高正興,趙 琳

(北京市大興區(qū)人民醫(yī)院 檢驗科，北京102600)

胃癌(gastric carcinoma)通過早期的檢測和篩查可有效降低其發(fā)病率和死亡率[1-2]。然而，據(jù)估計大約有一半的胃癌患者在晚期被發(fā)現(xiàn)，這種情況顯示了預(yù)防和早期檢測的重要性，特別是在高危人群中[3]。引起胃癌的風(fēng)險因素有很多，遺傳因素和環(huán)境因素是主要的兩個方面[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，有胃癌家族史會增加個體患胃癌的風(fēng)險，其危險程度取決于家族中胃癌親屬數(shù)量及親屬血緣關(guān)系的親密程度[5]。外泌體(exosomes)是一種包含RNA和蛋白質(zhì)的小泡膜，可轉(zhuǎn)運至受體細(xì)胞，改變受體細(xì)胞的基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移等過程[6]。miRNA-155是miRNA家族中的一種，已有研究顯示，miRNA-155在多種腫瘤患者的血清中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，同時miRNA-155表達(dá)水平與患者腫瘤惡性程度具有一定的相關(guān)性[7]。膠原三螺旋重復(fù)蛋白1(CTHRC1)可參與血管受損后的重塑修復(fù)過程，其異常表達(dá)對腫瘤擴(kuò)散、侵襲、遷移、黏附和轉(zhuǎn)移均具有重要作用[8-9]。目前關(guān)于外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155在胃癌中作用尚不清楚，因此本研究分離胃癌細(xì)胞外泌體，并探討外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155靶向CTHRC1對胃癌細(xì)胞腹膜種植轉(zhuǎn)移的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

細(xì)胞：自武漢普諾賽公司購買胃癌BCG-823和人腹膜間皮HMrSV5細(xì)胞株。

試劑：RPMI1640培養(yǎng)液(批號：148971)、胎牛血清(批號：194243)、胰蛋白酶(批號：1349781)購自美國GIBCO公司；于自美國Sun-Shine公司購買PKH26染色試劑盒；熒光素酶檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司；RT-qPCR試劑盒、RNA提取試劑盒、外泌體提取試劑盒和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：9871023)購自上海優(yōu)寧維生物有限公司；CTHRC1(批號：3154284)和β-actin(批號：9418721)蛋白抗體購自美國abcam公司；二抗(山羊抗兔)購于武漢三鷹公司。

儀器：BSC-1100IIB2-X生物安全柜、博科300LCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(中國博科公司)；5320R4℃離心機(jī)(德國徠卡公司)；Mini-PRO TEAN電泳儀(美國伯樂公司)；EVOS M7000倒置顯微鏡(意大利賽默飛公司)；BKQ-B75高壓蒸汽滅菌鍋(中國博科公司)；LAS 4000成像系統(tǒng)、透射電子顯微鏡(GE Healthcare公司，美國)；激光共聚焦顯微鏡(賽默飛世爾科技公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取胃癌BCG-823細(xì)胞株、人腹膜間皮HMrSV5細(xì)胞株各一支進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，將復(fù)蘇后的細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)基中，采用細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行分裝，并放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件：5%CO2；37℃)，細(xì)胞覆蓋率合格后，加入胰蛋白酶細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組 實驗分為陰性對照組、外泌體組和miRNA-155 mimic組。陰性對照組細(xì)胞加入miRNA-155阻斷劑，外泌體組加入外泌體混懸液(100個/細(xì)胞)，miRNA-155 mimic組加入外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155 mimic混懸液(100個/細(xì)胞)，48 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.3外泌體提取與鑒定 胃癌BCG-823細(xì)胞經(jīng)1.2.1步驟培養(yǎng)后3 000(r/min)離心30 min，取上清于一支新的離心管中，加入1/3體積RiboTM Exosome Isolation Reagent，混勻，放置4℃冰箱中過夜(設(shè)為1號管)；次日取2 ml于一支新的離心管中(2號管)，2 000(r/min)離心30 min，去除上清液，繼續(xù)加入1號管中的液體2 ml，重復(fù)上述離心步驟，到1號管中液體全部取完，此時2號管中的沉淀即為外泌體。取2號管中外泌體10 μl，采用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.2.4外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155 mimic的制備 取濃度為200 μg/ml Cy3-miRNA-155 mimic溶于1.2.3提取的外泌體混懸液中，定容至1 ml，在恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h(37℃)，離心10 min(9168rpm)，用0.22 μm過濾器進(jìn)行過濾后再離心120 min(120 000 rpm，4℃)，棄上清，將沉淀溶于100 μl磷酸鹽緩沖液中得到外泌體轉(zhuǎn)運miR-324-5p mimic混懸液。

