岳曉禹， 郭明璋， 張?zhí)扃鳎?李長濱， 張 華， 許文濤

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院食品與生物工程學(xué)院1，鄭州 450046) (北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院2，北京 100048) (中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系3，北京 100091)

農(nóng)作物在生長過程中經(jīng)常受到真菌、細菌、病毒等病原體的侵染，其中真菌病原體所占的比例最大。盡管植物對某些真菌病原體具有免疫力[1]，但真菌孢子很難被徹底消滅，容易殘留在農(nóng)作物表面，在適宜條件下可再次萌發(fā)[2]，尤其是谷物類作物，在長期倉儲過程中若環(huán)境條件未進行嚴格控制，孢子極易萌發(fā)造成真菌污染。谷物真菌污染后會產(chǎn)生黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等真菌毒素[3]，若被人類直接食用，會導(dǎo)致腎毒性、肝中毒、生殖異常和免疫反應(yīng)抑制，若被牲畜食用，也會通過食物鏈(牛奶，肉，雞蛋)而間接進入人體，同樣會對人體造成危害，因此真菌毒素污染的谷物無法被利用，造成嚴重的經(jīng)濟損失，并危害糧食安全。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織的調(diào)查，全球每年約有25%的谷物受到真菌毒素的污染。真菌毒素污染一旦發(fā)生便難以被完全脫除，預(yù)防真菌毒素污染的關(guān)鍵是防止谷物的真菌污染。

研究倉儲谷物中真菌污染規(guī)律，建立谷物真菌污染在時間和空間上發(fā)生發(fā)展模型，是預(yù)防谷物真菌污染的有效方法。本研究團隊在之前的研究中應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)探究了玉米儲藏過程中的霉菌群落時空分布特征[4]，然而由于DGGE對真菌微生物群落圖譜的分辨率有限，該研究不足以為模型建立提供足夠的數(shù)據(jù)。近年來，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)使真菌群落的高分辨率圖譜分析成為可能。高通量測序方法研究微生物多樣性具有免培養(yǎng)，靈敏度高，準確率高等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于各類樣品的真菌群落研究中[5-11]。本研究將繼續(xù)以倉儲玉米為對象，采集中國兩大糧食主產(chǎn)區(qū)(河南省和黑龍江省)的玉米樣品，通過高通量測序技術(shù)以探討不同產(chǎn)地、倉儲時間、倉儲位置、倉儲深度等因素對真菌組成的影響，旨在為谷物真菌污染模型建立提供更有效的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品采自河南省和黑龍江省，樣品編號及相關(guān)信息如表1所示。

PCR擴增采用Phusion超保真DNA聚合酶；高通量測序建庫采用TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B超聲波振蕩器，H1850R低溫高速離心機，聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增儀，高通量測序儀HiSeq2500 PE250。

表1 玉米樣品編號及相關(guān)信息

1.3 方法

1.3.1 玉米中真菌基因組DNA提取

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取玉米的真菌[12-14]。具體提取方法與之前的文獻中報道的玉米中真菌提取方法相同[4]。

1.3.2 PCR擴增及高通量測序

PCR擴增及高通量測序主要委托公司完成。具體方法為利用帶有標簽的ITS1區(qū)通用引物(ITS5-1737F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG和ITS2-2043R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC)對樣品真菌基因組DNA進行擴增。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用HiSeq2500 PE250進行測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析及統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)根據(jù)標簽序列信息進行拆分，得到每個樣品序列信息。序列經(jīng)過去除標簽序列、去除引物序列、序列拼合、去除低質(zhì)量序列后，得到有效序列。有效序列利用QIIME軟件[15，16]進行97%相似度的可操作單元(OTUs)聚類，代表序列提取，基于GreenGene數(shù)據(jù)庫對代表序列進行注釋，得到每個樣品中每種OTU的序列數(shù)量。利用PAST軟件[17]對每個樣品中真菌群落OTU數(shù)據(jù)進行非度量多維尺度分析(NMDS)，相似性分析(ANOSIM)，Simpson多樣性指數(shù)分析。利用Draw Venn Diagram在線工具對樣品中真菌群落OTU數(shù)據(jù)進行韋恩圖分析。利用在線分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析工具(MENAP)[18]對玉米真菌群落中各物種的關(guān)聯(lián)性進行分析。利用LDA Effect Size (LEfSe)[19]在線工具對不同組之間有顯著差異的真菌種類進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 倉儲玉米的真菌群落組成的一般特征

