苗維娜，趙 亮,2,

（1.功能乳品教育部北京市共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)益生菌研究中心，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系，北京 100190）

乳酸菌冷凍干燥是將乳酸菌細(xì)胞懸浮液在冰點(diǎn) 以下溫度預(yù)凍后，置于真空環(huán)境，通過(guò)冰晶在低溫條件下升華的原理脫除水分，制成凍干粉的技術(shù)。該方法主要以微生物的生理、生化特點(diǎn)為依據(jù)，抑制菌株的代謝、生長(zhǎng)和繁殖，使菌株達(dá)到休眠狀態(tài)，來(lái)保持菌株的原有特性。冷凍干燥法最早的雛形可以追溯到16世紀(jì)初，現(xiàn)代的冷凍干燥技術(shù)發(fā)明于20世紀(jì)60年代初期。乳酸菌凍干菌粉有活菌數(shù)多、接種體積小、運(yùn)輸方便、貯藏期長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，因此冷凍干燥技術(shù)被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于乳酸菌發(fā)酵劑的制備。

冷凍干燥法是有效的菌株保存手段，但也會(huì)導(dǎo)致乳酸菌損傷，甚至死亡。在凍干過(guò)程中，低溫和干燥環(huán)境的脅迫會(huì)對(duì)乳酸菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和生理功能造成損害，如冰晶引起的機(jī)械損傷、溶質(zhì)損傷、細(xì)胞膜損傷、關(guān)鍵酶的失活和DNA結(jié)構(gòu)的改變等。乳酸菌發(fā)酵活力會(huì)隨著細(xì)胞受損而下降，影響菌株工業(yè)化應(yīng)用。

在食品生產(chǎn)與加工過(guò)程中，乳酸菌保持較高的存活率和細(xì)胞代謝活力是其充分發(fā)揮益生功能的保障。目前大多數(shù)研究都集中在如何提高發(fā)酵劑中的活菌數(shù)量，研究時(shí)通常將存活率作為評(píng)價(jià)乳酸菌凍干粉性能的唯一指標(biāo)。然而對(duì)于用作發(fā)酵劑的乳酸菌，其凍干粉的發(fā)酵活力指標(biāo)則更為重要，可直接決定其生產(chǎn)性能，但發(fā)酵劑活菌數(shù)量與發(fā)酵活力之間不能直接關(guān)聯(lián)。因此，為了提高凍干粉的發(fā)酵性能，需要研究影響乳酸菌凍干粉發(fā)酵活力的因素及其機(jī)制。本文綜述了冷凍干燥過(guò)程中影響乳酸菌凍干后發(fā)酵活力的主要因素，包括菌株遺傳特性、培養(yǎng)條件、凍干工藝、保護(hù)劑以及貯藏和復(fù)水條件等，分析了細(xì)胞膜穩(wěn)定性對(duì)乳酸菌凍干粉發(fā)酵活力的重要影響，并基于細(xì)胞膜損傷異質(zhì)性分析了菌株活菌數(shù)與發(fā)酵活力的關(guān)系。本文將為乳酸菌凍干耐受機(jī)制研究，以及發(fā)酵劑活性提升技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供思路。

1 冷凍干燥過(guò)程中影響乳酸菌發(fā)酵活力的因素

冷凍干燥過(guò)程中影響乳酸菌凍干后發(fā)酵活力的因素主要有以下幾個(gè)方面：內(nèi)部因素有菌株遺傳特性決定的菌體形狀、乳酸菌細(xì)胞膜上的脂肪酸和脂質(zhì)組成、膜蛋白的構(gòu)象改變、胞外多糖（EPS）的種類與含量等；外部因素有凍干保護(hù)劑成分、冷凍干燥工藝參數(shù)、培養(yǎng)條件等。

