林杰 錢佶 蔣國軍 陳明治

食管癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均居高不下［1-3］。轉(zhuǎn)移是食管癌高病死率的主要原因之一［4］。中性粒細胞和淋巴細胞是機體含量最多的先天性免疫細胞，與食管癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)［5］。近年來的研究表明中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NET）在腫瘤的局部生長和遠處轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色［6］。Zhang 等［7］的研究證實術(shù)前腫瘤中NET 含量的增加與食管癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。但尚未見NET 生成與食管癌遠處轉(zhuǎn)移的研究報道，因此，本研究將檢測食管癌患者外周血中NET 含量，采用logistic 回歸分析和受試者操作特征（ROC）曲線評價NET 生成的相關(guān)指標對食管癌遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值，旨在為食管癌的防治提供新視角。

對象與方法

一、研究對象

前瞻性選取2020 年1 月至2021 年12 月在本院就診的60 例中晚期食管癌患者為研究對象，根據(jù)是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移將其分為非遠處轉(zhuǎn)移組（35例）和遠處轉(zhuǎn)移組（25 例）。納入標準：①成年人（年齡 ≥18 周歲）；②經(jīng)纖維胃鏡及病理組織學(xué)檢查確診食管癌。排除標準：①合并嚴重血液疾??；②合并其他惡性腫瘤；③合并感染；④合并嚴重的難以控制的糖尿病。匹配30 名同期在本院進行體檢的健康志愿者作為對照組。本研究獲得本院倫理委員會批準（意見號：倫申2022 文112）。所有入組者均對本研究知情同意，并簽署知情同意書。3 組的基本資料具可比性，見表1。

表1 2 組食管癌患者與健康志愿者基本資料比較

二、雙抗體夾心法檢測外周血中NET［髓過氧化物酶（MPO）-DNA］含量

采用EDTA 抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL，在室溫條件下600×g 離心10 min，收集上清液，采用雙抗體夾心法檢測NET 含量。具體方法如下：將抗MPO 單克隆抗體（購自Merck Millipore Corp 公司）包被于96 孔培養(yǎng)板中，置于4℃冰箱孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗洗滌3 次后加入5%牛血清白蛋白（BSA），室溫封閉2 h。用PBS 洗滌后加入上述上清液標本，室溫孵育2 h。再次洗滌3 次后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗DNA 單克隆抗體（DNA-HRP， 購自Roche Diagnostics 的細胞凋亡ELISA 檢測試劑盒），室溫孵育2 h。洗滌3 次，加入二銨鹽，避光室溫孵育1 h。在多功能酶標儀中檢測吸光度（OD405），用其表示外周血NET 含量。

三、中性粒細胞與淋巴細胞比值（NLR）

收集3 組的中性粒細胞計數(shù)和淋巴細胞計數(shù)，計算NLR，公式為NLR=中性粒細胞計數(shù)/淋巴細胞計數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗（2 組）或單因素方差分析（3 組及以上）；3 組以上數(shù)據(jù)間的兩兩比較采用LSD 法。非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman 相關(guān)分析探討外周血NET 含量與食管癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，采用Pearson 相關(guān)分析探討NET 含量與NLR 的相關(guān)性；采用logistic 回歸分析外周血NET 含量是否為食管癌遠處轉(zhuǎn)移的危險因素；采用ROC 曲線評估外周血NET 含量對食管癌遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值，并計算曲線下面積（AUC）。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血NET 含量與食管癌遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)

與對照組相比，食管癌患者外周血NET（MPO-DNA）含量和NLR 均升高，且遠處轉(zhuǎn)移組高于非遠處轉(zhuǎn)移組（NET：F = 61.486，P ＜ 0.001；NLR：F = 38.123，P ＜ 0.001），見表2。

表2 不同組研究對象外周血NET 含量及相關(guān)中性粒細胞指標的差異

Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示：外周血中NET含量（r = 0.770， P ＜ 0.001）和NLR（r = 0.6943，P ＜ 0.001）均與食管癌遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示：食管癌患者外周血NET 含量和NLR 亦密切相關(guān)（r = 0.404， P = 0.001）。

二、外周血NET 生成是食管癌遠處轉(zhuǎn)移的獨立危險因素

以食管癌是否遠處轉(zhuǎn)移為因變量，以外周血NET 含量和NLR 為自變量進行多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示：患者外周血NET 含量升高是食管癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的獨立危險因素。見表3。

表3 食管癌轉(zhuǎn)移患者危險因素的多因素logistic 回歸分析

變 量 截斷值 AUC 值 P 值 95%CI 靈敏度/ % 特異度/ %外周血NET 含量 1.13 0.837 ＜ 0.001 0.737～0.937 76.00 74.29 NLR 2.18 0.664 0.021 0.525～0.803 60.00 71.43 NET 聯(lián)合NLR - 0.843 ＜ 0.001 0.744～0.943 84.00 77.14

