毛玉帥, 段亞冰,2, 周明國*,,2

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院 農(nóng)藥系，南京 210095；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)藥抗性與治理技術(shù)研究中心，南京 210095)

1965 年加拿大尤尼羅亞爾 (Uniroyal) 公司申請了氧硫雜芑順式丁烯酰替苯胺類殺菌劑萎銹靈(carboxin，2,3-二氫-5-(N-甲酰苯胺)-6-甲基-1,4-氧硫雜芑) 的專利 (US1965451048)，并于1966 年商品化，用于種子和土壤處理，防治作物黑穗病。萎銹靈對擔(dān)子菌的?；?、內(nèi)吸輸導(dǎo)性和治療作用，引起了人們對其作用機制和克服其易被氧化及光解問題的研究。1970 年美國蒙大拿州立大學(xué)的Mathre 發(fā)現(xiàn)萎銹靈的作用靶標是呼吸鏈中的琥珀酸脫氫酶 (復(fù)合物II)，后來進一步研究發(fā)現(xiàn)，萎銹靈作用于琥珀酸脫氫酶B 亞基[1]。經(jīng)過20 多年的研究探索，至20 世紀80 年代中后期，日本住友化學(xué)株式會社、組合化學(xué)工業(yè)株式會社、日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)株式會社分別開發(fā)出呋吡菌胺(furametpyr)、滅銹胺 (mepronil) 和噻呋酰胺(thifluzamide)，并于90 年代商品化用于防治水稻紋枯病。此后，各大農(nóng)藥企業(yè)進一步基于靶標結(jié)構(gòu)生物學(xué)紛紛研發(fā)出結(jié)構(gòu)多樣、廣譜、高效、低毒、持效性長的琥珀酸脫氫酶抑制劑 (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHIs)，目前已經(jīng)成為繼麥角甾醇生物合成抑制劑類 (ergosterol biosynthesis inhibitors, EBIs) 和Qo 位點呼吸抑制劑類 (quinone outside inhibitors, QoIs) 之后，殺菌劑市場占有率第3 大的新型選擇性殺菌劑。但是，隨著SDHIs 殺菌劑的大量使用，多種植物病原真菌已經(jīng)對該類藥劑產(chǎn)生了抗性，且抗性菌株在病原群體中的比例和抗性發(fā)生范圍不斷升高，如果不能及時采取抗藥性治理措施，必將影響這類殺菌劑的使用壽命。2010 年，Avenot 綜述了SDHIs 殺菌劑的作用機制和抗性進化機制[2]，2013 年，Sierotzki 綜述了SDHIs 殺菌劑的抗性研究進展[3]。本文闡述SDHIs 殺菌劑的發(fā)展史及其作用機制，重點綜述植物病原真菌對該類藥劑的抗性發(fā)生發(fā)展、抗性機制及抗性治理策略。

1 SDHIs 殺菌劑的開發(fā)和分類

SDHIs 是作用于細胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物II 的新型殺菌劑，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有酰替苯胺活性基團，又稱酰替苯胺類殺菌劑，根據(jù)酰胺鍵連接的官能團不同又可細分為吡唑酰胺類、吡啶酰胺類、苯基酰胺類等。SDHIs 殺菌劑屬線粒體呼吸鏈抑制劑，因真菌孢子萌發(fā)對能量及依賴能量代謝產(chǎn)生的小分子碳水化合物需求旺盛，以致SDHIs 殺菌劑對孢子萌發(fā)的抑制活性常常顯著高于對菌絲生長的抑制活性[4-5]。新型SDHIs 殺菌劑突破了早期開發(fā)的SDHIs 殺菌劑如萎銹靈等有關(guān)生物學(xué)和理化性質(zhì)的局限性，不僅對擔(dān)子菌表現(xiàn)很高的抗菌活性，而且對多種子囊菌同樣表現(xiàn)高活性，且克服了易被氧化光解的缺點，可以噴施防治多種作物病害[6-7]。自巴斯夫于2003 年上市抗菌譜廣、活性高、環(huán)境風(fēng)險低、內(nèi)吸性和傳導(dǎo)性好的啶酰菌胺 (boscalid) 以后，各大農(nóng)藥公司紛紛投入大量精力和財力開展了更加安全、高效、廣譜的新一代SDHIs 殺菌劑研發(fā)，并將其陸續(xù)商品化。如吡唑萘菌胺 (isopyrazam，2010 年，先正達)、聯(lián)苯吡菌胺 (bixafen，2011 年，拜耳)、氟唑菌苯胺 (penflufen，2012 年，拜耳)、異丙噻菌胺(isofetamid，2015 年，日本石原)、氟唑菌酰羥胺(pydiflumetofen，2018 年，先正達)、聯(lián)苯吡嗪菌胺 (pyraziflumid，2018 年，日本農(nóng)藥) 等陸續(xù)推向殺菌劑市場 (表1)。