1.1 菌種遺傳特性

不同菌屬或者同一菌屬的不同菌株，因其遺傳物質(zhì)的不同而在冷凍干燥過(guò)程中表現(xiàn)出的抵抗適應(yīng)能力差異明顯。菌體形狀會(huì)影響菌株的抗凍干能力，一般情況下，球菌的抗凍干能力比桿菌強(qiáng)，桿菌中短桿狀菌比長(zhǎng)桿狀菌抗凍干能力強(qiáng)，原因可能是球菌的比表面積較小，減少了冰晶對(duì)細(xì)胞膜造成的機(jī)械損傷。另外，不同種屬的菌株細(xì)胞膜脂肪酸等的組成也各不相同，而脂肪酸組成會(huì)影響菌株抗凍干能力。如Li等發(fā)現(xiàn)酸性條件脅迫下酒酒球菌具有更高的耐凍干能力，同時(shí)檢測(cè)到其細(xì)胞膜中棕櫚酸含量降低，環(huán)丙烯脂肪酸含量增加，這證明了酒酒球菌細(xì)胞膜脂肪酸組成會(huì)影響菌體的耐受力；于小青探究了12種植物乳桿菌的菌株差異、脂肪酸組成差異與冷凍干燥存活率的關(guān)聯(lián)，通過(guò)施加低溫脅迫并檢測(cè)細(xì)胞膜上脂肪酸組成，發(fā)現(xiàn)低溫條件下12種菌株的膜脂肪酸均有向不飽和轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，（以C18:1為例）轉(zhuǎn)化后C18:1含量增加的菌株凍干后細(xì)胞膜完整性及流動(dòng)性、乳酸脫氫酶以及ATP酶比活力等保存較好，使菌株凍干粉發(fā)酵活力保存較高。因此，菌株遺傳特性造成細(xì)胞膜脂肪酸的組成差異，從而影響了菌株的耐凍干能力和發(fā)酵活力。

1.2 培養(yǎng)條件

乳酸菌凍干粉制備前，會(huì)經(jīng)過(guò)菌體培養(yǎng)富集的過(guò)程。菌株培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、pH等均會(huì)對(duì)菌株抗冷凍干燥性能有一定的影響。

研究表明，培養(yǎng)基成分對(duì)乳酸菌抗凍干能力發(fā)揮重要作用。通過(guò)調(diào)控培養(yǎng)基組成可以增強(qiáng)乳桿菌生理活性、促進(jìn)生物膜形成和改變細(xì)胞膜飽和/不飽和脂肪酸比例。碳源和氮源的比例可以影響乳酸菌的抗凍能力，尚一娜等以益生菌植物乳桿菌LIP-1為研究對(duì)象，通過(guò)調(diào)整碳源氮源比例得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方可以顯著提高凍干存活率，同時(shí)提高凍干粉高密度發(fā)酵的活菌數(shù)。E等研究發(fā)現(xiàn)鉀離子可以促進(jìn)細(xì)胞膜形成，提高凍干后的細(xì)胞活力。通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基中碳源和氮源的比例，添加無(wú)機(jī)離子如鉀離子、鈣離子等，都可以提高凍干后乳酸菌發(fā)酵活力。針對(duì)不同菌株開(kāi)發(fā)適宜其特點(diǎn)的優(yōu)化培養(yǎng)基可以增強(qiáng)菌株活性，減少存活率和發(fā)酵活力損傷，有效提高菌株抗冷凍的能力。

通過(guò)改善培養(yǎng)環(huán)境而得到具有高抗凍干能力的菌株，對(duì)工業(yè)生產(chǎn)高活力乳酸菌凍干粉起到事半功倍的作用。如李明慧等發(fā)現(xiàn)在最佳條件（pH6.7、培養(yǎng)溫度36 ℃、接種量8.8%）下培養(yǎng)植物乳桿菌LIP-1可以顯著提高凍干后發(fā)酵活菌數(shù)及凍干存活率，這證明改變培養(yǎng)條件可提高植物乳桿菌LIP-1的冷凍干燥存活率和高密度發(fā)酵活性。

乳酸菌培養(yǎng)有最適溫度和最適pH，偏離最適條件會(huì)誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，一定程度上脅迫應(yīng)激反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生交叉保護(hù)效果，能夠提高菌體的耐受能力。如王曉萌等通過(guò)優(yōu)化凍干前的嗜酸乳桿菌冷休克處理?xiàng)l件（8 ℃冷休克處理15 h），使其凍干存活率比未冷休克、添加凍干保護(hù)劑的菌體顯著提高（提高了17.65%）。楊婕等通過(guò)研究單因素脅迫：酸脅迫（pH3.2、3.8、4.0、4.5、5.0）靜置 90 min，冷脅迫（4、10 ℃）靜置180 min，確定了能提高發(fā)酵活性的最佳脅迫條件。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵乳桿菌ATm進(jìn)行pH4.5處理90 min、4 ℃處理180 min的酸-冷交互脅迫能夠顯著提高細(xì)胞冷凍干燥存活率及酸化速率,優(yōu)于單因素脅迫。酸-冷交互脅迫能維持細(xì)胞膜完整性、保護(hù)菌株凍干后部分酶活性（乳酸脫氫酶和ATP酶），從而顯著提高菌株發(fā)酵活力。不同脅迫的作用機(jī)制和效果不同，冷脅迫可以通過(guò)改善細(xì)胞膜流動(dòng)性、刺激冷應(yīng)激蛋白（如保加利亞乳桿菌LM1冷應(yīng)激蛋白）表達(dá)起到提高菌株凍干存活率的作用；酸脅迫可以通過(guò)提高酶活性、加速糖酵解等途徑保存發(fā)酵活力；而交互脅迫綜合各脅迫作用機(jī)理，對(duì)發(fā)酵活力的提高效果更顯著。但是，脅迫條件具有菌株特異性，同時(shí)交互脅迫對(duì)預(yù)處理?xiàng)l件要求更為嚴(yán)格，針對(duì)不同菌株進(jìn)行具體研究才可能投入實(shí)際應(yīng)用。

