趙婷婷， 陳 謙， 卞曉軍，2，3， 顏 娟*，2，3

（1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 201306）

卡那霉素（kanamycin，KAN）是一種氨基糖苷類抗生素[1]。由于它具有阻斷蛋白質(zhì)合成的能力，因此可廣泛用于治療細(xì)菌等微生物引起的感染[2]。但是，過度、過量使用抗生素會導(dǎo)致其殘留在肉、蛋、奶制品及其他動物源性食品中，并最終通過人體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)累積到體內(nèi)，造成一系列的危害，如：腎毒性、耳毒性以及過敏反應(yīng)等[3]。許多國家、地區(qū)對KAN在牛奶中允許的最高殘留限量做了規(guī)定，例如，歐盟將殘留限量定為150 μg/kg[4]，中國則為200 μg/kg[5]。因此，建立一種靈敏的KAN檢測方法對食品、環(huán)境及人類健康都是至關(guān)重要的。

目前，常用的KAN檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附實驗[6]、高效液相色譜[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-10]和毛細(xì)管電泳等，但其中有些方法依賴于抗原、抗體結(jié)合的穩(wěn)定性，如酶聯(lián)免疫吸附實驗；有的方法需要依賴大型儀器，需要專業(yè)的人員和煩瑣的操作，如高效液相色譜和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；有的方法本身響應(yīng)時間較長，如表面等離子共振法；而毛細(xì)管電泳法則存在靈敏度較低的問題。鑒于這些傳統(tǒng)的檢測方法有各自的不足，因而開發(fā)一種簡單、快速、靈敏度高的KAN檢測方法迫在眉睫。

適配體（aptamer，Apt）是一種從體外核酸分子文庫中通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)獲得的單鏈寡核苷酸序列[11-12]，它能夠與靶分子發(fā)生高特異性、高親和力結(jié)合[13-14]。與抗體相比，適配體具有熱穩(wěn)定性高、生產(chǎn)成本低、便于生產(chǎn)和修飾等諸多優(yōu)點[15]，因此基于適配體的生物傳感器得到了研究人員的廣泛重視[16-17]。自從Song等利用親和層析技術(shù)篩選出對KAN具有高特異性的適配體以來[18]，用于檢測KAN的適配體傳感器，如比色[19-20]、熒光[21-22]和電化學(xué)[23]傳感器等相繼涌出。在這些方法中，比色適配體傳感器因成本低、簡單實用、無需任何精密儀器，肉眼就能夠觀察其顏色變化而得到廣泛應(yīng)用[24]。

近年來，基于磁性顆粒和碳納米管等磁性材料特性設(shè)計的納米結(jié)構(gòu)，用來分析抗生素殘留已經(jīng)得到了諸多研究[25-27]。磁性顆粒是一類可負(fù)載多種表面官能團的粒子[28]，因其具有表面結(jié)合小分子穩(wěn)定性好、測定動力學(xué)強、固定小分子定向改善等優(yōu)點，可以利用磁分離技術(shù)實現(xiàn)流體中靶標(biāo)分子的分離和富集，故在生物傳感器方面得到了廣泛應(yīng)用[29-31]。作者制備了磁珠-卡那霉素 （magnetic beadskanamycin，MBs-KAN）復(fù)合物，通過該復(fù)合物表面的KAN與溶液中待測KAN共同競爭性地識別生物素修飾的適配體（biotin modified aptamer，Biotin-Apt），開發(fā)了一種檢測KAN的競爭性比色適配體傳感器。隨著待測KAN含量增加，溶液中的適配體傾向于與其結(jié)合，所以磁珠表面的KAN競爭性識別適配體的量減少，進而導(dǎo)致鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶 （streptavidin-labeled horseradish peroxidase，SA-HRP）的量減少，從而影響HRP催化3，3’，5，5’-四 甲 基 聯(lián) 苯 胺 （3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB）的顯色反應(yīng)，使藍(lán)色發(fā)色物質(zhì)的量減少?；谠摫壬m配體傳感器的紫外-可見吸收光譜值與待測KAN的濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，從而可以對KAN進行定量檢測。該傳感器操作簡單、靈敏度高、選擇性好，可以通過替換相應(yīng)的磁性復(fù)合物和適配體來實現(xiàn)不同種類抗生素的檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA序列（5′-Biotin-TTT TTT TTT TTG GGG GTT GAG GCT AAG CCG AGT CAC-3′），純度為HPLC級別：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，20×，pH 7.4）、Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L，pH 7.0）、Biotin-11-dUTP（1 mmol/L）、KAN、阿布拉霉素（apramycin，APM）、巴龍霉素（paromomycin，PAR）、鏈霉素（streptomycin，STR）、慶大霉素（gentamicin，GEN）和新霉素（neomycin，NEO）：生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；BioMag?Plus修飾的磁珠、磁分離器：美國Polysciences Inc公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美國Amresco公司產(chǎn)品；TMB（含H2O2）：美國Neogen公司產(chǎn)品；SA-HRP：賽默飛科技有限公司（上海）產(chǎn)品；1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）、2-（N-嗎 啉 代） 乙 磺 酸 （2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid hydrate，MES）：阿拉丁試劑有限公司（上海）產(chǎn)品；Millipore凈化系統(tǒng)的超純水：美國密理博公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