1.2.5總RNA提取及RT-qPCR 取出培養(yǎng)皿放入無菌操作臺，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。根據(jù)RNA提取試劑盒說明步驟分別提取胃癌細(xì)胞和外泌體總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA保存至-80℃?zhèn)溆?。RT-qPCR體系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25μl，特異性引物2.0 μl，模板cDNA3.25 μl，DEPC水補(bǔ)足至30 μl。反應(yīng)條件為：95℃，10 min；95℃，10 s；60℃，30 s；70℃，30 s；共40個循環(huán)。設(shè)置6個復(fù)孔，根據(jù)公式(2-ΔΔCT法)計算、分析miRNA-155表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6外泌體吞噬實驗 依照PKH26染色試劑盒說明書步驟嚴(yán)格執(zhí)行，取1.2.1步驟中培養(yǎng)好的人腹膜間皮HMrSV5細(xì)胞，滴加外泌體(已用PKH26標(biāo)記)，DAPI染色，最后在顯微鏡(激光共聚焦顯微鏡)下進(jìn)行觀察。

1.2.7劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移力 將腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5分為陰性對照組(加入miRNA-155阻斷劑)、外泌體處理組(加入外泌體)和miRNA-155 mimic組，細(xì)胞按5×105個/mL接種于6孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。劃痕實驗時吸頭垂直孔壁劃痕，并加入無血清培養(yǎng)基，劃痕完成后在顯微鏡下(EVOS M7000倒置顯微鏡)觀察，對遷移率進(jìn)行分析計算。

1.2.8熒光素酶報告基因檢測 構(gòu)建CTHRC1-WT、CTHRC1-Mut基因pGL3載體質(zhì)粒。采用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，然后以100 ng每孔的濃度轉(zhuǎn)染至HMrSV5細(xì)胞，同時轉(zhuǎn)染的還有miRNA-155的各組細(xì)胞，每組設(shè)置6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24 h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光強(qiáng)度。

1.2.9Western blotting檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組同1.2.7，取出培養(yǎng)皿放入無菌操作臺，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并加入1 ml PBS和100 μl蛋白酶K溶液，使細(xì)胞懸浮，經(jīng)破碎細(xì)胞、離心，取上清置于管中。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜和封閉后用特異性抗體CTHRC1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Calnexin、CD9、CD81和β-actin在4℃條件下孵育12 h，孵育后的條帶清洗三次(1%吐溫)，二抗孵育2 h，LAS 4000成像并觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

在透射電子顯微鏡下觀察經(jīng)提取后的外泌體，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可見提取的80%以上微囊泡呈現(xiàn)杯口狀，直徑40-150 nm，見圖1①。Western blotting鑒定發(fā)現(xiàn)，外泌體標(biāo)志性蛋白CD9、CD81呈陽性，未見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶Calnexin表達(dá)，見圖1②。

圖1 外泌體鑒定 ①透射電鏡下觀察外泌體結(jié)構(gòu)；②蛋白CD9、CD81表達(dá)情況

2.2 各組miRNA-155表達(dá)水平比較

使用RT-qPCR技術(shù)檢測外泌體及各組miRNA-155表達(dá)水平，外泌體中miRNA-155表達(dá)水平為(0.49±0.03)，與對照組(0.21±0.03)比較,外泌體組內(nèi)miRNA-155為(0.51±0.04)顯著偏高，而與其他兩組對比，miRNA-155 mimic組為(0.78±0.08)顯著偏高(P<0.05)，見表2。

表2 各組miRNA-155表達(dá)水平比較(%)

