戶小均，馬 驥，黃 丹

（綿陽市中心醫(yī)院，四川 綿陽 621000）

強(qiáng)直性脊柱炎（AS）是一種慢性炎癥性疾病，以髂骶關(guān)節(jié)、脊柱以及外周關(guān)節(jié)為主要病變部位，同時(shí)伴有不同程度的心血管、肺部病變。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，截至2019 年我國(guó)AS 患病率在0.44% 左右，男性的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高，且好發(fā)于青壯年群體，對(duì)患者家庭及社會(huì)均會(huì)造成一定負(fù)擔(dān)[1]。AS 具有一定的家族聚集性，屬于與遺傳相關(guān)的自身免疫性疾病，但患者免疫功能的改變與遺傳發(fā)病的機(jī)制目前并未闡明。關(guān)于AS 與T細(xì)胞亞群的研究存在較多爭(zhēng)議，有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的T 細(xì)胞亞群——輔助性T 細(xì)胞17（Th17）。該細(xì)胞屬于效應(yīng)CD4+T 細(xì)胞，來源于Th0，具有與Th1、Th2 差異的獨(dú)立分化途徑，且已有大量研究證實(shí)Th17在自身免疫性疾病、炎癥疾病中具有重要作用[2]。本研究為分析AS 患者外周血中Th17 的表達(dá)水平及其在疾病發(fā)生機(jī)制中的作用，對(duì)我院收治的AS 患者及同時(shí)期的健康受試者進(jìn)行對(duì)比，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2021 年1 月至12 月收治的AS 患者30例為研究組，選擇同一時(shí)期于我院進(jìn)行體檢的健康受試者30 例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）研究組患者經(jīng)我院檢查確診為AS ；2）對(duì)照組受試者為本院體檢結(jié)果健康人群；3）簽署同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并其他自身免疫性疾病者；2）合并惡性腫瘤者；3）出現(xiàn)嚴(yán)重感染性疾病或高熱癥狀者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：1）不能參與研究全過程者；2）研究過程中出現(xiàn)突發(fā)性疾病且對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響者；3）未按照本研究要求進(jìn)行試驗(yàn)者。研究組中有男16 例、女14 例，年齡24 ～41 歲，平均（32.52±4.11）歲。對(duì)照組中有男17 例、女13 例，年齡23 ～40 歲，平均（32.51±4.09）歲。兩組受試者的性別、年齡對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)儀器 流式細(xì)胞儀（賽默飛世爾，Attune）；細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.2 檢測(cè)方法 1）Th17、Th1、Th2 ：抽取兩組受試者的靜脈血3mL，以肝素鈉抗凝，參照固定比例進(jìn)行全血細(xì)胞刺激培養(yǎng)4h，之后用磷酸鹽緩沖劑沖洗。分成5 管，分別在其中加入10μL 抗CD4 抗體進(jìn)行染色，置于室溫暗處30min。加固定劑50μL，室溫放置15min。加入4mL PBS 清洗劑，以1500r/min 轉(zhuǎn)速離心10min，去上清液，加通透劑30μL。之后分別在5 管中加入抗白細(xì)胞介素-17（IL-17）抗體、IL-4 抗體、γ 干擾素（IFN-γ）抗體、FTTC 以及PE 抗體進(jìn)行同種型對(duì)照，混合均勻后在室溫暗處放置15min。洗滌1 次，去上清液，加PBS500μL 支撐細(xì)胞懸液，待檢。2）人類白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）：分別在各反應(yīng)管中加入100μL 肝素鈉行抗凝處理，再加入相應(yīng)單克隆熒光抗體10μL，混勻，以同型抗體做陰性對(duì)照，室溫避光保存30 min，溶血。之后加入PBS4mL，以1500 r/min 轉(zhuǎn)速離心5min，洗滌2 次，去上清液，加PBS500μL 配置細(xì)胞懸液，待檢。陽性標(biāo)準(zhǔn)：分析細(xì)胞群百分比、平均熒光強(qiáng)度，HLA-B27*/B7-平均熒光強(qiáng)度＞8 或細(xì)胞群百分比＞90%表示呈陽性。3）紅細(xì)胞沉降率（ESR）：以魏氏法取受試者靜脈血3 mL 進(jìn)行檢測(cè)。4）C 反應(yīng)蛋白（CRP）：以速率散射比濁法取受試者靜脈血3 mL 進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)

1）對(duì)比組間Th17 的表達(dá)水平。2）對(duì)比組間Th1、Th2 的表達(dá)水平。3）分析研究組Th17 的表達(dá)水平與HLA-B27、CRP、ESR 之間的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將本研究數(shù)據(jù)錄入SSPS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用±s表示，行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用% 表示，行χ2 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)比組間Th17 的表達(dá)水平

研究組Th17 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 對(duì)比組間Th17 的表達(dá)水平（%，± s ）