自然界也存在天然的與SDHIs 殺菌劑結(jié)構(gòu)類似的活性物質(zhì)，如promysalin 是一種Pseudomonad aeruginosa的次生代謝物，具有抗菌活性，最初從植物根際中分離出來，親和蛋白圖譜 (affinitybased protein profiling) 鑒定表明，琥珀酸脫氫酶為該天然產(chǎn)物的生物學(xué)靶點[8]。目前，已經(jīng)有25 個SDHIs 類殺菌劑品種進入殺菌劑市場，此類產(chǎn)品已成為殺菌劑市場銷售額增長最為迅速的一類藥劑，在重要植物病害的化學(xué)防控中發(fā)揮巨大作用。

已有研究表明，SDHIs 殺菌劑的結(jié)構(gòu)包括酸片段、胺片段和酰胺鍵連接部分[9-10]。結(jié)合國際殺菌劑抗性行動委員會 (Fungicide Resistance Action Committee, FRAC) 2021 年公布的SDHIs 殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)細分歸納于表1[11]。

表1 琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類Table 1 Classification of the chemical structure of succinate dehydrogenase inhibitors fungicides

在SDHIs 的結(jié)構(gòu)中，活性基團為酰胺鍵 (氟唑菌酰羥胺為羥基酰胺鍵，氟唑菌酰羥胺在同類藥劑中活性極其優(yōu)異，可能與酰胺鍵的改造有關(guān))，其余兩個基團為改造基團[12]。有研究表明，酰胺鍵與胺片段的距離對藥劑的活性有顯著影響[13]。此外，苯甲酰胺類殺菌劑的氟吡菌胺 (fluopicolide)和我國自主研發(fā)的氟醚菌酰胺 (fluopimomide) 曾被認為是SDHIs 殺菌劑，根據(jù)最新的研究結(jié)果，F(xiàn)RAC 將氟吡菌胺和氟醚菌酰胺的作用機制歸為作用于細胞骨架和馬達蛋白的delocalisation of spectrin-like proteins 亞類 (作用機制編碼為B5，抗性編碼為 #43)[11]。

2 SDHI 殺菌劑的應(yīng)用現(xiàn)狀

SDHIs 殺菌劑以其廣譜性在殺菌劑市場上占據(jù)了重要地位。在我國，SDHIs 殺菌劑在各類糧食作物和經(jīng)濟作物病害防治上均有登記[14]。部分藥劑的單劑登記現(xiàn)狀見表2。

表2 SDHIs 殺菌劑在中國的病害登記情況Table 2 Disease registration of SDHIs fungicides in China

SDHIs 殺菌劑主要登記用于擔(dān)子菌、子囊菌和半知菌引起的植物病害的化學(xué)防治。由于SDHIs 殺菌劑作用位點單一，抗性風(fēng)險高，在產(chǎn)品登記上與其他產(chǎn)品復(fù)配成為了較好選擇。從目前上市的品種看，SDHIs 殺菌劑與主流的Qo 位點呼吸抑制劑類和麥角甾醇生物合成抑制劑類殺菌劑組合大大開拓了應(yīng)用范圍和防治譜[14-15]。

