甘 爽， 陳志丹， 商 虎，3， 林 琳，3， 孫威江*，3

（1．福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) 安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3．福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

烏龍茶是我國(guó)六大茶類之一，屬半發(fā)酵茶，是我國(guó)的特色茶之一，因其特有的花香及醇厚鮮爽等風(fēng)味品質(zhì)而馳名中外。烏龍茶起源于我國(guó)福建，主產(chǎn)于我國(guó)的福建、廣東和臺(tái)灣地區(qū)，由于產(chǎn)地、茶樹品種和氣候條件等因素的不同，形成了各產(chǎn)地烏龍茶風(fēng)格特異的風(fēng)味特征[1]?，F(xiàn)階段，茶葉感官審評(píng)是評(píng)價(jià)茶葉品質(zhì)最普遍、最直觀的方式[2]，是依靠人的感官對(duì)茶葉品質(zhì)的綜合判定，而茶葉香氣占茶葉品質(zhì)感官評(píng)分的30%[3]，由此可見(jiàn)，茶葉香氣是茶葉感官品質(zhì)評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)[4]，而揮發(fā)性化合物不僅是茶葉香氣的重要組分，也是影響茶葉感官品質(zhì)的重要因素。傳統(tǒng)的香氣評(píng)分方式，很大程度上依賴于專業(yè)評(píng)茶師的個(gè)人喜好和自身經(jīng)驗(yàn)，且容易受環(huán)境、情緒等諸多因素的影響，審評(píng)結(jié)果較為主觀，很難被廣大消費(fèi)者所接受。而茶葉揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)的理化指標(biāo)檢測(cè)，一般采用常規(guī)的物理化學(xué)分析法和儀器分析法[5-9]，雖然這些方法較為客觀，但步驟復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法對(duì)茶葉的揮發(fā)性化合物指標(biāo)進(jìn)行快速檢測(cè)，因此迫切需要尋找一種客觀且快速、無(wú)損的技術(shù)對(duì)茶葉揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。

離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）是基于氣相中不同的氣相離子在電場(chǎng)中遷移速度的差異來(lái)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析的一項(xiàng)技術(shù)，是一種快捷的檢測(cè)分析手段[10]，與傳統(tǒng)GC-MS分析方法相比，GC-IMS技術(shù)不需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，具有檢測(cè)限低、簡(jiǎn)單易用、耗時(shí)短、成本低等特點(diǎn)，離子遷移譜已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，如油類的真假鑒別[11-13]、咖啡豆鑒別及儲(chǔ)藏時(shí)間鑒定[14]、食品風(fēng)味分析[15-23]。林若川等通過(guò)GC-IMS技術(shù)對(duì)云霧茶、翠尖茶和龍井茶進(jìn)行產(chǎn)地判別，但該技術(shù)在我國(guó)廣東、福建、臺(tái)灣地區(qū)所產(chǎn)烏龍茶香氣區(qū)分方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道[24]。因此，采用GC-IMS技術(shù)對(duì)我國(guó)廣東、閩南地區(qū)、閩北地區(qū)、臺(tái)灣地區(qū)不同產(chǎn)地烏龍茶中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)，并通過(guò)PCA、PLS-DA法對(duì)烏龍茶產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分，為烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)的快速檢測(cè)提供新的解決方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶選自國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)烏龍茶工作組（ISO/TC34/SC8/WG7）采集的烏龍茶樣品，均為2018年的春茶。如表1所示，選取我國(guó)最具代表性的4個(gè)產(chǎn)地（分別為廣東、閩南地區(qū)、閩北地區(qū)、臺(tái)灣地區(qū)）的烏龍茶樣品，其中廣東烏龍茶8個(gè)、閩南地區(qū)7個(gè)、閩北地區(qū)8個(gè)、臺(tái)灣地區(qū)6個(gè)，共對(duì)29個(gè)烏龍茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)分析。

表1 我國(guó)不同產(chǎn)地烏龍茶樣品信息Table 1 Information of oolong tea samples from different origins in China

Flavour Spec?風(fēng)味分析儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品；FW高速粉碎機(jī)：上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FA1004電子天平：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 審評(píng)方法由3名具備5年以上專業(yè)描述性審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的專家，4名具備3年以上審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的高級(jí)評(píng)茶員，合計(jì)7名審評(píng)人員，按照GB/T 23776—2018進(jìn)行感官審評(píng)，并對(duì)香氣進(jìn)行評(píng)分。