1.3 冷凍干燥工藝

冷凍干燥過(guò)程主要包括預(yù)凍和干燥兩部分：首先通過(guò)預(yù)凍步驟將細(xì)胞內(nèi)水分凍結(jié)成冰晶，便于脫除。再通過(guò)初次干燥、二次干燥分別除去細(xì)胞內(nèi)外的游離水和結(jié)合水，降低水分活度，使微生物保持在較低的生命活動(dòng)狀態(tài)。工業(yè)上一般采用平板式凍干機(jī)進(jìn)行乳酸菌凍干粉制備，可以實(shí)現(xiàn)凍干曲線的實(shí)時(shí)監(jiān)控和參數(shù)控制。凍干曲線是溫度、壓力與時(shí)間之間的關(guān)系曲線，由凍干各階段的具體參數(shù)設(shè)計(jì)而成，對(duì)凍干效果影響顯著。因此工業(yè)上主要通過(guò)控制凍干曲線達(dá)到制備高活力的凍干發(fā)酵劑的目的。預(yù)凍階段可通過(guò)控制預(yù)凍溫度和時(shí)間提高菌株凍干存活率和發(fā)酵活力，如龔虹等對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行產(chǎn)酸、生物膜形成能力及抗氧化能力的檢測(cè)確定最佳預(yù)凍時(shí)間為-40 ℃下2 h，此時(shí)菌株產(chǎn)酸速率較高，形成膜能力較強(qiáng)，且具有一定的抗氧化能力；干燥階段主要控制冷阱溫度和凍干時(shí)間等參數(shù)，如徐長(zhǎng)隆等發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌H0808在凍干時(shí)間為56 h、冷阱溫度-50 ℃時(shí)活菌數(shù)最高。由于不同菌株的含水量和組成不同，針對(duì)特定菌株開(kāi)發(fā)的凍干曲線不僅可以提升工業(yè)生產(chǎn)效率，還能優(yōu)化凍干效果、提高凍干粉發(fā)酵活力。

另外，為了提高凍干技術(shù)的效率，還可將凍干技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合。如通過(guò)紅外射頻技術(shù)輔助干燥過(guò)程，降低能耗的同時(shí)提高凍干發(fā)酵劑中活菌數(shù)。冷凍干燥的預(yù)凍過(guò)程存在耗時(shí)長(zhǎng)、控制速率難等問(wèn)題，而液氮深冷技術(shù)通過(guò)將菌泥和保護(hù)劑混合物滴入裝有液氮的容器中形成球狀顆粒，實(shí)現(xiàn)了快速預(yù)凍和造粒，降低了冷凍過(guò)程對(duì)菌體的損傷，使得液氮處理后菌體具有更高的發(fā)酵產(chǎn)酸能力（與原菌液相近），相比直接冷凍干燥處理-半乳糖苷酶、LDH活性也更高，這說(shuō)明深冷處理后細(xì)胞膜完整性保持更好，具有更高的發(fā)酵活力。液氮深冷使細(xì)胞在極短時(shí)間內(nèi)經(jīng)歷超低溫處理，胞內(nèi)形成較小冰晶體，對(duì)細(xì)胞和細(xì)胞膜的損傷較小。

綜上，在凍干工藝方面，可以針對(duì)菌株特性、利用凍干曲線確定最佳工藝參數(shù)來(lái)提高菌株凍干后的發(fā)酵活力，也可以通過(guò)結(jié)合液氮深冷等技術(shù)改進(jìn)現(xiàn)有工藝，減少凍干過(guò)程對(duì)菌體的損傷，獲得高發(fā)酵活性的發(fā)酵劑。