表1 對(duì)比組間Th17 的表達(dá)水平（%，± s ）

組別 Th17研究組（n=30） 2.77±0.73對(duì)照組（n=30） 1.21±0.44 t 值 10.025 P 值 ＜0.001

2.2 對(duì)比組間Th1、Th2 的表達(dá)水平

研究組Th1 的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，Th2的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 對(duì)比組間Th1、Th2 的表達(dá)水平（%，± s ）

表2 對(duì)比組間Th1、Th2 的表達(dá)水平（%，± s ）

組別 Th1 Th2研究組（n=30） 3.77±0.91 4.22±1.01對(duì)照組（n=30） 4.88±1.01 3.04±0.77 t 值 4.472 5.089 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 研究組Th17 的表達(dá)水平與HLA-B27、CRP、ESR 之間的相關(guān)性

研究組HLA-B27 的檢測(cè)結(jié)果為陽性，ESR為（32.54±2.24）mm/h，CRP 為（31±9）mg/L。經(jīng)Spearman 分析發(fā)現(xiàn)：研究組Th17 的表達(dá)水平與HLA-B27 百分比、HLA-B27 平均熒光強(qiáng)度及ESR、CRP 無 明 顯 相 關(guān) 性（r=0.415、r=0.151、r=0.086、r=0.289，P均＞0.05），但Th17 的表達(dá)水平會(huì)隨著HLA-B27 百分比及HLA-B27 平均熒光強(qiáng)度的增加而升高。

3 討論

AS 起病緩慢且早期癥狀不明顯。此病患者的臨床表現(xiàn)主要為腰骶部鈍痛、晨僵或翻身困難，稍活動(dòng)后減輕，隨著病情進(jìn)展，疼痛會(huì)逐漸從腰椎進(jìn)展至胸椎、頸椎等，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生脊柱畸形。研究顯示，AS具有家族聚集性，此病患者的一級(jí)親屬患有AS 的概率高達(dá)30%。免疫因素在AS 的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用，目前共發(fā)現(xiàn)100 多種細(xì)胞因子、趨化因子參與AS 的炎性反應(yīng)，AS 患者體內(nèi)的免疫炎癥因子水平要高于正常人群[3]。大量研究證實(shí)，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）相比，AS 患者體內(nèi)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IFN-γ 的分泌量均明顯減少。但也有研究指出，TNF-α 在AS 中呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，認(rèn)為該因子在多種脊柱關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[4]。近年來有研究證實(shí)，參照細(xì)胞發(fā)育、功能及分泌細(xì)胞因子作用的差異，CD4+T 淋巴細(xì)胞應(yīng)細(xì)化為Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及Th17 四大亞群[5]。Th17 亞群分化、功能均受Th1 和Th2 因子的影響，而IL-17 能夠在免疫、防御中起到重要作用，生成調(diào)控粒細(xì)胞，阻斷細(xì)胞外病原體入侵。

近年來臨床上關(guān)于Th17 亞群的產(chǎn)生、分化機(jī)制及在RA 中表達(dá)水平的研究較多，但關(guān)于其在AS 中的表達(dá)情況及在本病發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)制的研究較少。本研究借助流式細(xì)胞術(shù)分析AS 患者體內(nèi)Th17 表達(dá)水平與健康受試者的差異，以及Th17 在AS 進(jìn)展過程中的作用機(jī)制[6]。本研究顯示，研究組Th17 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；研究組Th1 的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，Th2 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。原因在于，Th1、Th2 及Th17 型細(xì)胞因子之間關(guān)系復(fù)雜，且IL-17 主要是通過促進(jìn)細(xì)胞、核因子受體活化而發(fā)揮作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β、IL-6等具有促進(jìn)Th17 分化的能力，而IFN-γ 則具有強(qiáng)烈抑制Th17 產(chǎn)生的作用。在加入抗IFN-γ 抗體的Th17培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)IL-17 的水平升高。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，與野生型小鼠相比，IFN-γ 基因敲除的小鼠體內(nèi)IL-17的分泌量相對(duì)較高[7-8]。本研究顯示，研究組HLA-B27的檢測(cè)結(jié)果為陽性，ESR 為（32.54±2.24）mm/h，CRP 為（31±9）mg/L；經(jīng)Spearman 分析發(fā)現(xiàn)：研究組Th17 的表達(dá)水平與HLA-B27 百分比、HLA-B27平均熒光強(qiáng)度及ESR、CRP 無明顯相關(guān)性（r=0.415、r=0.151、r=0.086、r=0.289，P均＞0.05），但Th17的表達(dá)水平會(huì)隨著HLA-B27 百分比及HLA-B27 平均熒光強(qiáng)度的增加而升高。原因在于，AS 患者體內(nèi)存在Th1 嚴(yán)重缺損或Th17 過度表達(dá)的情況，抑制了Th1 的分化，導(dǎo)致IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6 等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平增高，促使AS 的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，AS 患者外周血中Th17、Th2 數(shù)目增多，Th1 數(shù)目減少，其體內(nèi)Th 細(xì)胞存在失衡情況，提示Th17 參與了AS 整個(gè)免疫異常變化的過程且在其中發(fā)揮著重要作用。