1.2.2 香氣檢測(cè)方法被分析的茶葉樣品于室溫下密封儲(chǔ)存，檢測(cè)前將茶樣用高速粉碎機(jī)磨碎并過(guò)80目篩，置于-20℃保存。檢測(cè)前用電子天平將每個(gè)樣品稱取0.2000 g，分別置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中并密封，樣品瓶按順序排列待檢，每個(gè)樣品重復(fù)3次。設(shè)置好儀器參數(shù)后，儀器按程序自動(dòng)工作，分析前10 min儀器將樣品瓶移至孵化區(qū)加熱并振蕩，進(jìn)樣針抽取500 μL頂空瓶?jī)?nèi)的氣體，注入色譜柱進(jìn)行分析。

色譜柱：FS-SE-54-CB-1；漂移氣：高純氮?dú)?，純度?9.999%；漂移氣流量：150 mL/min；色譜柱溫度：60℃；進(jìn)樣口溫度：80℃；IMS探測(cè)器溫度：45℃；漂移管溫度：40℃；頂空進(jìn)樣針溫度：90℃；進(jìn)樣量：500 μL；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min；頂空孵化溫度：70℃；孵化時(shí)間：10 min；分析時(shí)間：30 min；高純氮?dú)猓兌取?9.999%）清洗頂空針時(shí)間：5 min；載氣流量程序：起始流量2 mL/min，保持2 min后10 min內(nèi)線性增加至10 mL/min，保持10 min后30 min內(nèi)線性增加至130 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用儀器自帶的Laboratory Analytical Viewer分析軟件中的兩款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件）以及GC×IMS Library Search對(duì)樣品進(jìn)行定性、定量分析。采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用SIMCA 14.1進(jìn)行PCA、PLS-DA分析。使用Python進(jìn)行LDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性化合物氣相離子遷移譜圖分析

IMS譜圖中的每個(gè)特征峰代表一種揮發(fā)性有機(jī)成分，不同揮發(fā)性物質(zhì)在相應(yīng)位置有對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰，我國(guó)不同產(chǎn)地的烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)的出峰位置、數(shù)量大致相同，但各自含量有所差異。根據(jù)差譜原則，選擇揮發(fā)性成分較少的臺(tái)灣地區(qū)烏龍茶樣品作為參照進(jìn)行差譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。4個(gè)產(chǎn)地烏龍茶樣品的譜圖中，同一組分含量相同的部分顏色抵消為白色，紅色則表示該揮發(fā)性物質(zhì)的含量比參比樣品高，藍(lán)色則表示該揮發(fā)性物質(zhì)的含量比參比樣品低。在臺(tái)灣地區(qū)烏龍茶的樣品中，紅框部分揮發(fā)性物質(zhì)明顯低于其他3個(gè)產(chǎn)地烏龍茶，說(shuō)明各揮發(fā)性物質(zhì)的含量受產(chǎn)地影響。

圖1 不同產(chǎn)地烏龍茶樣品的GC-IMS差異圖譜Fig.1 GC-IMS differential atlas of oolong tea samples from different origins

2.2 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性化合物定性分析

從GC-IMS Library Search中利用離子遷移時(shí)間以及保留指數(shù)對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行了定性，這些物質(zhì)保留時(shí)間相近，但遷移時(shí)間有所不同。樣品的揮發(fā)性化合物定性分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 烏龍茶中揮發(fā)性化合物信號(hào)峰位置點(diǎn)Fig.2 Signal peaks of volatile compounds in oolong tea

表2中列出了檢測(cè)樣品中所有已鑒定的物質(zhì)，檢出的43種物質(zhì)可歸為9類，包含1種酚類、1種碳?xì)浠衔铩?種雜氧化合物、2種吡咯類、2種酯類、5種酸類、6種酮類、11種醇類和13種醛類。

表2 不同產(chǎn)地烏龍茶中揮發(fā)性物質(zhì)的定性Table 2 Volatile compounds identified by GC-IMS of oolong tea from different origins

續(xù)表2

2.3 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的指紋圖譜分析

使用Gallery Plot插件生成不同產(chǎn)地烏龍茶的指紋圖譜（見(jiàn)圖3），橫軸方向?yàn)闃?biāo)記的特征離子峰，從左往右依次排列，其中每一行代表一個(gè)揮發(fā)性化合物，每一列表示不同樣品之間同一種揮發(fā)性化合物的對(duì)比。特征離子峰顏色的深淺程度代表?yè)]發(fā)性化合物含量的高低，顏色越亮，含量越高，反之，則越低。根據(jù)圖譜能對(duì)不同烏龍茶之間揮發(fā)性化合物差異進(jìn)行直觀比較。如圖3所示，我國(guó)不同產(chǎn)地烏龍茶樣品差異顯著，如廣東烏龍茶中2-乙基吡嗪、檸檬烯、2，6-二甲基吡嗪含量較高；閩南地區(qū)烏龍茶中苯甲醛、辛醛、庚醛、己醛、正丁酸、反-2-庚烯醛、3-辛酮含量較高；閩北地區(qū)烏龍茶中對(duì)乙基苯酚、癸醛、2-庚酮、反-2，4-庚二烯醛、γ-丁內(nèi)酯、5-甲基糠醛、反-2-辛烯醛、苯乙醇、2-甲基丁醇、甲基苯甲醇、順-3-壬烯醇含量較高；臺(tái)灣地區(qū)烏龍茶中2-庚酮、糠醛、γ-丁內(nèi)酯、2-乙酰基呋喃、戊醇、乙酸、正己醛、2-己酮、戊醛、丙酸含量較高。