2.3 外泌體攝取

以腹膜間皮細(xì)胞作為受體細(xì)胞，胃癌BCG-823細(xì)胞作為外泌體的供體細(xì)胞，采用PKH26對外泌體標(biāo)記后在顯微鏡下呈紅色，其主要分布在人腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，且視野下大部分細(xì)胞均可見紅色熒光，見圖2。

注：A：PKH26標(biāo)記的外泌體；B：HMrSV5細(xì)胞核；C：融合熒光

2.4 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5遷移力比較

細(xì)胞劃痕檢測細(xì)胞遷移力，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，外泌體組和miRNA-155 mimic組細(xì)胞遷移力顯著增加，與外泌體組比較，miRNA-155 mimic組細(xì)胞遷移力顯著增加(P<0.05)，見表3，圖3。

表3 各組腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5遷移力比較(%)

注：A：對照組；B：外泌體組；C：miRNA-155 mimic組

2.5 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞增殖的影響

CCK實驗，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，外泌體組和miRNA-155 mimic組細(xì)胞增殖顯著增加，與外泌體組比較，miRNA-155 mimic組細(xì)胞增殖顯著增加(P<0.05)，見表4，圖4。

表4 各組腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞增殖比較(%)

圖4 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞增殖的影響

2.6 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞活力的影響

EDU實驗，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，外泌體組和miRNA-155 mimic組細(xì)胞活力顯著增加，與外泌體組比較，miRNA-155 mimic組細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)，見表5，圖5。

表5 各組腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞活力比較(%)

圖5 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞活力的影響

2.7 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞遷移實驗，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，外泌體組和miRNA-155 mimic組細(xì)胞遷移顯著增加，與外泌體組比較，miRNA-155 mimic組細(xì)胞遷移顯著增加(P<0.05)，見表6，圖6。

表6 各組腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞遷移比較(%)

圖6 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5細(xì)胞遷移的影響

2.8 熒光素酶報告基因檢測報告結(jié)果

雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示miR-155與CTHRC1的靶向結(jié)合位點，通過敲低BCG-823細(xì)胞中的miR-155可以發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，miR-155 mimic與野生型CTHRC1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相對熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與突變組共轉(zhuǎn)染后，miR-155 mimic熒光強(qiáng)度變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，如圖7。

圖7 miR-155與CTHRC1的靶向結(jié)合位點及各組雙熒光素酶活性檢測

2.9 外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5 CTHRC1蛋白表達(dá)的影響

與陰性對照組(0.66±0.05)比較，CTHRC1蛋白在外泌體組和miRNA-155 mimic組表達(dá)分別為(0.43±0.04)和(0.21±0.03)，顯著降低，三組比較，miRNA-155 mimic組最低(P<0.05)，見表7，圖8。

表7 外泌體對腹膜間皮細(xì)胞HMrSV5 CTHRC1蛋白表達(dá)的影響

注：A：對照組；B：外泌體組；C：miRNA-155 mimic組。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，2015年全國胃癌發(fā)病病例為40.3萬，占所有腫瘤的10.25%，與此同時，共有293800人因胃癌死亡，死亡率為21.48/10萬[10]。胃癌的死亡率男性高于女性，具有顯著的地區(qū)差異，城市發(fā)病率高于農(nóng)村，經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率較高，東南沿海地區(qū)發(fā)病率呈迅速上升趨勢[11]。由于早期胃癌診斷困難，缺乏典型臨床癥狀，且尚無有效的生物標(biāo)志物，因此導(dǎo)致大多數(shù)病人在就診時被診斷為晚期胃癌，從而治療效果不理想。同時由于臨床常規(guī)藥物治療的局限性和后期產(chǎn)生的耐藥性，也限制了胃癌的治療[12]。因此了解和評價胃癌的具體作用機(jī)制，尋找有效的、新穎的檢測方法來提高胃癌早期的發(fā)現(xiàn)率、預(yù)后的預(yù)測及個性化治療是一個迫切的問題。