3 SDHIs 殺菌劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀

SDHIs 殺菌劑的固有抗性風(fēng)險被FRAC 歸類為中至高等。最早的SDHIs 殺菌劑抗性報道至少可追溯至1975 年，Gunatilleke 等在實驗室條件下通過誘導(dǎo)試驗獲得了萎銹靈抗性的構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans菌株[16]。21 世紀以來，殺菌劑的抗性問題逐漸引起人們的重視，與此同時SDHIs殺菌劑的應(yīng)用范圍也愈發(fā)廣泛，使用年限越來越長，該類藥劑的田間抗性問題也逐漸加重[17]。目前，SDHIs 殺菌劑的抗性問題已經(jīng)發(fā)生在多種病原菌上，涉及多個國家。在美國已檢測到開心果腐爛病菌Alternariaalternata抗啶酰菌胺菌株，且對萎銹靈表現(xiàn)出正交互抗性[18]；番茄早疫病菌Alternaria solani抗SDHIs 菌株[19]、馬鈴薯早疫病菌A. solani抗啶酰菌胺和吡噻菌胺菌株等[20]。在巴西小麥麥瘟病菌Pyricularia oryzae中，已檢測到氟唑菌酰胺的抗性菌株[21]，菊花白銹病菌Puccinia horiana種群中也已經(jīng)檢測到SDHIs 殺菌劑抗性[22]。在歐洲，已發(fā)現(xiàn)多種病原菌對SDHIs殺菌劑產(chǎn)生抗性，如小麥殼針孢菌Zymoseptoria tritici、蘋果黑星病菌Venturia inaequalis、馬鈴薯早疫病菌A. solani、百合葉枯病菌Botrytis elliptica和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum等[23]。在中國，小麥赤霉病菌Fusarium graminearum[24]、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea[25]、桃腐爛病菌A.alternata[26]、黃瓜靶斑病菌Corynespora cassiicola[27]等病原菌中均已出現(xiàn)SDHIs 殺菌劑抗性種群。隨著SDHIs 殺菌劑使用年限和范圍的增加，抗藥性問題呈現(xiàn)加重趨勢，延緩和治理SDHIs 殺菌劑的抗性已經(jīng)成為一個迫切需要解決的重要科學(xué)問題。

4 SDHIs 殺菌劑抗性分子機制

4.1 靶標基因點突變

植物病原真菌藥靶基因的遺傳分化決定了殺菌劑的選擇性，不同植物病原真菌藥靶基因編碼的氨基酸數(shù)量也存在一定差異。敏感的植物病原菌藥靶基因發(fā)生特異性突變可導(dǎo)致對殺菌劑產(chǎn)生不同水平的抗性。Mair 等建議，將所有的同類型殺菌劑抗性點突變進行規(guī)范化，統(tǒng)一命名，為殺菌劑靶標蛋白突變提出了一個統(tǒng)一的氨基酸標記系統(tǒng)，即不論實際位置如何，同源氨基酸位點都被賦予相同的數(shù)字，便于人們理解抗藥性位點[28]。線粒體復(fù)合物II 通常由SDHA、SDHB、SDHC 和SDHD4 個亞基組成，在已有的報道中，還未見SDHA亞基上出現(xiàn)抗藥性突變，已知主要的抗藥性突變位點集中在SDHB、SDHC、SDHD3 個亞基上。

隨著SDHIs 殺菌劑使用年限的增長，有關(guān)其抗性報道也逐步增多。根據(jù)近年來的相關(guān)抗性機制研究報道和FRAC 統(tǒng)計結(jié)果，將植物病原菌的抗藥性突變基因型歸納于表3。

表3 植物病原菌與SDHIs 殺菌劑抗性相關(guān)的點突變基因型Table 3 Genotypes of plant pathogenic bacteria related to SDHIs fungicide resistance

近年來，F(xiàn)RAC 聯(lián)合巴斯夫、拜耳、科迪華、先正達、富美實、安道麥、住友集團等企業(yè)在美國、巴西、歐洲等地區(qū)進行了多種病原的抗性監(jiān)測工作，并逐年在FRAC 官網(wǎng)上發(fā)布結(jié)果[23]。在SDHB、SDHC和SDHD亞基上的抗藥性突變形式有很多，甚至同一物種中存在各種不同形式的抗藥性點突變基因型[17,29,37,50-55]。在以上突變中SDHB亞基的突變在257、267 或272 位由組氨酸突變?yōu)槔野彼?異亮氨酸/精氨酸，225 位脯氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，在多物種中相對比較保守。但并非所有的田間突變都能引起藥敏性的變化，例如，小麥殼針孢菌田間抗藥性群體的突變BC266G、C-N33T、C-N34T 和C-L184W 已被驗證與SDHIs 殺菌劑藥敏性無關(guān)[23]。本研究團隊最新研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌SDHB-A11V 突變并非是SDHIs殺菌劑抗性突變位點，而SDHB-P226L 突變能引起SDHIs 殺菌劑的中等水平抗性[38]。