1.4 凍干保護(hù)劑

凍干保護(hù)劑在冷凍干燥過(guò)程中對(duì)乳酸菌有不同程度的保護(hù)作用，可以減少細(xì)胞受損和死亡。保護(hù)劑按照滲透性可以分為滲透、半滲透和不滲透三類。滲透保護(hù)劑主要是能夠透過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的小分子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓。如常用的甘油就是典型的滲透型保護(hù)劑，通過(guò)改善細(xì)胞膜的流動(dòng)性，抑制細(xì)胞過(guò)度脫水形成冰晶來(lái)保護(hù)菌株。半滲透保護(hù)劑只能透過(guò)細(xì)胞壁無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜，可以分布在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間阻止冰晶生長(zhǎng)。一般包括一些小分子糖，如蔗糖、海藻糖等，其含有的游離羥基能夠與細(xì)胞膜上磷脂結(jié)合形成氫鍵，為細(xì)胞提供機(jī)械保護(hù)。公丕民發(fā)現(xiàn)海藻糖可以在干燥過(guò)程中提高菌株的發(fā)酵活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力，這與海藻糖具有的抗脫水、冷凍、高溫、氧化等脅迫的保護(hù)機(jī)制有關(guān)。而不滲透保護(hù)劑只能在細(xì)胞外側(cè)提供保護(hù)，如乳清蛋白、脫脂乳。這類大分子吸附在細(xì)胞外側(cè)，可以提供一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境，從而阻止細(xì)胞與冰晶和氧氣的接觸，減少菌株損傷。如劉飛等發(fā)現(xiàn)用普魯士多糖作為凍干保護(hù)劑不僅可以顯著提高保加利亞乳桿菌的存活率，還能在長(zhǎng)期保藏中保護(hù)菌種活力。

將多種保護(hù)劑以一定的比例進(jìn)行復(fù)配能夠使其保護(hù)細(xì)胞的效果更好，提高活菌數(shù)和發(fā)酵活力。楊輝等以發(fā)酵果渣的復(fù)合乳酸菌為研究對(duì)象，優(yōu)化了凍干保護(hù)劑配方（低聚木糖、菊糖、NaHCO且添加量分別為14.5%、6.28%、0.92%），凍干菌粉與空白組相比存活率提高了68.27%。辛明等優(yōu)化了植物乳桿菌L5、L12的凍干保護(hù)劑中脫脂乳、海藻糖和硫酸錳的比例，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH降低速度較快且終點(diǎn)pH較低，說(shuō)明優(yōu)化后發(fā)酵劑生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸能力較好。趙延勝等發(fā)現(xiàn)添加了菊粉復(fù)合保護(hù)劑的植物乳桿菌凍干粉活化后生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、還原糖和總糖消耗速度快，總體效果優(yōu)于脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組，且維持的發(fā)酵活力較高、接近菌液水平。綜上所述，保護(hù)劑的不同成分和配比對(duì)乳酸菌的發(fā)酵活力和凍干存活率有著顯著的影響。

但是，菌株之間存在很大差異，并且不同種類的保護(hù)劑保護(hù)機(jī)制不同，因此并不能找到一種普適的保護(hù)劑配方可以有效地保護(hù)所有乳酸菌。例如，5%蔗糖、2%甘油、0.8%谷氨酸鈉、1%抗壞血酸、5%海藻糖為嗜熱鏈球菌MN002的最佳保護(hù)劑配方；而Cheng等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳桿菌L2加入10%脫脂乳、7%海藻糖、2%山梨醇和0.6%酪氨酸的復(fù)合凍干保護(hù)劑凍干后，存活率高達(dá)92%，植物乳桿菌L1在10%脫脂牛奶、13%蔗糖、2%山梨糖醇和0.8%酪氨酸的復(fù)合保護(hù)劑保護(hù)下，凍干存活率高達(dá)97%。此外，在最佳復(fù)合保護(hù)劑存在下可以檢測(cè)到兩菌株的細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量增加，例如油酸（C18:1）和 C19cyc11，細(xì)胞膜完整性得到維持、-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶泄露減少，從而較好地保持了兩菌株凍干的發(fā)酵活力。因此，針對(duì)不同的菌株，需要獨(dú)立研究而不能套用其他菌株的最佳保護(hù)劑配方來(lái)提高凍干后菌株發(fā)酵活力，以便實(shí)現(xiàn)不同的凍干后特性。