HCM100-Pro恒溫振蕩金屬浴、D1008手持式離心機：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；UV-2540紫外-可見分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品；Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡：日本株式會社日立制作所產(chǎn)品；移液槍：德國Brand公司產(chǎn)品；Synergy2 SLFPTAD多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 MBs的活化磁珠的活化即對氨基磁珠進行醛基化，具體步驟如下：用移液槍移取BioMag?Plus修飾的磁珠3 mL（150 mg）到50 mL離心管，加24 mL吡啶緩沖液（0.01 mol/L），在室溫下劇烈振蕩混合均勻后，進行磁分離，棄去上清液，該過程重復(fù)3次；之后加入12 mL體積分?jǐn)?shù)5%的戊二醛溶液（用0.01 mol/L吡啶緩沖液稀釋配制），在非磁性混合設(shè)備即恒溫?fù)u床振蕩器中25℃避光振蕩3 h，以保證磁珠和戊二醛溶液充分混合；然后進行磁分離去除未反應(yīng)完的戊二醛溶液，用24 mL吡啶緩沖液（0.01 mol/L）反復(fù)清洗3次，直至溶液澄清后進行磁分離操作，移除上清液；最終，將磁珠加入15 mL的1×PBS中重懸，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MBs-KAN的制備MBs-KAN采用碳二亞胺交聯(lián)法制備[32]，詳細(xì)的制備步驟如下：取2 mL（20 mg）醛基化磁珠于15 mL離心管中，離心丟棄上清液，加入2 mL 20 mmol/L MES偶聯(lián)液洗滌3次；之后分別加入2 mL 20 mmol/L MES偶聯(lián)液和20 g/L EDC溶液重懸磁珠，于恒溫?fù)u床振蕩器25℃下避光活化3 h；磁分離后，用2 mL 20 mmol/L MES偶聯(lián)液洗滌3次；加入100 g/L的硫酸卡那霉素，在25℃下放于恒溫?fù)u床振蕩器中避光孵育振蕩6 h，之后進行磁分離，棄去上清液；最后將產(chǎn)物用4 mL的清洗緩沖液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20，PH 7.4）洗滌3次以除去未反應(yīng)的硫酸卡那霉素，將沉淀重懸于2 mL的1×PBS溶液中，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 競爭性適配體傳感器的構(gòu)建取5 μL制備好的MBs-KAN復(fù)合物，磁分離去除上清液，加入50 μL體積分?jǐn)?shù)為2%的BSA溶液室溫下封閉40 min。封閉結(jié)束后，磁分離去除上清液，加入500 nmol/L的Biotin-Apt以及20 μL不同濃度的KAN溶液（0、0.05、0.5、5、50、500 nmol/L），將離心管放于旋渦振蕩器上振蕩混勻，之后放入金屬浴于37℃孵育1 h。孵育結(jié)束后，磁分離去除上清液，將產(chǎn)物用清洗緩沖液沖洗3次。