三、外周血NET 生成對食管癌遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示：外周血NET 含量預(yù)測食管癌遠處轉(zhuǎn)移的AUC 大于NLR（Z = 1.979，P = 0.048）；NET 聯(lián)合NLR 能夠提高預(yù)測食管癌遠處轉(zhuǎn)移的特異度和靈敏度。見表4 和圖1。

圖1 ROC 曲線評價外周血NET 含量對食管癌遠處轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值

四、食管癌遠處轉(zhuǎn)移的亞組分析

根據(jù)ROC 曲線分析的NET 和NLR 的截斷值將食管癌患者分為2 組，分別對2 組患者遠處轉(zhuǎn)移率進行分析，結(jié)果顯示：外周血NET 含量 ≥1.13的食管癌患者遠處轉(zhuǎn)移率高于NET 含量 ＜ 1.13 患者（P ＜ 0.001）；NLR ≥2.18 的食管癌患者遠處轉(zhuǎn)移率高于NLR ＜ 2.18 患者（P ＜ 0.05）。見表5。

表5 食管癌遠處轉(zhuǎn)移的亞組分析

討 論

隨著對腫瘤發(fā)生和發(fā)展規(guī)律的深入研究，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要角色［8］。中性粒細胞可以分泌血管生長因子，促進腫瘤血管生成，加快腫瘤生長速度［9］。淋巴細胞是機體抗腫瘤的重要細胞之一，參與腫瘤細胞的凋亡過程［10］。NLR 反映機體炎性反應(yīng)和抗炎反應(yīng)之間的平衡，是預(yù)測炎癥性疾病預(yù)后的重

表4 ROC 曲線分析結(jié)果要指標［11］。近年來的研究亦表明NLR 與食管癌臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，可以作為食管癌和重癥胰腺炎患者預(yù)后的評估指標［5，12-15］。本研究亦提示術(shù)前外周血NLR ≥2.18 的食管癌患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的風(fēng)險高于NLR ＜ 2.18 患者。但NLR 預(yù)測食管癌的AUC、靈敏度和特異度均不佳，不適宜用于臨床診斷。分析其原因主要為中性粒細胞和淋巴細胞計數(shù)的影響因素眾多，因此不能真實反映腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。

NET 是中性粒細胞捕殺入侵病原微生物的重要手段，然而近年來的研究顯示NET 與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Ho-Tin-Noé 等（2009 年）在肺癌小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在腫瘤相關(guān)的中性粒細胞和細胞外染色質(zhì)的積聚，提示NET 在腫瘤組織中存在的可能［16］。Berger-Achituv 等（2013年）首次觀察到腫瘤組織內(nèi)NET 生成量的增加與尤因肉瘤患者不良預(yù)后有關(guān)［17］。隨后，越來越多的證據(jù)表明NET 通過促進腫瘤細胞離開原發(fā)部位、降解細胞外基質(zhì)、捕獲循環(huán)中的腫瘤細胞、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)化和促進血管生成來影響腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移［18］。Zhang 等（2020 年）的研究證實了術(shù)前腫瘤組織中NET 含量的增加與食管癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)［7］。但目前尚不清楚NET 生成在食管癌轉(zhuǎn)移中的作用。

本研究顯示，食管癌患者外周血NET 含量增加，且發(fā)生轉(zhuǎn)移患者外周血NET 含量高于未轉(zhuǎn)移患者。進一步研究顯示外周血NET 生成是食管癌遠處轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，檢測其含量能夠預(yù)測食管癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生，且其診斷價值優(yōu)于NLR；聯(lián)合兩者可以提高診斷的靈敏度和特異度。分析其原因主要考慮以下2 個方面：首先，食管癌患者體內(nèi)會形成一定的腫瘤微環(huán)境，大量的中性粒細胞被招募進入腫瘤微環(huán)境中，在多種因素刺激下形成NET，NET 通過與腫瘤細胞的相互作用促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。其次，腫瘤細胞所產(chǎn)生的各種因子作用于骨髓造血系統(tǒng)，導(dǎo)致外周血中性粒細胞計數(shù)顯著增加。

綜上所述，本研究證實了NET 生成是食管癌轉(zhuǎn)移的危險因素，檢測外周血NET 含量能夠預(yù)測食管癌轉(zhuǎn)移，聯(lián)合NLR 能夠提高NET 的預(yù)測價值。但本研究是單中心的小樣本研究，病例數(shù)較少，其結(jié)果需要多中心大樣本的研究來進一步驗證。