1.5 貯藏和復(fù)水

凍干后，凍干粉的包裝和貯藏條件是影響乳酸菌發(fā)酵劑中活菌數(shù)和活力的重要因素之一。凍干粉的穩(wěn)定性一般隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而降低，低溫保藏可以較好地保存凍干粉中菌株活力。馬雁等發(fā)現(xiàn)乳桿菌grx07長(zhǎng)期儲(chǔ)藏的適宜溫度為-20 ℃，貯藏12個(gè)月活化后發(fā)酵pH達(dá)到4.30，優(yōu)于對(duì)照組（4 ℃）的4.83，同時(shí)-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶的活力仍保持在貯藏前的80%以上，與對(duì)照組酶活（65%）相比得到了較好的保存。此外，貯藏環(huán)境的氣體成分和氧氣含量也是影響凍干粉保藏活性的重要因素。張曉寧研究發(fā)現(xiàn)，真空環(huán)境貯藏凍干后的植物乳桿菌LIP-1存活率最高，氮?dú)獯沃?，有氧環(huán)境最差，同時(shí)發(fā)現(xiàn)真空貯藏條件下菌株的-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶及Na+K+-ATP酶酶活均顯著高于氮?dú)赓A存和氧氣貯藏條件，因此在氧氣含量低的環(huán)境貯藏有利于凍干菌粉活菌數(shù)的提高和發(fā)酵活力的保存。

復(fù)水是乳酸菌凍干粉菌株從休眠向復(fù)蘇轉(zhuǎn)變的過(guò)程。復(fù)水液的滲透壓、成分等都會(huì)對(duì)菌體活力產(chǎn)生影響。朱東升使用四種不同營(yíng)養(yǎng)成分的復(fù)水介質(zhì)（生理鹽水、無(wú)菌水、MRS培養(yǎng)基和10%脫脂乳）復(fù)水乳酸菌后發(fā)現(xiàn)，生理鹽水組存活率最高，可能因?yàn)樯睇}水在復(fù)水時(shí)有減少細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的作用，使菌體不易受到再次損傷。Valdez等通過(guò)研究16株不同乳酸菌發(fā)現(xiàn)，稀溶液會(huì)顯著提高乳酸菌的復(fù)水活力，但是用蒸餾水會(huì)導(dǎo)致菌株活力下降顯著。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)不同成分的復(fù)水液會(huì)使乳酸菌凍干后修復(fù)細(xì)胞損傷的能力存在顯著差異，在檢測(cè)的16株乳酸菌中，蘋(píng)果酸對(duì)嗜酸乳桿菌ATCC 4356、發(fā)酵乳桿菌ATCC 9338和奶油乳桿菌CRL242的損傷細(xì)胞有明顯修復(fù)作用；磷酸根對(duì)發(fā)酵乳桿菌復(fù)水后活力的提升作用最強(qiáng)；這表明成分相同的復(fù)水液對(duì)不同菌株活力的抑制或促進(jìn)作用與菌株特異性有關(guān)。綜上，凍干粉的貯藏條件和復(fù)水液的成分、滲透壓等通過(guò)影響乳酸菌的凍干存活率、發(fā)酵關(guān)鍵酶活力和菌體細(xì)胞活力來(lái)影響乳酸菌轉(zhuǎn)化為活菌狀態(tài)后的發(fā)酵活力。同時(shí)能夠保護(hù)菌體活力的最佳復(fù)水液配方與菌株特異性密切相關(guān)，需要針對(duì)不同菌株進(jìn)行具體研究。

2 凍干過(guò)程中細(xì)胞膜穩(wěn)定性對(duì)發(fā)酵活力的影響

細(xì)胞膜具有隔離菌體與外部環(huán)境、保護(hù)乳酸菌的重要作用。由于乳酸菌中的碳水化合物、能量代謝相關(guān)酶一般附著在細(xì)胞膜上，凍干過(guò)程導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷、穩(wěn)定性變化對(duì)凍干后菌體活力影響顯著。研究發(fā)現(xiàn)，凍干后乳酸菌發(fā)酵活力下降的原因可能是凍干使菌體細(xì)胞膜完整性和穩(wěn)定性（包括流動(dòng)性、通透性等）受損且無(wú)法修復(fù)，導(dǎo)致代謝酶流失，酶活力下降及菌體生理代謝能力受損；進(jìn)一步分析凍干對(duì)細(xì)胞膜損傷機(jī)制發(fā)現(xiàn)，冷凍干燥會(huì)引起細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量顯著上升，并且部分菌株凍干受損程度較大可能與細(xì)胞膜脂肪酸調(diào)節(jié)能力弱有關(guān)；同時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞膜損傷異質(zhì)性是菌株凍干后存活率高但發(fā)酵活力低的主要原因。本部分將重點(diǎn)介紹冷凍干燥過(guò)程中細(xì)胞膜穩(wěn)定性變化及其對(duì)凍干后菌體發(fā)酵活力的影響。