在抗藥性進化過程中，某些突變會伴隨一些生物適合度的下降，如生長速率、致病力等[56-57]。此外，由于一些真菌的多核現(xiàn)象，雜合突變體的抗藥性一直無法準確鑒定。我們在開展核盤菌 (多核絲狀真菌) 對SDHIs 殺菌劑抗性的相關(guān)研究中，通過人工點突變技術(shù)構(gòu)建了SDHB-P226L 的點突變載體，并通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，同源置換野生菌株中的SDHB基因，獲得的轉(zhuǎn)化子多為雜合子，生物適合度低，進一步對雜合子進行藥劑馴化，獲得了點突變純合子菌株，抗藥性水平與生物適合度均顯著提高[38]。劉西莉研究團隊在立枯絲核菌 (多核絲狀真菌) 的抗藥性研究中，對雜合體抗藥性突變菌株進行藥劑馴化，完成了雜合子純合化的遺傳變異，演化了真菌的抗藥性進化過程[30]。Bart 研究團隊建立了一套系統(tǒng)的劑量依賴型殺菌劑抗性誘導(dǎo)技術(shù)，用于評估SDHIs 殺菌劑的抗性風(fēng)險[33]。

4.2 SDHIs 殺菌劑的非靶標抗性

Yamashita 等率先在小麥殼針孢菌上報道了SDHIs 殺菌劑的非靶標抗性[58]。在歐洲采集的田間小麥殼針孢病原群體中發(fā)現(xiàn)了可以穩(wěn)定遺傳的抗藥性菌株，但在其SDHA、SDHB、SDHC和SDHD亞基上并未檢測到抗藥性突變位點。在交互抗性測定中發(fā)現(xiàn)，此種抗性僅僅存在于包括氟吡菌酰胺和異丙噻菌胺在內(nèi)的部分長雜環(huán)酰胺類SDHIs 殺菌劑，而對聯(lián)苯吡菌胺和氟唑菌酰胺等其他酰胺類SDHI 殺菌劑無正交互抗性[58]。非靶標抗藥性菌株和相同作用靶標的殺菌劑之間無交互抗性的發(fā)現(xiàn)，引起了人們對SDHIs 殺菌劑抗性與藥劑靶標的深入思考和探究。

通常情況下，靶標基因的突變和過表達是其對殺菌劑產(chǎn)生抗性的主要原因，但目前尚未有因琥珀酸脫氫酶相關(guān)亞基基因過表達而引起抗藥性的相關(guān)研究。然而，Mae 等發(fā)現(xiàn)在小麥殼針孢菌中，MFS1(major facilitator superfamily) 啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)座子插入引起了其對SDHIs 殺菌劑的抗性[59]；Sang 等在對氟吡菌酰胺不敏感的大豆猝倒病菌Fusarium virguliforme菌株中，發(fā)現(xiàn)了MFS轉(zhuǎn)運體基因過量表達，同時，在酵母系統(tǒng)中，通過異源表達驗證了這種耐藥性[60]。這種耐藥性產(chǎn)生的原因為外源性物質(zhì)解毒相關(guān)基因過表達，引起細胞對藥劑的外排作用增強，從而降低了殺菌劑的毒力。

4.3 長雜環(huán)酰胺類(stretch heterocycle amide,SHA)SDHIs 與普通SDHIs 殺菌劑的抗性差異

本研究團隊發(fā)現(xiàn)，從黃瓜上分離的多主棒孢C. cassiicola發(fā)生了SDHB-H278R 點突變，導(dǎo)致其對啶酰菌胺產(chǎn)生抗性，但對SDHIs 殺菌劑氟吡菌酰胺 (屬于長雜環(huán)酰胺亞類) 不存在交互抗性。張曉珂等發(fā)現(xiàn)，在灰霉病菌中，氟吡菌酰胺與啶酰菌胺之間無交互抗性[61]。Ishii 等發(fā)現(xiàn)，在多主棒孢和瓜類白粉病菌Podosphaera xanthii中，對啶酰菌胺 (非雜環(huán)酰胺亞類) 和吡噻菌胺 (非長雜環(huán)酰胺亞類) 的抗性菌株對氟吡菌酰胺并未表現(xiàn)出交互抗性[62]。這些研究結(jié)果表明，病原菌對長雜環(huán)酰胺亞類SDHIs 與普通SDHIs 的抗性機制存在差異。

