蔡安盛，栗志英*，張素華，姚曉華，杜相珠，行紅燕，郭永澤，馬景紅

(1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 a心內(nèi)科；b 消化內(nèi)科，河北 邯鄲056002；2.邯鄲市第一醫(yī)院 a心內(nèi)科；b 風(fēng)濕免疫科；c 血液科)

心肌纖維化是心臟由于缺氧、炎性反應(yīng)、代謝異常等原因所致的心臟組織中基質(zhì)成分過度聚集，其中膠原成分所占比例過多且排列紊亂[1-2]，常見的并發(fā)癥為心肌代償性肥大、心律失常、心室重構(gòu)，嚴重者會導(dǎo)致心衰，發(fā)病機制尚不明晰。多項研究證實血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)能加速心肌組織發(fā)生纖維化改變[3-4]。雙氫青蒿素(DHA)能改善肺臟和肝臟的纖維化病變[5-6]。本實驗利用AngⅡ刺激心肌成纖維細胞構(gòu)建纖維化細胞模型，觀察和分析雙氫青蒿素對其增殖和分泌活性的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

出生1-3 d的SD大鼠，河北醫(yī)科大學(xué)組胚教研室贈送。AngII 購于深圳子科生物有限公司，DHA 購于浙江新和成股份有限公司；波形蛋白、α-SMA和TGF-β1蛋白的第一抗體購于Invitrogen公司，酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒均購于圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1分離并培養(yǎng)心肌成纖維細胞 將10只出生時間為1-3 d的SD乳大鼠，低溫麻醉后立即全身噴酒精進行消毒，在無菌實驗室中迅速剪開胸部摘取心臟，切取心室組織，清洗血液后浸入低溫D-Hank’s里，剪為盡可能的小塊，浸入胰酶中消化心室組織中的細胞，濾網(wǎng)過濾組織殘渣，濾液盛入離心管中，置半徑為6 cm低溫離心機內(nèi)，600 r/min離心10 min。用孵育液懸浮細胞后培養(yǎng)，根據(jù)差時貼壁法對心肌成纖維細胞進行純化并常規(guī)培養(yǎng)，2 d后觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)并進行免疫鑒定。

1.2.2實驗分組 培養(yǎng)的細胞分組：對照組、AngⅡ組、DHA組和DHA+AngⅡ組。對照組:只加入培養(yǎng)液；AngⅡ組：培養(yǎng)液中含有10-6mol/L AngⅡ；DHA組：培養(yǎng)液中含有100 ng/mL DHA；DHA+AngⅡ組：培養(yǎng)液中含有10-6mol/L AngⅡ和100 ng/mL DHA。

1.2.3每組細胞的增殖情況 將細胞用孵育液調(diào)制成5×104個/ml，移種于多孔孵育板里，每孔的量均為200 μl，孵育24 h讓細胞生長在同步化狀態(tài)，將上述各組重復(fù)安排6個孔，孵育48 h后，再向每孔加入適量的噻唑蘭溶液,作用4 h。吸凈孔內(nèi)的懸浮液，再加均量的二甲基亞砜，充分反應(yīng)后于酶標(biāo)儀中測量出各孔吸光度值。

1.2.4細胞培養(yǎng)液中FN和Col I的分泌情況 4組細胞孵育3 d 時，各組重復(fù)安排6個孔，吸取每組的懸浮液，依次遵循試劑盒內(nèi)的操作方法，波長值設(shè)置在450 nm處，上機進行檢測，記錄并計算各組的吸光度平均值。

1.2.5免疫印跡法分析細胞中α-SMA和TGF-β1蛋白的表達 4組細胞孵育3 d 時，裂解并獲得每組胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)，將其60 μg溶于5倍SDS溶液，沸水浴里變性后，移入夾板的凝膠孔內(nèi)，電泳2 h后，切取包含有蛋白條帶的凝膠塊，將其和PVDF膜緊貼在一起放入轉(zhuǎn)膜儀中1 h，逐次移入封閉溶液內(nèi)孵育2 h、a-SMA(1∶800)及TGF-β1(1∶600)抗體稀釋液內(nèi)作用4 h，浸入洗膜液，取出后滴加二抗溶液(1∶1000)孵育2 h，重復(fù)洗膜三次，暗室內(nèi)在膜上滴加發(fā)光液，于膠片上進行化學(xué)顯色。利用圖像分析儀確定每個條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鑒定獲得的細胞純度約為93%，培養(yǎng)瓶中的細胞在鏡下可見：細胞緊貼瓶壁生長，第3天時可見細胞體積變大，從胞體伸出長短、粗細不等突起，單個圓形核，位于細胞中央。波形蛋白抗體染色可見：胞質(zhì)內(nèi)有許多棕色顆粒，見圖1。