圖3 我國(guó)烏龍茶中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of volatile compounds in oolong tea in China

2.4 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的主成分分析

不同揮發(fā)性物質(zhì)的特征峰對(duì)應(yīng)不同的響應(yīng)強(qiáng)度，這些特征峰強(qiáng)度能反映茶葉樣品之間的差異。根據(jù)指紋圖譜，可直接觀察特征峰的顏色亮度對(duì)不同產(chǎn)地烏龍茶進(jìn)行區(qū)分，但為了避免直接觀察過(guò)于主觀，利用Laboratory Analytical Viewer分析軟件中的插件讀取各個(gè)揮發(fā)性化合物的峰值強(qiáng)度，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，進(jìn)行PCA分析，從而對(duì)不同烏龍茶樣品進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分，結(jié)果見(jiàn)圖4。其中PC1的貢獻(xiàn)率為54.2%，PC2的貢獻(xiàn)率為19.4%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為73.6%。4個(gè)產(chǎn)地的烏龍茶樣品基本能夠區(qū)分開，說(shuō)明該技術(shù)能有效區(qū)分不同產(chǎn)地的烏龍茶。同時(shí)，因?yàn)椴煌a(chǎn)地間烏龍茶制作工藝的相似性，使得組別間有較為接近的部分，這一點(diǎn)在圖4也有體現(xiàn)；此外，組內(nèi)的樣品，雖屬同一個(gè)產(chǎn)地，但由于品種差異等因素，使得其自身品質(zhì)也有所差異，致使數(shù)據(jù)點(diǎn)也相對(duì)離散。

圖4 烏龍茶樣品GC-IMS特征變量的主成分分析Fig.4 PCA of GC-IMS characteristic variables of oolong tea samples

表3 我國(guó)不同產(chǎn)地烏龍茶的特征揮發(fā)性物質(zhì)Table 3 Characteristic volatile matter of oolong tea from different producing areas in China

2.5 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的偏最小二乘法判別分析

PLS-DA是一種聚類分析方法，通過(guò)擴(kuò)大組間差異、減少組內(nèi)差異，可以彌補(bǔ)PCA的缺點(diǎn)。其中PC1的貢獻(xiàn)率為54.2%，PC2的貢獻(xiàn)率為19.3%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為73.5%。圖5（a）證明該研究能將不同地區(qū)烏龍茶樣品很好地區(qū)分開，圖5（b）說(shuō)明該模型沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象，穩(wěn)定性較好，具有較好的預(yù)測(cè)能力。

因子載荷圖反映了每個(gè)變量對(duì)得分圖的貢獻(xiàn)，圖5（c）中每個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物，可通過(guò)它們與原點(diǎn)之間的距離來(lái)評(píng)估這些物質(zhì)對(duì)產(chǎn)地判別的貢獻(xiàn)度。變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）是通過(guò)PLS-DA載荷圖判別所得，通過(guò)VIP＞1共篩選出16種標(biāo)志揮發(fā)性化合物，見(jiàn)圖5（d）。篩選出的標(biāo)志揮發(fā)性化合物在圖5（c）中以紅色標(biāo)注，這16種揮發(fā)性化合物分別是：反-2，4-庚二烯醛（8）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（18）、糠醛（6）、丙醇（64）、反-2-己烯-1-醇（17）、2-甲基丙酸（13）、戊醇（23）、丙醇（63）、2-庚酮（3）、2-乙酰基呋喃（15）、γ-丁內(nèi)酯（10）、正己醛（40）、5-甲基糠醛（20）、丙酸（53）、苯甲醛（22）、氧化芳樟醇（56），這些物質(zhì)對(duì)4個(gè)產(chǎn)地烏龍茶的區(qū)分有突出貢獻(xiàn)。

圖5 烏龍茶樣品GC-IMS特征變量的PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of GC-IMS characteristic variables of oolong tea samples