Steinhauer 等以“產(chǎn)生非靶標抗藥性的小麥殼針孢菌”為研究材料，探究了同類SDHIs 殺菌劑無交互抗性的原因[63]。通過正向遺傳學(xué)技術(shù)分析得到，小麥殼針孢菌Z. tritici部分種群中存在多個SDHC同源基因；并結(jié)合反向遺傳學(xué)技術(shù)，揭示了小麥殼針孢菌非靶標抗藥性產(chǎn)生的原因是由于SDHC3基因的存在，且抗性水平和SDHC3的表達水平及選擇性剪切效率的差異有關(guān)；同時，SDHC3啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)座子插入也介導(dǎo)了SHASDHI 殺菌劑的抗性。有趣的是，SDHC3的存在僅對SHA-SDHI 殺菌劑表現(xiàn)抗性，對其他非SHASDHI 殺菌劑并未表現(xiàn)出抗性，點突變策略和分子對接也進一步證實了SDHC3 為SHA-SDHI 殺菌劑的藥劑靶標[63]。這一發(fā)現(xiàn)從分子角度揭示了“藥-靶”互作機理，豐富了當前的SDHIs 殺菌劑的抗性機制研究。

4.4 SDHC 亞基遺傳分化對SDHIs 殺菌劑敏感性的調(diào)控研究

有趣的是，在不同的植物病原真菌中，琥珀酸脫氫酶的C 亞基可遺傳分化為多個亞型，且調(diào)控著病原菌對SDHIs 殺菌劑的敏感性。邵文勇等發(fā)現(xiàn)在灰霉病菌B. cinerea中，存在5 種不同的SDHC分化亞型，不同亞型的灰霉病菌對SDHIs殺菌劑的敏感性存在一定差異[64]?；颐共【鶶DHC不同亞型的遺傳分化，可能是在SDHIs 殺菌劑的選擇壓下導(dǎo)致的。然而在核盤菌S. sclerotiorum中，SDHC亞型的遺傳分化似乎與其對SDHIs 殺菌劑敏感性并無聯(lián)系，本研究團隊在核盤菌中發(fā)現(xiàn)SDHC亞基存在兩種亞型，兩者存在11 個氨基酸的差異，在田間病原群體的比例約為7 : 3，但核盤菌SDHC亞基遺傳分化的兩種亞型對SDHI殺菌劑的藥敏性并無顯著差異[38,65]。

Steinhauer 等發(fā)現(xiàn)，小麥殼針孢菌Z. tritici SDHC遺傳分化為3 個亞基 (SDHC1、SDHC2、SDHC3)，并證實SDHC3是SHA-SDHI 殺菌劑的藥劑靶標[63]。李美霞發(fā)現(xiàn)，在小麥赤霉病菌中存在兩個不同SDHC亞基 (SDHC1和SDHC2)，共同調(diào)控著該菌株對SDHIs 殺菌劑的敏感性[66]。當SDHC1敲除時，小麥赤霉病菌對SDHIs 殺菌劑的敏感性顯著增加，表現(xiàn)出超敏感；而當SDHC2敲除時，則其敏感性顯著降低，表現(xiàn)出抗藥性。此種調(diào)控機制，正如苯并咪唑類殺菌劑藥靶基因β-tubulin在小麥赤霉病菌中的遺傳分化，β1-tubulin負調(diào)控其對微管蛋白抑制劑的抗性，而β2-tubulin正調(diào)控其對微管蛋白抑制劑的抗性[67]。這種藥靶基因遺傳分化對SDHIs 殺菌劑的敏感性表現(xiàn)出雙向調(diào)控的現(xiàn)象，暗示了SDHC1，SDHC2可能競爭性地參與或調(diào)控著琥珀酸脫氫酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)形成，但其調(diào)控方式仍需通過蛋白質(zhì)互作與結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)進一步驗證。

5 SDHIs 殺菌劑抗性檢測/監(jiān)測方法

隨著具有單一作用位點的現(xiàn)代選擇性殺菌劑的飛速發(fā)展，抗藥性問題已成為必然。因此，開展抗藥性檢測/監(jiān)測研究，不僅能實現(xiàn)植物病原菌的抗藥性流行預(yù)警，而且可指導(dǎo)植物病害防控的精準選藥和科學(xué)施藥，保障我國的農(nóng)藥減量與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全?？顾幮詸z測/監(jiān)測技術(shù)是隨著現(xiàn)代選擇性殺菌劑的問世不斷發(fā)展起來的，可以分為以下3 個階段：