2.1 細(xì)胞膜流動(dòng)性對(duì)發(fā)酵活力的影響

冷凍干燥過(guò)程中細(xì)胞膜流動(dòng)性變化使細(xì)菌凍干耐受力下降，生理代謝能力受損、發(fā)酵產(chǎn)酸速率下降，導(dǎo)致凍干后乳酸菌發(fā)酵活力的損失。已有研究證明，冷凍干燥會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化。如喬穎等通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌冷凍后細(xì)胞膜部分消失，細(xì)胞質(zhì)成團(tuán)聚集，細(xì)胞膜流動(dòng)性下降。李寶坤和王學(xué)良分別利用DPH作為熒光探針來(lái)測(cè)定凍干后保加利亞乳桿菌和胚芽乳桿菌ST-III的細(xì)胞膜流動(dòng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜流動(dòng)性與菌體活力具有相關(guān)性。因此，可以通過(guò)提高細(xì)胞膜流動(dòng)性提高菌株對(duì)不良環(huán)境中的抗性，使凍干后菌株的發(fā)酵活力得到較好保存。

在冷凍干燥的過(guò)程中，乳酸菌細(xì)胞膜流動(dòng)性變化與其細(xì)胞膜脂肪酸組分的特異性變化有關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜飽和/不飽和脂肪酸的比例有助于抵抗凍干造成的膜流動(dòng)性下降，從而調(diào)節(jié)菌株發(fā)酵活力。不飽和脂肪酸因其熔點(diǎn)較低，能夠增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，因此含量較高時(shí)有助于增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)惡劣環(huán)境的耐受能力。另外，不飽和脂肪酸中的環(huán)丙烷脂肪酸因其為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，減少了不飽和脂肪酸向飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)化，有利于提高細(xì)胞膜脂肪酸的不飽和度，一定程度上也可以增強(qiáng)乳酸菌的耐受能力。如陳境等在初始pH6.8和7.4的條件下培養(yǎng)乳酸菌，發(fā)現(xiàn)初始pH為6.8時(shí)可提高植物乳桿菌LIP-1細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的含量、提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，通過(guò)保持凍干過(guò)程中酶活性來(lái)提高菌株發(fā)酵酶活力。張曉寧等發(fā)現(xiàn)特定配方的優(yōu)化培養(yǎng)基可以顯著提高菌株細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值和環(huán)丙烷脂肪酸的含量，增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，減少了細(xì)胞膜凍干損傷。同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中pH和滴定酸度變化發(fā)現(xiàn)優(yōu)化組的pH下降較快且發(fā)酵時(shí)間較短，發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間顯著快于對(duì)照組（＜0.05），可見(jiàn)優(yōu)化培養(yǎng)基后菌株較對(duì)照組的乳酸脫氫酶的活力更高，發(fā)酵性能更好。這說(shuō)明優(yōu)化培養(yǎng)基通過(guò)增加菌株凍干后的細(xì)胞膜流動(dòng)性，提高了凍干菌粉的發(fā)酵活力。

因此，冷凍干燥中細(xì)胞膜流動(dòng)性降低會(huì)削弱菌體的凍干耐受力，如檢測(cè)到菌株活力和代謝產(chǎn)酸速率下降等，導(dǎo)致發(fā)酵活力損失；但通過(guò)改變培養(yǎng)基成分或培養(yǎng)條件可以改變細(xì)胞膜脂肪酸組成，改善細(xì)胞膜冷凍干燥后的流動(dòng)性，從而改善凍干后菌株的發(fā)酵性能。

