Nisin進行編輯修飾的研究越來越多。Reiners等對乳酸乳球菌（）的Nisin的基因序列的N端區(qū)域進行定點誘變，誘導表達得到Nisin A和Nisin H。測試兩種Nisin的對金黃色葡萄球菌（）的最小抑菌濃度，結(jié)果顯示Nisin A的最小抑菌濃度是6.25 μmol/L，而Nisin H為0.78 μmol/L，顯然，經(jīng)過定點突變的Nisin H比Nisin A抗菌效力更好。同樣，O’sullivan等發(fā)現(xiàn)由頭狀葡萄球菌（）菌株所產(chǎn)生的乳鏈菌肽變體Nisin J對多種革蘭氏陽性病原體都表現(xiàn)出較強的抗菌活性，使用打孔擴散法測試Nisin A和Nisin J對金黃色葡萄球菌的抗菌能力，Nisin J的抑菌圈面積為153.1 mm，而Nisin A的抑菌圈面積只有109.4 mm。而Nisin J相比于典型的Nisin A在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別在于其中有9個氨基酸都發(fā)生了變化，這導致了Nisin J缺少了乳鏈菌肽調(diào)節(jié)基因和乳鏈菌肽免疫基因，從而形成了一種新型的抗菌細菌素。上述研究是基于通過PCR定點誘變的方法得到乳鏈菌肽，這也說明了通過生物工程的方法去改造乳酸桿菌進而得到更完善的益生菌是可能的。Oh等利用CRISPRCas9對羅伊氏乳桿菌（）的和基因進行定點飽和誘變，對含有NNK基序（N=A/T/G/C和K=G/T）的寡核苷酸進行一次轉(zhuǎn)化，其中一個密碼子被修飾為編碼所有20個氨基酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一重組體增強的抗菌活性。Van等對構(gòu)建單鏈DNA（ssDNA）重組工程，在pdu操縱子上游的啟動子區(qū)域進行了6個堿基變化，從而使抗微生物化合物羅伊氏菌素的產(chǎn)量增加了3倍，且與野生型菌株相比，對的殺傷效率提高了3倍。隨著技術(shù)的不斷完善，研究者通過CRISPRCas9技術(shù)對一些有益的乳酸桿菌的染色體中的密碼子進行精確誘變，打造出具有強抗菌性的乳酸桿菌是可以實現(xiàn)的。

乳酸桿菌產(chǎn)生的細菌素在抑菌譜、產(chǎn)量、穩(wěn)定性等方面還能進一步改進和提升，上述的研究成果為利用CRISPR-Cas9技術(shù)去修飾乳酸桿菌的抗菌活性，并將其改造為一種更有價值的益生菌菌株的研究與開發(fā)提供了新思路。

3.3.3 改變?nèi)樗釛U菌的免疫調(diào)節(jié)特性 對乳酸桿菌中有助于免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)基因進行編輯修飾，是改變?nèi)樗釛U菌免疫調(diào)節(jié)特性的方法之一。一些乳酸桿菌對宿主具有調(diào)節(jié)、改善或防止免疫有關(guān)的疾病的功效，Steidler等構(gòu)建重組分泌小鼠白細胞介素10（IL-10），當小鼠口服重組菌株可顯著減少腸道炎癥，這是最先將轉(zhuǎn)基因乳酸菌運用在調(diào)節(jié)免疫治療中，為治療炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease, IBD）提供新的思路。盡管現(xiàn)在科學家們還缺乏對細菌類的免疫特性整體機制的理解，但有相關(guān)研究表明，細菌的外細胞表面蛋白在細菌與宿主之間的相互作用中起了關(guān)鍵的作用。細菌的細胞外壁通常由細胞壁和細胞膜組成，但在許多古細菌和真細菌中發(fā)現(xiàn)還有一層表面層（Surface layers）結(jié)構(gòu)，也稱為s-層（S-layers），該層是通過一類特殊的蛋白質(zhì)（稱為S層蛋白）之間的相互作用所構(gòu)建的二維晶格結(jié)構(gòu)所組成。許多研究結(jié)果都表明了S層蛋白具有介導免疫調(diào)節(jié)的功能，為改變?nèi)樗釛U菌免疫調(diào)節(jié)特性提供了潛在的目標。SIGNR3是小鼠8個同源的樹突細胞受體（DC-sepecific ICAM-grabbing non-integrin，DC-SIGN）之一，與人DC-SIGN的生物特征高度相似。Lightfoot等研究發(fā)現(xiàn)了的S層蛋白可與小鼠的SIGNR3連接，進而表達出調(diào)控信號，緩解小鼠的結(jié)腸炎癥。而Johnson等的研究中也發(fā)現(xiàn)了中與S層相關(guān)的絲氨酸蛋白酶同源物PrtX（PrtX, lba1578）突變增強了對白細胞介素 6（Interleukin 6，IL-6）、IL-12 和 IL-10的刺激，可能導致改變上皮腸細胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性。此外，Uroi?等發(fā)現(xiàn)了在有S層蛋白的情況下會對機體產(chǎn)生特別的保護以及增強了對腸細胞的粘附作用，并且的S層蛋白可以在單核細胞衍生的樹突狀細胞（Monocyte-deriveddendritic cells，moDC）中誘導腫瘤壞死因子-（Tumor necrosis factor-，TNF-）的生成。除了發(fā)酵乳桿菌（）和等某些物種不會產(chǎn)生S層結(jié)構(gòu)，許多原核生物中都存在S層結(jié)構(gòu)，且S-層的結(jié)構(gòu)都是保守的，不會輕易地變異。通過運用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)去精確改變某些乳酸桿菌S層蛋白的表達，可以做到穩(wěn)定長期地增強這類菌株的益生功能。

總的來說，對一些精選出來的益生菌或非益生菌的結(jié)構(gòu)更深入的了解，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲入高誘導性啟動子來驅(qū)動這些基因的過表達，進而調(diào)整優(yōu)化這些結(jié)構(gòu)來達到改變其免疫特性的目的。

4 結(jié)語

乳酸桿菌作為一種與人類生活密切聯(lián)系的微生物，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域都發(fā)揮著重要的作用。而隨著人們生活水平的不斷提高以及對美好生活的需要，開發(fā)一些更符合人民需求且更優(yōu)良的新型乳酸桿菌變得尤為重要。近年來，通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)打造改良菌株的技術(shù)方法引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，大批研究者通過該技術(shù)改造乳酸桿菌，但轉(zhuǎn)基因乳酸桿菌的應用仍處于實驗室驗證階段。目前作為新一代的基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9仍然存在脫靶的問題，精確性和效率有待提高。因此，科學家們不斷地追求著更加精準、高效的CRISPRCas9介導乳酸桿菌的基因編輯方法，并將其運用到不同種類的乳酸桿菌中。為了滿足人類的需要，改善乳酸桿菌的特性和功能，通過CRISPR-Cas9技術(shù)打造出具有高抗脅迫性、高抗菌活性、不同的免疫活性等特性的乳酸桿菌，將會是未來發(fā)展的趨勢?？梢灶A見的是，隨著CRISPR-Cas9技術(shù)進一步地發(fā)展以及對一些精選出來的乳酸桿菌的基因結(jié)構(gòu)進行更深入的了解后，將有望打造出更優(yōu)良且能夠被公眾所接受的乳酸桿菌菌株。