1.3.4 比色適配體傳感器的構(gòu)建將上述獲得的磁性復(fù)合物用50 μL體積分?jǐn)?shù)4%的BSA溶液進行封閉，封閉時間40 min，結(jié)束后進行磁分離操作以除去多余的BSA溶液。之后在離心管中加入2 μL稀釋1000倍的SA-HRP，避光反應(yīng)20 min后進行磁分離。將磁分離后的沉淀部分加入50 μL 0.01 mol/L的PBS緩沖液清洗6次，直至溶液澄清，后進行磁分離操作棄去上清液。在上述產(chǎn)物中加入50 μL TMB溶液（含H2O2），在避光狀態(tài)下反應(yīng)5 min，磁分離后，上清液被吸取到96孔板中，在酶標(biāo)儀中波長652 nm處測量吸光度。

1.3.5 牛奶實際樣品中檢測KAN牛奶樣品購自上海羅森超市，具體的處理步驟如下：2 mL牛奶樣品用PBS緩沖液稀釋10倍。將牛奶樣品在4 °C以11000 r/min離心25 min，除去沉淀后，用0.22 μm的濾膜過濾上清液，收集得到的濾液。將一系列不同濃度的KAN標(biāo)準(zhǔn)溶液加到牛奶濾液中，配成終濃度為0.5、1、5 nmol/L的KAN溶液用于檢測。另外將一組不加KAN的經(jīng)過預(yù)處理的牛奶樣品作為對照組。將加標(biāo)的樣品和對照組都進行上述操作，測定652 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 競爭性比色適配體傳感器的檢測原理

基于磁珠表面競爭性生物識別的比色適配體傳感器用于檢測KAN的原理見圖1。該競爭性適配體傳感器的構(gòu)建核心在于MBs-KAN與待測樣中的KAN共同競爭識別Biotin-Apt。當(dāng)溶液中不存在游離的KAN時，由于適配體與靶標(biāo)會發(fā)生特異性識別，所以磁珠上共價交聯(lián)的KAN就會捕獲Biotin-Apt，從而使Biotin結(jié)合在磁性復(fù)合物的表面。當(dāng)體系中加入SA-HRP后，生物素與鏈霉親和素識別連接，辣根過氧化物酶（HRP）被間接連接到磁珠復(fù)合物的表 面。加 入TMB時，HRP催化H2O2介 導(dǎo) 的TMB發(fā)生還原反應(yīng)，生成藍(lán)色的氧化型TMB，從而在652 nm處出現(xiàn)強吸收峰。而當(dāng)溶液中存在過量的待測KAN時，由于游離的KAN相較于磁珠上交聯(lián)的KAN有著更小的空間位阻，適配體會優(yōu)先結(jié)合待測樣中的KAN，這使得磁珠上結(jié)合的適配體以及HRP的量大大減少甚至沒有，因此催化TMB后溶液的吸光度降低。隨著待測樣中KAN濃度升高，該傳感器在652 nm處的吸光度降低，根據(jù)吸光度的差值對KAN進行定量檢測。

圖1 基于磁珠表面競爭性生物識別的比色適配體傳感器用于檢測KAN的示意圖Fig.1 Schematic illustration of a colorimetric aptasensor based on the competitive biological recognition on the surface of magnetic beads for detecting KAN