2.2 細(xì)胞膜通透性對(duì)發(fā)酵活力的影響

細(xì)胞膜是分隔細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的屏障，如果細(xì)胞膜的完整性受損，通透性增加，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵代謝物質(zhì)流失（例如與發(fā)酵相關(guān)的酶等），從而導(dǎo)致乳酸菌凍干后發(fā)酵活力損失。王飚等研究發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌保加利亞亞種的細(xì)胞膜在凍干前后通透性有顯著增加，并與活力的損失成反相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明在凍干過(guò)程中細(xì)胞受到了損傷，細(xì)胞膜通透性的改變可能是導(dǎo)致乳酸菌在凍干過(guò)程中致死和失活的原因之一。李明慧等研究發(fā)現(xiàn)凍干后乳酸菌細(xì)胞膜完整性受損、細(xì)胞膜通透性增大，導(dǎo)致發(fā)酵相關(guān)酶泄露，胞內(nèi)酶活力顯著降低。因此，冷凍干燥過(guò)程中乳酸菌細(xì)胞受損、膜通透性增大可能是凍干菌株發(fā)酵活力損失的關(guān)鍵因素。

Mimoza等測(cè)定添加和未添加保護(hù)劑的嬰兒雙歧桿菌UV16PR菌株凍干后胞外-葡萄糖苷酶活力，發(fā)現(xiàn)未添加保護(hù)劑的菌株凍干后胞外酶活力顯著高于添加了保護(hù)劑的樣品，證明冷凍干燥導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性增大，使-葡萄糖苷酶保留率下降并且活力降低，因此凍干后菌株的存活率和發(fā)酵活力下降。焦琳等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加保護(hù)劑配方的組發(fā)酵活力較高，掃描電鏡觀察下可見(jiàn)該組菌體細(xì)胞完整，表面光滑，直觀地表明了該組菌體在凍干過(guò)程中受到的細(xì)胞膜完整性、形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)方面的損傷較小。綜上，減少冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌體細(xì)胞膜的損傷、更好地保存凍干后細(xì)胞膜完整性和通透性，提高發(fā)酵相關(guān)酶的保留率可以增強(qiáng)發(fā)酵酶活力，有利于提高凍干粉的發(fā)酵活力。

2.3 細(xì)胞膜損傷的異質(zhì)性對(duì)發(fā)酵活力的影響

在以往研究中，以菌體增殖為基礎(chǔ)的菌落計(jì)數(shù)技術(shù)（如平板計(jì)數(shù)）被廣泛用作活力測(cè)定的方法。然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)了菌落計(jì)數(shù)方式的缺陷。研究表明，乳酸菌功能特性依賴于菌株代謝活動(dòng)，而不是細(xì)胞復(fù)制。實(shí)驗(yàn)室中菌株的分裂形成菌落能力與代謝能力不直接相關(guān)。因此，活菌數(shù)較高的凍干發(fā)酵劑可能由于菌株代謝發(fā)酵能力差而使發(fā)酵活力偏低。

目前已有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在酸、堿和啤酒花等脅迫條件下會(huì)出現(xiàn)損傷異質(zhì)性，產(chǎn)生一種損傷菌亞群。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）結(jié)合熒光探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，損傷菌亞群雖然仍存活，但在不同生理參數(shù)上明顯區(qū)別于總?cè)后w中的活菌亞群，例如細(xì)胞膜完整性受損、細(xì)胞內(nèi)酶活性降低、細(xì)胞活力下降和膜電位部分喪失等。冷凍干燥過(guò)程同樣會(huì)使乳酸菌損傷出現(xiàn)異質(zhì)性。Rault等通過(guò)FCM熒光探針測(cè)定四種冷凍后的德氏乳桿菌，鑒定出三個(gè)主要亞群：活菌亞群、損傷菌亞群和死菌亞群。隨冷凍脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，菌株的損傷細(xì)胞比例下降、死細(xì)胞比例上升。Kramer等發(fā)現(xiàn)冷凍干燥后的嗜酸乳桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌均出現(xiàn)了10%～15%的損傷細(xì)胞，低溫儲(chǔ)藏90 d發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞比例顯著增加（約10%），同時(shí)活菌比例變化較小，這表明該實(shí)驗(yàn)中兩菌株的損傷菌更容易失活甚至死亡。由于菌株在脅迫條件下產(chǎn)生的損傷亞群可能處在一種存活但低活性的狀態(tài)，脅迫后的菌株雖然“存活亞群”數(shù)量較多，但是細(xì)胞活力弱、代謝能力低，這可能是相同活菌數(shù)下凍干粉發(fā)酵活力有差異的主要原因。對(duì)乳酸菌的不同亞群生理差異研究較少，但在其他種屬的細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。如Li等發(fā)現(xiàn)超聲和溫和加熱聯(lián)合使用會(huì)使金黃色葡萄球菌處于亞致死狀態(tài)，此時(shí)菌株的膜損傷和脂肪酶抑制是同步的，說(shuō)明損傷菌體亞群雖然存活但代謝能力確實(shí)有所降低；Shao等發(fā)現(xiàn)歐姆加熱脅迫導(dǎo)致金黃色葡萄球菌出現(xiàn)生理?yè)p傷，存活率雖然高，但是檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌株形成生物膜、發(fā)酵甘露醇的能力降低，并且溶血能力和凝固酶活性也有所降低。