研究表明多種惡性腫瘤患者外泌體中含有與復(fù)合體相關(guān)的微小RNA，而癌細(xì)胞外泌體中存在前miRNA，同時癌細(xì)胞外泌體也可介導(dǎo)miRNA高效快速沉默，以重新編程靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體[13]。研究證實，miRNA-155能夠經(jīng)由巨噬細(xì)胞來源的胞外體向心臟纖維蛋白原內(nèi)轉(zhuǎn)移，而含有miRNA-155的外泌體可通過降低細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)1的表達(dá)促進(jìn)炎癥[14]。最新研究表明miRNA-155在活化的B和T細(xì)胞以及慢性胃炎癥中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，miRNA-155介導(dǎo)的胃病變可能是由于miRNA-155的過度表達(dá)而引起的[15]。本研究在顯微鏡下觀察經(jīng)提取后的外泌體，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可見提取的外泌體80%以上為直徑40-150nm的微囊泡，呈現(xiàn)杯口狀，外泌體標(biāo)志性蛋白CD81、CD9呈陽性，使用RT-qPCR檢測法進(jìn)一步明確外泌體內(nèi)與胃癌細(xì)胞內(nèi)的miRNA-155表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體內(nèi)其表達(dá)量顯著高于胃癌細(xì)胞內(nèi)。表明外泌體作為一種包含RNA和蛋白質(zhì)的小泡膜，其內(nèi)miRNA相對含量顯著高于細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)由細(xì)胞排出后，作用于受體細(xì)胞，發(fā)揮其特有的生物學(xué)功能。

目前關(guān)于胃癌細(xì)胞腹膜種植轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未闡明。有學(xué)者認(rèn)為胃癌細(xì)胞種植到腹腔需要多種條件的共同作用，首先是胃癌細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，并接觸腹膜的間皮細(xì)胞，使間皮細(xì)胞發(fā)生異常改變，間皮細(xì)胞凋亡、脫落，形成有利于胃癌細(xì)胞定植的生存環(huán)境[16]。因此，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)間皮細(xì)胞可吞噬胃癌來源外泌體，與外泌體融合后外泌體穩(wěn)定的存在于間皮細(xì)胞胞質(zhì)中。同時本研究用外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155處理間皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與正常的間皮細(xì)胞相比，在進(jìn)行外泌體和外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155處理后，間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移力顯著增強(qiáng)，提示胃癌來源外泌體可引起間皮細(xì)胞遷移力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移顯著增加，間皮細(xì)胞獲得更強(qiáng)的細(xì)胞遷移力、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移顯著增加，同時也為胃癌細(xì)胞的定植和擴(kuò)散提供了有利的體內(nèi)環(huán)境，其機(jī)制可能是外泌體中過表達(dá)的miRNA-155可促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)散。

CTHRC1在一些病理生理過程中起著關(guān)鍵作用,在多種腫瘤中CTHRC1的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[17]。腫瘤細(xì)胞中CTHRC1蛋白的低表達(dá)可能對附近微環(huán)境產(chǎn)生影響，諸如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)以及基質(zhì)細(xì)胞，對腫瘤的遷移與侵襲等具有促進(jìn)作用[18]。有證據(jù)顯示，CTHRC1異位表達(dá)于HepG2細(xì)胞內(nèi)可降低細(xì)胞的侵襲與遷移活性，同時經(jīng)由肺轉(zhuǎn)移小鼠模型發(fā)現(xiàn)其對腫瘤轉(zhuǎn)移具抑制作用[19]。有研究報道，miRNA-155可通過體外靶向CTHRC1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用[20]。在本研究中，采用外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155處理間皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)處理后的間皮細(xì)胞CTHRC1表達(dá)顯著低于未處理的細(xì)胞，表明低表達(dá)的CTHRC1可能會促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，結(jié)合熒光素酶報告基因檢測驗證miRNA-155的靶基因，結(jié)果顯示CTHRC1為其下游靶基因。其機(jī)制可能是胃癌來源外泌體中過表達(dá)的miRNA-155靶向抑制CTHRC1的表達(dá)，因此導(dǎo)致間皮細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)發(fā)生改變，向利于胃癌細(xì)胞種植轉(zhuǎn)移的方向轉(zhuǎn)變。

綜上所述，外泌體轉(zhuǎn)運miRNA-155可能通過靶向抑制CTHRC1的表達(dá)，從而促進(jìn)間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，為胃癌的種植轉(zhuǎn)移提供了有利的定植環(huán)境，增加了胃癌轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。同時miRNA-155和CTHRC1具有成為臨床胃癌治療靶點的潛質(zhì)。