2.2 MBs-KAN的表征

首先采用掃描電子顯微鏡對預(yù)制備的MBs-KAN磁性復(fù)合物進行表征（見圖2）。由于超順磁性結(jié)構(gòu)微域的存在，導(dǎo)致MBs會發(fā)生一定的團聚[33]，因此圖2（a）中出現(xiàn)一些磁珠聚集體；然而當(dāng)其表面連接KAN之后，由于KAN的介導(dǎo)作用，使得更多磁珠聚集成團，相比圖2（a）而言，圖2（b）中磁性聚集體的粒徑進一步增大（紅色箭頭）。聚集體尺寸的變化一方面可反映KAN在磁珠表面的成功連接。并且，MBs-KAN復(fù)合物的制備也將進一步通過KAN與適配體之間的識別進行驗證。另外，據(jù)文獻報道，磁珠表面具有多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)過蛋白質(zhì)（如抗體）修飾及填充，磁珠的多孔表面變得順滑[34]，這也說明具備該結(jié)構(gòu)的磁珠具有更大的比表面積，更有利于如KAN等小分子的組裝。

圖2 掃描電子顯微鏡圖像Fig.2 Scanning electron microscope image

2.3 MBs-KAN識別Biotin-Apt的驗證

該競爭性適配體傳感器制備成功與否的關(guān)鍵在于適配體能否識別KAN?；诖?，進一步驗證了Biotin-Apt與KAN的生物識別。首先，將BSA封閉后的醛基化磁珠與Biotin-Apt孵育后收集上清液，測試孵育前后DNA的吸光度。結(jié)果如圖3（a）所示，DNA的吸光度無明顯變化；而當(dāng)Biotin-Apt與MBs-KAN相互作用后，結(jié)果如圖3（b）所示，其上清液中游離的Biotin-Apt即黑線所示的吸光度，較孵育前Biotin-Apt的吸光度明顯降低，表明一定量的適配體與KAN識別后結(jié)合在MBs-KAN復(fù)合物表面。該結(jié)果不但進一步表明了MBs-KAN的成功制備也驗證了適配體與KAN的特異性識別。

圖3 紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectrum

2.4 適配體傳感器用于檢測KAN的可行性驗證

為了驗證該競爭性適配體傳感器的競爭效應(yīng)，設(shè)計了兩組實驗：第一組實驗是將MBs-KAN與Biotin-Apt孵育（不加入待測物KAN）作為對照組，另一組則通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)5 μmol/L及更高濃度KAN加入此競爭體系時，吸光度保持在一個很低的數(shù)值并且不會隨著濃度升高而有所下降，因此將MBs-KAN與Biotin-Apt孵育后加入過量的KAN（5 μmol/L）作為實驗組。兩組實驗在相同條件下進行。結(jié)果如圖4所示，實驗組（過量的KAN）的吸光度明顯低于對照組（無KAN）。這很可能是因為實驗組中過量的游離KAN具備更小空間位阻，因而更易與Biotin-Apt結(jié)合。MBs-KAN復(fù)合物競爭結(jié)合的適配體的量較對照組大大減少，進而后續(xù)HRP催化TMB的呈色效應(yīng)大大降低。通過兩組吸光度的差值，可以清楚看到磁珠表面KAN與樣品中KAN對適配體的競爭識別能力差異明顯，因此該競爭性適配體傳感策略具有實施的可能性。

圖4 驗證可行性的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 UV-vis absorption spectrum for the feasibility verification

2.5 性能分析

2.5.1 適配體傳感器靈敏度測試為了研究該競爭性比色傳感體系的檢測靈敏度，將一系列不同濃度的KAN加入該傳感器體系中，可以發(fā)現(xiàn)：隨著KAN濃度的增加（0～500 nmol/L），自然光下可清晰觀察到顯色程度不同的藍(lán)色發(fā)色產(chǎn)物，這表明該適配體傳感器可用于裸眼檢測KAN（見圖5（a））。同時，隨著KAN濃度的增加，在652 nm處的吸光度逐漸降低（見圖5（b））。此外，ΔA652nm與KAN濃度的對數(shù)值在0.05～500 nmol/L之間存在良好的線性關(guān)系（ΔA652nm=0.0427 lg cKAN+0.0557，R2=0.9871）（見圖5（c））。其中652 nm處的吸光度變化值ΔA652nm的計算公式如下：