2.6 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的線性判別分析

LDA是對(duì)費(fèi)舍爾的線性鑒別方法的歸納，這種方法使用統(tǒng)計(jì)學(xué)、模式識(shí)別和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，試圖找到事件特征的一個(gè)線性組合，以能夠特征化或區(qū)分它們[10]。采用LDA算法進(jìn)一步研究烏龍茶產(chǎn)地識(shí)別的可能性，以我國(guó)4個(gè)不同產(chǎn)地的29個(gè)烏龍茶樣本建立對(duì)應(yīng)的產(chǎn)地判別模型。分別選取不同產(chǎn)地烏龍茶樣品數(shù)量的75%樣品作為訓(xùn)練集，剩余25%樣品量作為預(yù)測(cè)集，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4，判別結(jié)果見(jiàn)圖6，準(zhǔn)確率均為100%，表明該模型穩(wěn)健、可靠。由此可知，采用LDA算法可以較好地用于對(duì)烏龍茶產(chǎn)地的判別。

圖6 我國(guó)不同產(chǎn)地烏龍茶樣品的LDA判別結(jié)果Fig.6 LDA discrimination of oolong tea samples from different areas in China

表4 LDA模型鑒別我國(guó)烏龍茶產(chǎn)地的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 Statistical results of Chinese oolong tea identified by LDA model

3 結(jié)語(yǔ)

采用GC-IMS技術(shù)分析我國(guó)不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性化合物的差異，對(duì)29個(gè)來(lái)自不同產(chǎn)地的烏龍茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)，鑒定出43種揮發(fā)性物質(zhì)，可分為9類，包含1種酚類、1種碳?xì)浠衔铩?種雜氧化合物、2種吡咯類、2種酯類、5種酸類、6種酮類、11種醇類和13種醛類。

由IMS圖譜可知，我國(guó)不同產(chǎn)地烏龍茶的揮發(fā)性物質(zhì)差異主要體現(xiàn)在含量上。由前人研究可知，輕火烘焙的烏龍茶一般帶有清香或淡花香；中火烘焙則帶有花香或花果香；足火烘焙后的烏龍茶具有明顯果香或果糖香；而高火烘焙則具有明顯焦糖香或火功香[25]。實(shí)驗(yàn)選擇的閩南地區(qū)烏龍茶以清香為主，焙火程度最輕，其次是廣東烏龍茶、臺(tái)灣地區(qū)烏龍茶，焙火溫度最高的則是閩北地區(qū)烏龍茶，產(chǎn)生這些香氣特征主要是由焙火溫度引起的，因此造成了4個(gè)產(chǎn)地烏龍茶風(fēng)格各異的香氣特征。這與該研究中檢測(cè)到的呈香揮發(fā)性物質(zhì)特征規(guī)律大體是一致的。檢測(cè)到呈柑橘香的檸檬烯在廣東烏龍茶中含量較高，與前人研究一致[26]。閩南地區(qū)烏龍茶是4個(gè)產(chǎn)地里焙火溫度最低的，具有青草香特征的庚醛、己醛、3-辛酮含量明顯高于其他產(chǎn)地的烏龍茶；臺(tái)灣地區(qū)烏龍茶中具有果香氣特征的2-己酮、丙酸、γ-丁內(nèi)酯、正己醛等含量較為突出。周雪芳研究表明，武夷巖茶隨著焙火溫度增加，茶葉中具有焙烤香的揮發(fā)性化合物增加[27]，如閩北地區(qū)烏龍茶具有烘烤香呈香特性的反-2，4-庚二烯醛、對(duì)乙基苯酚、5-甲基糠醛的信號(hào)峰較強(qiáng)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

根據(jù)特征峰的峰值強(qiáng)度數(shù)據(jù)結(jié)合PCA、PLSDA、LDA多元統(tǒng)計(jì)分析方法，不同產(chǎn)地烏龍茶能根據(jù)其揮發(fā)性化合物的含量進(jìn)行區(qū)分，說(shuō)明該技術(shù)對(duì)區(qū)分產(chǎn)地有效，即檢出的各個(gè)物質(zhì)及其含量能有效代表烏龍茶產(chǎn)地信息，驗(yàn)證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。因此，GC-IMS技術(shù)能有效且快捷地運(yùn)用于不同產(chǎn)地烏龍茶的區(qū)分。GC-IMS技術(shù)用于茶葉方面的研究較少，由于茶葉揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)尚未完善，使得鑒別出的揮發(fā)性物質(zhì)不及GC-MS的多。查詢到的43種物質(zhì)僅是烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)的一部分，雖不能概括烏龍茶的整個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)體系，但根據(jù)判別結(jié)果可知，具有代表性，且與GC-MS相比，該技術(shù)不用對(duì)樣品進(jìn)行前處理，檢測(cè)方法較簡(jiǎn)單，表明GC-IMS技術(shù)在烏龍茶產(chǎn)地區(qū)分上仍有其特有的優(yōu)勢(shì)。