第1 階段是傳統(tǒng)的生物測定法，通過藥劑對菌絲生長或孢子萌發(fā)抑制的差異來判定菌株是否具有抗藥性，通過大量的抗性監(jiān)測數(shù)據(jù)和藥敏性測定結(jié)果優(yōu)化出區(qū)分劑量，用該方法篩選抗性菌株可減少工作量，如：桃腐爛病菌A. alternata等對SDHIs 殺菌劑的抗性檢測[68]。該方法需要經(jīng)過菌株的分離、純化和培養(yǎng)，需在含藥平板上進行抗藥性檢測，由于工作量大、周期長、效率低、檢測成本高，以致檢測的菌株數(shù)量有限，往往在檢測到抗性菌株時，病原菌群體中抗藥性菌株的比例已經(jīng)達到1%以上，在短期內(nèi)即可造成抗藥性病害流行，導(dǎo)致突發(fā)性危害的發(fā)生[69]。

第2 階段主要是基于藥靶基因突變后與野生菌株的核酸序列差異而開發(fā)的分子檢測方法。這一階段的檢測技術(shù)往往以聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)，最為有效、直接、準確的方式是通過擴增靶基因序列并測序，分析突變位點?；谛蛄胁町悾孟拗菩詢?nèi)切酶對擴增后的多態(tài)性核酸序列進行裂解，進而進行電泳分析。這種方法相對于測序的成本大大降低，被廣泛用來進行抗藥性突變檢測。其中，限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP，restriction fragment length polymorphism) 方法被用于檢測開心果晚疫病菌A.alternata、多寄主灰霉病菌B. cinerea對SDHIs殺菌劑抗性的點突變[57,70]。裂解擴增多態(tài)性序列(CAPS，cleaved amplified polymorphic sequence)被用于Clarireedia屬SDHIs 殺菌劑抗性的檢測[71]。等位基因PCR (AS-PCR，allele specific PCR) 被用于A. alternata對SDHIs 的抗性檢測[43]。一種基于PCR 的高分辨率溶解曲線法 (HRM，high-resolution melting) 用來檢測灰霉病菌B. cinerea SDHBH272R/Y 序列變化[72]。這一階段的抗藥性分子檢測技術(shù)，能夠在幾小時內(nèi)鑒定或診斷菌株的抗藥性，高通量定量PCR 技術(shù)能夠在病原群體中檢出萬分之一至十萬分之一的抗藥性基因頻率，實現(xiàn)抗藥性早期預(yù)警，解決了抗藥性病害突發(fā)和防控措手不及的問題[73]。但是，該階段的檢測技術(shù)需要昂貴的儀器和高級技術(shù)人員才能完成，仍然限制技術(shù)的推廣應(yīng)用。

第3 階段是基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù) (loopmediated isothermal amplification, LAMP)而發(fā)展的新的快速分子檢測方法。本研究團隊創(chuàng)造性地研究了基因擴增引物的堿基錯配技術(shù)，率先發(fā)明了可診斷藥靶基因單堿基突變的LAMP 抗藥性高通量快速檢測技術(shù)[74]，借助LAMP技術(shù)，在檢測水平上實現(xiàn)了質(zhì)的飛躍。2014 年，本研究團隊率先將LAMP 技術(shù)結(jié)合到植物病原菌抗藥性檢測方面，并開發(fā)了一系列配套技術(shù)，大大革新了病原菌抗藥性的的檢測技術(shù)[75-78]。此后，針對SDHIs殺菌劑抗性位點的LAMP 檢測技術(shù)也被開發(fā)[79-81]。LAMP 檢測技術(shù)無需昂貴的儀器設(shè)備和繁瑣的試驗操作過程，檢測靈敏度與檢測效率得到進一步提高。相應(yīng)的檢測技術(shù)已開發(fā)為快速檢測試劑盒，解決了檢測的時空限制問題，檢測條件極度簡化，田間地頭即可快速檢測。一臺水浴鍋或恒溫箱反應(yīng)1 h，即可通過肉眼觀察樣品顏色差異來判斷結(jié)果，簡便快捷，非常適合田間快速診斷，但該方法仍然存在著只能對抗藥性進行定性分析的缺陷。目前，本研究團隊正在研發(fā)新一代LAMP 抗藥性定量快速分子檢測技術(shù)，若該技術(shù)研發(fā)成功，有望將抗藥性檢測效率再提高100 倍以上，檢測成本降低至1%，未來的定量快速分子檢測技術(shù)十分令人期待。