圖5 靈敏度檢測結(jié)果Fig.5 Results of sensitivity detection

式中：Ac為對照組，即在無游離KAN的情況下，該適配體傳感器在652 nm處的吸光度；Ae為實驗組，即待測樣的吸光度。

通過使用LOD=3σ/S公式估算，該傳感器的檢出限為0.21 nmol/L，其中空白溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為σ，S是校正曲線的斜率。

依據(jù)濃度計算公式：

式中：c為濃度，mol/L；n為物質(zhì)的量，mol；V為體積，L；m為質(zhì)量，g；M為KAN的摩爾質(zhì)量，g/mol。

將該傳感器的檢測限按公式換算可得0.122 μg/kg，遠(yuǎn)低于中國標(biāo)準(zhǔn)對牛奶中KAN規(guī)定的最高殘留限量200 μg/kg。

將該競爭性比色適配體傳感器與其他檢測KAN的方法相比較，如表1所示，該方法不需要大型儀器，具有更寬的檢測范圍和更低的檢測限，優(yōu)勢明顯，可以應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域KAN的痕量分析。

表1 現(xiàn)有檢測KAN的傳感器檢測性能比較Table 1 Detection performance comparison of existing KAN detecting sensors

2.5.2 特異性檢測為了探究該適配體傳感器對KAN的選擇性，選取與KAN結(jié)構(gòu)相似的氨基糖苷類抗生素進行比較驗證。KAN濃度為500 nmol/L，其他氨基糖苷類抗生素濃度是5 μmol/L，均為KAN的10倍。對照組（Blank組）為不加KAN組，按照上述1.3.4的步驟應(yīng)用該適配體傳感器檢測，結(jié)果如圖6所示。首先裸眼即可觀察到，實驗組（KAN組）溶液顏色明顯淺于對照組與其余組溶液顏色；而柱形圖結(jié)果進一步證實，只有實驗組具有明顯的吸光度變化，而其他氨基糖苷類抗生素的吸光度變化與實驗組相比，幾乎可忽略。該結(jié)果表明，該競爭性生物識別的比色適配體傳感器對KAN具有良好的選擇性。

圖6 競爭性比色適配體傳感器對KAN的選擇性Fig.6 Selectivity of competitive colorimetric aptamer sensors for KAN

2.5.3 實際樣品檢測為了進一步驗證該檢測方法在實際樣品分析中的適用性，將不同濃度的KAN加到牛奶樣品中，如表2所示，回收率為93.8%～102.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%～6.3%，可以看出該策略在牛奶實際樣品中有較好的精確性和重現(xiàn)性，說明該比色適配體傳感器可用于實際樣品的檢測。

表2 牛奶樣品中加標(biāo)的KAN檢測Table 2 Detection of KAN spiked in milk samples

3 結(jié)語

作者開發(fā)了一種基于磁珠表面競爭性生物識別的比色適配體傳感器，通過磁珠表面連接的KAN以及檢測樣本中的KAN與適配體的競爭性生物識別性能的差異來構(gòu)建應(yīng)用于檢測KAN的比色傳感策略。該生物傳感器的設(shè)計核心在于利用磁珠、KAN與適配體進行競爭體系的構(gòu)建。首先磁珠和KAN的共價交聯(lián)，保證了競爭體系的穩(wěn)定性；另外由于磁珠的存在，大大簡化了實驗操作的同時也有利于降低實驗背景，提高檢測靈敏度；最后KAN與適配體的生物識別也確保了該方法的特異性檢測?？傊?，該方法操作簡便、快速，擁有較寬的檢測范圍和較低的檢測限，在抗生素檢測方面具備良好的應(yīng)用前景，同時也為食品安全領(lǐng)域其他污染物的快速檢測提供了良好思路。