高通量測序技術(shù)可以深入分析倉儲玉米中真菌微生物群落的組成規(guī)律[20]。黑龍江和河南倉儲玉米的真菌微生物群落組成均以子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)生物為主，除樣品EN2013以外，其余樣品中子囊菌門和擔(dān)子菌門生物量占群落生物總量的比例均在97%以上(圖1a)。糧食中常見的產(chǎn)毒素真菌如曲霉、木霉、青霉、鐮刀菌等均屬于子囊菌門或擔(dān)子菌門，當這些產(chǎn)毒素真菌豐度升高時，倉儲玉米被真菌毒素污染的風(fēng)險也隨之升高，因此控制倉儲玉米中真菌群落的變化是減少倉儲玉米真菌污染的有效方法。在屬分類水平，從數(shù)量上看，鐮刀菌屬(Fusarium)、赤霉菌屬(Gibberella)、念珠菌屬(Candida)、球殼孢屬(Sphaeropsis)是所有樣品中平均豐度最高的屬；從生態(tài)位上看，基于分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示倉儲玉米真菌群里中木霉屬(Trichoderma)、地絲霉屬(Geomyces)、毛喙殼屬(Chaetomidium)占據(jù)核心生態(tài)位位置(圖1b)，盡管這些微生物屬在數(shù)量上并非最高，但可能與其他微生物種類有較強的物質(zhì)或信號分子的交換，因此在倉儲玉米真菌微生物群落中有更加重要的生態(tài)地位。

2.2 不同省份倉儲玉米中真菌群落的比較

河南和黑龍江兩地倉儲玉米真菌微生物群落存在較大差異。在門水平上，如圖1a所示，黑龍江倉儲玉米(樣品ES1～M3)子囊菌門生物所占比例更高(84.9%～99.6%)，而擔(dān)子菌門生物所占比例較低(0.3%～13.9%)；河南倉儲玉米(樣品M2013～WN2014)擔(dān)子菌門生物所占比例(16.2%～37.6%)顯著高于黑龍江倉儲玉米樣品中擔(dān)子菌門生物比例(圖1A,P<0.05)。在屬水平上，黑龍江倉儲玉米中鐮刀菌屬、赤霉菌屬、念珠菌屬、枝孢菌屬(Cladosporium)為豐度最高的微生物屬，河南倉儲玉米樣品中念珠菌屬、球殼孢屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)為豐度最高的微生物屬。另外，從多樣性上看，黑龍江倉儲玉米樣品中真菌微生物群落的多樣性，從OTU數(shù)目、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)指標來看，均高于河南樣品中相應(yīng)指數(shù)(圖1c)。表明不同省份倉儲玉米真菌群落可能存在較大差異，建立倉儲玉米真菌群落模型，需考慮到倉儲玉米所在地域的因素。

2.3 玉米儲藏時間對其中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

倉儲玉米儲藏年限一般為3～15年，儲藏時間可能是影響倉儲玉米真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[21，22]，尤其是倉儲的前2～3年，是真菌微生物群落發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵時期。本研究比較了儲藏2年的倉儲玉米樣品(M2014、EN2014、ES2014、WN2014、WS2014)和儲藏3年的倉儲玉米樣品(M2013、EN2013、ES2013、WN2013、WS2013)，結(jié)果表明，儲藏2年的倉儲玉米真菌微生物群落與儲藏3年的倉儲玉米真菌微生物群落具有明顯差異，在NMDS圖譜上(圖2a)，儲藏不同年份的倉儲玉米真菌微生物群落分別聚類，根據(jù)ANOSIM分析結(jié)果可知，這種差異聚類具有顯著性(P<0.05)。另外，儲藏3年的倉儲玉米中微生物群落的在各樣品間差異性更大，即β多樣性更高。為了找出隨倉儲年份變化而豐度發(fā)生顯著變化的真菌種類，對數(shù)據(jù)進行了LEfSe分析，結(jié)果如圖2b所示，與儲藏2年的倉儲玉米樣品微生物群落相比，儲藏3年的倉儲玉米樣品微生物群落中，念珠菌屬、毛霉屬(Mucor)、Mrakia屬的生物豐度更高，而青霉屬(Penicillum)、籃狀菌屬(Talaromyces)、Meyerozyma屬、肉座菌屬(Hypocrea)、帚枝霉屬(Sarocladium)以及3個未知屬的生物豐度變低。存儲時間是影響倉儲玉米中真菌微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，微生物群落是動態(tài)演替的，在倉儲的早期，收割或晾曬過程中的環(huán)境真菌附著在玉米表面，構(gòu)成了倉儲玉米的最初真菌群落，而隨著倉儲時間的延長，適于倉儲環(huán)境條件和玉米營養(yǎng)組成的真菌豐度逐漸提高，導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)的整體變化，直至真菌群落結(jié)構(gòu)趨于動態(tài)穩(wěn)定。因此，玉米倉儲時間對真菌群落組成的影響可能是真菌群落動態(tài)演替的表現(xiàn)。