6 SDHIs 殺菌劑抗性風(fēng)險與治理

FRAC 將SDHIs 殺菌劑的固有抗性風(fēng)險列為中至高等抗性風(fēng)險。長期單一使用SDHIs 殺菌劑，植物病原真菌對其極易產(chǎn)生抗性。盡管病原菌的SDHIs 殺菌劑靶標基因存在低、中、高水平抗藥性基因型，但同一種SDHIs殺菌劑的連續(xù)使用和加量使用，會殺死或抑制敏感和低抗水平的病原菌，加速形成中、高水平抗藥性群體，使SDHIs 殺菌劑失效。因此，延緩或阻止抗藥性群體發(fā)展是抗藥性治理的重要目標。

由于藥靶基因在不同的病原菌中存在分化，并存在不同的保守型，因此，在殺菌劑進入田間防治前，應(yīng)建立敏感性基線和開展抗性風(fēng)險評估，為科學(xué)用藥和抗性監(jiān)測提供科學(xué)依據(jù)。目前已有報道中，SDHIs 殺菌劑抗性菌株的抗性水平主要為中、低水平抗性，相較敏感群體，EC50值倍數(shù)在5～30 之間，此種抗性水平在藥劑選擇下有利于抗性群體的發(fā)展。

病原菌對殺菌劑發(fā)生抗性變異后的適合度是影響抗性群體發(fā)展的重要因素。桃腐爛病菌A.alternata SDHD-D123E 點突變的抗性菌株，產(chǎn)孢量下降，在氧化應(yīng)激壓力下生長速率降低[26]，說明在沒有藥劑選擇壓下，抗藥性病菌在群體中的比例會下降。然而，馬鈴薯葉枯病菌A. alternata和A. solani攜帶SDHB-H277Y/R 和SDHD-D123E點突變菌株，無明顯適合度變化[51]，草莓灰霉病菌B. cinerea攜帶SDHB-H272R/Y/L、SDHB-P225F和SDHB-N230I 點突變的菌株，也無明顯適合度變化[82]。大多數(shù)研究表明，SDHIs 殺菌劑抗性病原菌的適合度與野生敏感群體相比，并無明顯下降，說明在藥劑選擇下，抗藥性病原群體會發(fā)展較快。在殺菌劑進入田間應(yīng)用以后，實時動態(tài)監(jiān)測/檢測田間病原菌的抗藥性發(fā)生動態(tài)，對于抗藥性早期預(yù)警、儲備抗藥性治理技術(shù)、評價抗藥性治理策略及技術(shù)的有效性等具有重要意義。

抗藥性病害流行不僅取決于抗藥性菌株在群體中的比例，更取決于抗藥性病原菌的絕對數(shù)量。當病原菌群體在自然界的數(shù)量巨大時，即使抗藥性病菌未成為優(yōu)勢種群，在藥劑防治時剩下的抗藥性病菌也足以引起病害流行。因此，能夠降低藥劑選擇壓，如利用抗病品種、生物防治等病害綜合防治策略均有利于延緩抗藥性群體發(fā)展。Samaras 等發(fā)現(xiàn)，生防菌Bacillus amyloliquefaciens在與氟吡菌酰胺的交替使用中對灰霉病菌表現(xiàn)出較高的抑制作用，并降低了SDHIs 類殺菌劑的抗性頻率[83]。病害發(fā)生嚴重度直接關(guān)系到病原群體的發(fā)展，凡是有利于降低病害壓力的農(nóng)藝措施，如田園衛(wèi)生及通風(fēng)透光等栽培措施均是抗藥性治理策略與技術(shù)的重要組成部分。

SDHIs 殺菌劑種類多，結(jié)構(gòu)差異大，盡管FRAC 給予了這些殺菌劑相同的抗性分類編碼(#7)，屬于同一交互抗性組，但是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些病原菌對長雜環(huán)酰胺類SDHIs 殺菌劑和普通SDHIs 殺菌劑并無交互抗性。因此作者認為，在明確所防治的病原群體對SDHIs 殺菌劑之間存在交互抗性條件下，或可考慮混用或輪用不同亞類的SDHIs 殺菌劑或以不同類型SDHI 殺菌劑來緩解SDHIs 殺菌劑抗性[58,63]。