對(duì)于乳酸菌，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凍干后的副干酪乳桿菌L9和LC01均出現(xiàn)了三種形態(tài)的菌體：完整菌、損傷菌和死亡菌。對(duì)比兩菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，損傷菌比例較高且經(jīng)過(guò)活化后短時(shí)間內(nèi)仍不能恢復(fù)活力，可能是導(dǎo)致副干酪乳桿菌L9凍干后存活率與LC01相近，但發(fā)酵活力損失顯著的原因。

綜上，乳酸菌在冷凍干燥脅迫下會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)不同的亞群，其中，能夠存活但生理功能已經(jīng)喪失的“損傷菌體亞群”尤為重要，因?yàn)樵诖婊盥视?jì)算時(shí)，它們被認(rèn)為是存活的菌體，但由于細(xì)胞活力弱、發(fā)酵能力下降，所以在發(fā)酵活力測(cè)定時(shí)成為了失活群體，導(dǎo)致凍干發(fā)酵劑存活率較高但發(fā)酵活力損失顯著。因此乳酸菌在冷凍干燥脅迫下出現(xiàn)部分損傷菌體，單純用凍干存活率評(píng)價(jià)發(fā)酵劑可能存在不足，同時(shí)有必要開(kāi)展乳酸菌凍干脅迫異質(zhì)性研究，明確損傷亞群出現(xiàn)的機(jī)制，分析影響損傷亞群比例的因素，從而針對(duì)性提高乳酸菌凍干粉的發(fā)酵活力。

3 結(jié)語(yǔ)

在冷凍干燥處理后仍保持較高的發(fā)酵活力是提高乳酸菌發(fā)酵劑性能和充分發(fā)揮乳酸菌益生功能的重要條件。影響冷凍干燥后乳酸菌發(fā)酵活力的因素主要分為內(nèi)部和外部?jī)纱蟛糠?，如培養(yǎng)基成分、凍干工藝、菌體遺傳性質(zhì)等多個(gè)方面。由于細(xì)胞膜可以使菌體與外部環(huán)境隔離，是保護(hù)乳酸菌的主要屏障，因此細(xì)胞膜穩(wěn)定性在眾多影響因素中非常關(guān)鍵。細(xì)胞膜穩(wěn)定性主要包含了細(xì)胞膜流動(dòng)性對(duì)生長(zhǎng)速率的影響，細(xì)胞膜通透性對(duì)關(guān)鍵代謝物質(zhì)，如發(fā)酵相關(guān)酶（如-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶）流失的影響等不同方面。尤其是細(xì)胞膜損傷異質(zhì)性，可能是導(dǎo)致凍干乳酸菌發(fā)酵劑存活率高但發(fā)酵活力低下的原因。因此，通過(guò)對(duì)冷凍干燥脅迫中乳酸菌細(xì)胞膜穩(wěn)定性機(jī)制等的進(jìn)一步探究，并結(jié)合菌體不同的細(xì)胞膜特性可提高乳酸菌的抗冷凍干燥能力。

為了提高乳酸菌在食品中的應(yīng)用水平，目前已經(jīng)開(kāi)展了大量以提高凍干乳酸菌活菌數(shù)為目標(biāo)的研究探索，未來(lái)需要針對(duì)凍干后乳酸菌發(fā)酵活力的變化，深入解析其機(jī)制，明確細(xì)胞膜穩(wěn)定性與發(fā)酵活力的量效關(guān)系，進(jìn)一步分析菌株細(xì)胞膜組成、酶表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。此外，針對(duì)乳酸菌凍干粉出現(xiàn)“高菌數(shù)低發(fā)酵活力”的問(wèn)題，可從環(huán)境脅迫響應(yīng)異質(zhì)性層面，重點(diǎn)解析低發(fā)酵活力亞群形成機(jī)制和控制技術(shù)，為開(kāi)發(fā)高活性凍干保護(hù)劑和凍干工藝提供理論依據(jù)。