圖1 倉儲玉米中真菌群落結(jié)構(gòu)的整體分析

圖2 倉儲玉米真菌群落的時間變化規(guī)律

2.4 玉米儲藏深度對其中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

倉儲玉米通常會堆積放置以節(jié)省空間，這導(dǎo)致了不同堆積位置的玉米所處的環(huán)境條件(如氧氣含量、溫度、濕度等)有所差異。采集了堆積在表層(M1、ES1、EN1、WS1、WN1)，中層(M2、ES2、EN2、WS2、WN2)，深層(M3、ES3、EN3、WS3、WN3)的倉儲玉米樣品，比較其微生物群落結(jié)構(gòu)的差異[19]。NMDS分析結(jié)果如圖3a所示，整體而言，微生物群落在圖譜上是隨著采樣深度而呈現(xiàn)梯度分布的，位于表層的樣品微生物群落與中層、深層樣品的微生物群落具有顯著的差異聚類(ANOSIMP<0.05)，但中層、深層樣品的微生物差異聚類未達到顯著水平(ANOSIMP=0.06)。差異菌群的熱圖分析也證實了這一點(圖3b)，樣品聚類結(jié)果表明表層樣品基本聚類在同一個分枝上，而中、深層樣品分布較為分散。尾孢菌屬(Cercospora)的樣品在表層樣品中的豐度更高，另外11個屬在中深層玉米樣品的豐度更高，這可能與這些微生物對含氧量、溫濕度的偏好性有關(guān)。

2.5 玉米在糧庫內(nèi)儲藏位置對其中真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

為了研究糧庫內(nèi)儲藏位置對玉米真菌群落結(jié)構(gòu)是否有影響，本研究從河南和黑龍江兩地的倉庫中分別取了位于倉庫中部(命名中字母為M)、東南方位(ES)、東北方位(EN)、西南方位(WS)、西北方位(WN)的玉米樣品進行真菌微生物群落結(jié)構(gòu)分析。依據(jù)圖2a和圖3a的結(jié)果所示，相同的方位的樣品并未發(fā)生在NMDS圖譜上的聚集情況，這表明倉庫中不同位置因素對玉米真菌群落結(jié)構(gòu)的影響小于存儲時間和存儲深度2個因素的對玉米真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，這可能是由于儲糧倉庫中不同位置的環(huán)境條件比較均一所導(dǎo)致的。

圖3 倉儲玉米堆積深度對真菌群落的影響

3 討論

微生物群落研究技術(shù)經(jīng)歷了培養(yǎng)法階段、分子生物學(xué)技術(shù)階段和高通量測序技術(shù)階段，每次技術(shù)的革新都使研究者能夠更加靈敏、準確地分析微生物群落組成。針對倉儲玉米微生物群落結(jié)構(gòu)特征，本團隊也曾利用分子生物學(xué)技術(shù)中的梯度變性凝膠電泳技術(shù)進行研究，共得到了20種微生物的豐度圖譜，而在本研究的高通量測序結(jié)果中，共得到了451個OTU的微生物豐度圖譜。高通量測序技術(shù)的助力，使本研究結(jié)果的準確性得到了大幅度的提升。在基于梯度變性凝膠電泳技術(shù)的研究中，倉儲玉米真菌群落的變化與儲藏時間具有較強的相關(guān)性，而與其在糧庫中的空間位置相關(guān)性較小，這一主要結(jié)論與本研究是基本一致的。在此基礎(chǔ)上，本研究更精確地分析出11種微生物隨儲藏時間變化而發(fā)生顯著變化，這是靈敏度較低的梯度變性凝膠電泳技術(shù)所難以實現(xiàn)的。

本研究的結(jié)果表明采樣地域(省份)、儲存時間和儲存深度對倉儲玉米中微生物群落具有較大的影響，而倉儲玉米在倉庫中的位置對倉儲玉米微生物群落影響較小。因此在建立倉儲玉米微生物群落的發(fā)生發(fā)展模型時，可以忽略倉庫內(nèi)部方位的因素，而將整個倉庫視為一個整體，以時間和深度為主要參數(shù)進行建模，而在不同地域(省份)，可能需要建立不同的數(shù)學(xué)模型來預(yù)測真菌微生物群落變化情況。另外，玉米樣品初始入庫時所攜帶的真菌孢子情況也可能會對真菌微生物群落具有重要影響，具體的影響規(guī)律有待于進一步的研究。

4 結(jié)論

倉儲玉米的真菌微生物群落在門水平上以子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌為主，在屬水平上以鐮刀菌屬、赤霉菌屬、念珠菌屬、球殼孢屬真菌為主。不同省份倉儲玉米真菌微生物群落存在差異，黑龍江倉儲玉米中子囊菌門真菌所占比例更高顯著高于河南省，而擔(dān)子菌門真菌所占比例顯著低于河南省。儲藏時間、儲藏深度等因素對倉儲玉米中的真菌群落組成有較大影響，而糧庫內(nèi)儲藏位置對倉儲玉米中的真菌群落組成影響較小。