在推薦SDHIs 殺菌劑與其他作用機制的藥劑(QoIs 殺菌劑和EBIs 殺菌劑) 以復(fù)配的方式使用時，不僅應(yīng)該遵循增效原則和無藥害原則，而且必須考慮是否有利于抗藥性治理[84]。不同作用方式的殺菌劑如果存在相同的抗藥性機制也不應(yīng)該混合使用，如相同的增加藥劑外排抗性機制、相同化學(xué)基團的降解與解毒機制等。值得注意的是，那些抗性機制和作用方式不同的兩種高抗性風(fēng)險殺菌劑也應(yīng)謹慎混合使用，防止在短時間內(nèi)病原菌對兩種殺菌劑均產(chǎn)生抗性，枯竭有效的殺菌劑資源，如使用SDHIs殺菌劑與QoIs 殺菌劑混劑防治蔬菜灰霉病，很快會使灰霉菌對這兩種類型的殺菌劑產(chǎn)生高水平抗性群體[46]。

研發(fā)作用機制新穎、沒有交互抗性的新型殺菌劑是治理抗藥性的根本措施。針對藥靶變異的生物學(xué)信息設(shè)計和創(chuàng)制反抗性殺菌劑，對于治理重要殺菌劑分子靶標抗性具有重要價值。然而，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)挖掘和發(fā)現(xiàn)殺菌劑新的分子靶標、發(fā)現(xiàn)調(diào)控藥-靶互作的關(guān)鍵蛋白、解析和發(fā)現(xiàn)靶標蛋白新的藥敏性結(jié)構(gòu)域等，是靶向新型殺菌劑和靶向增效劑創(chuàng)制的理論基礎(chǔ)。

7 展望

當前，SDHIs 殺菌劑在全球殺菌劑市場中仍處于上升期，SDHIs 殺菌劑仍有廣闊的市場需求，因此開展SDHIs 殺菌劑的抗性研究，對于延緩其抗藥性發(fā)展速度，開發(fā)新型高活性的SDHIs殺菌劑仍具有重要意義。同時當前的SDHIs 殺菌劑與植物病原菌藥劑靶標之間的研究結(jié)果也加深了人們對藥靶互作的理解，豐富了SDHIs 殺菌劑的作用機制研究，為SDHIs 殺菌劑的反抗性藥劑或者難以產(chǎn)生抗性的新藥劑研發(fā)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[85]。自然界天然的與SDHIs 殺菌劑結(jié)構(gòu)類似的活性物質(zhì)，與當前的酰胺類殺菌劑具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)，這也啟發(fā)了科學(xué)家開展新型SDHIs 殺菌劑的研發(fā)[8]，同時也從側(cè)面印證了SDHIs 殺菌劑的環(huán)境安全性。此外，通過修飾和改造現(xiàn)有殺菌劑，研發(fā)高選擇性、高活性、高安全性、低風(fēng)險的SDHIs 殺菌劑仍在進行，各種抗藥性檢測技術(shù)的發(fā)展也為SDHIs 殺菌劑的抗藥性監(jiān)測提供了技術(shù)保障?？梢灶A(yù)見，SDHIs 殺菌劑仍將在未來的農(nóng)藥市場中發(fā)揮中流砥柱的作用。

謹以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

毛玉帥，男，2018 年畢業(yè)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，獲農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。2020 年畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，獲農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位，同年，于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥系師從周明國教授繼續(xù)攻讀博士學(xué)位，主要從事殺菌劑生物學(xué)及植物病原菌抗藥性研究。

周明國，男，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教授。1982 年畢業(yè)于南京農(nóng)學(xué)院(現(xiàn)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)) 并留校工作，1999 年獲中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位。主要從事殺菌劑生物學(xué)和農(nóng)作物病害防控理論與技術(shù)研究。現(xiàn)任國際植物病理學(xué)會病害控制委員會組委、中國農(nóng)藥發(fā)展與應(yīng)用協(xié)會殺菌劑專業(yè)委員會主任委員及《農(nóng)藥學(xué)學(xué)報》編委。1990 年和1993 年分別入選歐盟為中國培養(yǎng)100 名博士后和25 名跟蹤培養(yǎng)人才計劃，1 9 9 8 年享受國務(wù)院特殊津貼。先后主持完成歐盟、UNIDO、ICGEB 政府性及先正達、巴斯夫農(nóng)藥企業(yè)的重大國際合作項目和國家973 課題、863 和948 項目、行業(yè)專項、國家自然科學(xué)基金重點及面上項目及省部級科技項目近30 項。獲國家科技進步二等獎3 項（第1 完成人2 項，第3 完成人1 項），光華工程科技獎、江蘇省專利發(fā)明人獎、中國農(nóng)藥工業(yè)協(xié)會農(nóng)藥創(chuàng)新獎突出貢獻獎等。發(fā)表研究論文400 余篇，獲國家發(fā)明專利45 件，國際專利7 件。