圖1 上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鑒定(×200)

2.2 細胞增殖分析各組細胞3 d后，各孔的吸光度值顯示：與對照組相比，DHA組沒有顯著差異(P>0.05)，AngⅡ組的吸光度值上升(P<0.05)；與AngⅡ組相比，DHA+AngⅡ組吸光度值下降(P<0.05)，見表1。

2.3 FN及Col I的含量分析與對照組相比，DHA組FN及Col I的釋放量均無明顯差異(P>0.05)，AngⅡ組兩種蛋白的釋放量均明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，DHA+AngⅡ組兩種蛋白的釋放量均明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 細胞增殖實驗與細胞分泌物檢測結(jié)果分析

2.4 細胞中α-SMA和TGF-β1蛋白含量的分析與對照組相比，DHA組胞質(zhì)內(nèi)α-SMA和TGF-β1含量均沒有明顯差異(P>0.05)，AngⅡ組兩種蛋白的量均明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，DHA+AngⅡ組兩種蛋白的量明顯降低(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 免疫印跡法檢測細胞中α-SMA和TGF-β1的相對含量

圖2 免疫印跡法顯示細胞中α-SMA和TGF-β1蛋白的灰度條帶

3 討論

心肌纖維化是多種致病因素共同作用引起的較為復(fù)雜的病理生理過程，在此過程中主要是心肌組織中的間質(zhì)細胞參與[7-8]。成纖維細胞為間質(zhì)細胞中的成員之一，在心肌纖維化病變的過程中發(fā)揮著重要作用。在損傷信號的刺激下，其具體的作用機制如下：①細胞分裂增殖、數(shù)量增多；②活性增強，分泌基質(zhì)成分增多；③其表型轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，其增殖程度和分泌基質(zhì)的活性均較成纖維細胞增強[9-10]。因此，本研究分離乳鼠的心肌成纖維細胞作為研究對象。

血管緊張素Ⅱ為神經(jīng)體液調(diào)節(jié)因子，在心肌纖維化病變的進展中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)心肌細胞收縮力降低造成心排血量減少時，流經(jīng)腎臟的血量也相應(yīng)的減少，引起機體中Ang Ⅱ生成和釋放入血。Ang Ⅱ能刺激心肌組織中的成纖維細胞，使其增殖分裂和過度活化，大量表達肌成纖維細胞的表型分子—a-SMA，分泌的基質(zhì)成分增多，并能分泌大量的致纖維化因子TGF-β1、IGF-1等，通過多種信號調(diào)節(jié)途徑，進一步加速了心肌纖維化的進程[11-13]。該實驗結(jié)果表明：在體外，AngⅡ能刺激心肌成纖維細胞數(shù)目增加，分泌到孵育液中的FN和Col I含量增多，細胞中a-SMA的表達上升，TGF-β1的含量也增加。這與文獻[11-13]的研究結(jié)果相一致。

青蒿素為眾所周知的有效抗瘧藥物，雙氫青蒿素為其衍生物，它能治療瘧疾外，還具有抑制腫瘤、減弱炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)機體免疫等多種生物功效[14-16]。采用四氯化碳對小鼠進行肝纖維化造模過程中，經(jīng)過適量的雙氫青蒿素干預(yù)能減少肝組織中促進纖維化的細胞因子TGF-β1和TNF-α的含量，從而改善肝組織纖維化的程度[17]。在細胞實驗中，TGF-β1能誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生間質(zhì)化、間質(zhì)細胞分泌基質(zhì)活性增強，而雙氫青蒿素能拮抗TGF-β1的這種效應(yīng)，達到防治宮腔粘連的作用[18-19]。該實驗結(jié)果表明，雙氫青蒿素對AngⅡ刺激的心肌成纖維細胞增殖、分泌FN和Col I、表達a-SMA和TGF-β1具有抑制作用。這提示雙氫青蒿素能有效拮抗AngⅡ引發(fā)的心肌纖維化。