姜?dú)g歡，周亞明，王禮豐，方歡樂(lè)

(西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710125)

中醫(yī)多以數(shù)味中藥配伍形成的方劑為載體治療疾病。配伍是中藥用方的靈魂。藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用，藥物的聯(lián)合使用才能產(chǎn)生藥物的相互作用，主要表現(xiàn)在效應(yīng)的強(qiáng)度、毒性以及作用時(shí)間上的變化。兩藥配伍后可產(chǎn)生相加性、協(xié)同性或拮抗性藥物相互作用。復(fù)方中藥是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多，而藥對(duì)是復(fù)方的重要核心及最佳切入點(diǎn)，黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)便是其中的一員[1]。

黃芪當(dāng)歸藥對(duì)在我國(guó)已有近千年的使用歷史，在許多復(fù)方試劑中黃芪和當(dāng)歸作為常用藥物頻繁出現(xiàn)，被廣泛用于心血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)疾病的治療[2]。關(guān)于其配伍比例歷代記載不盡相同，最早記載于《陳素庵婦科補(bǔ)解·調(diào)經(jīng)門(mén)》，方中黃芪與當(dāng)歸之比為 5∶6，黃芪用量少于當(dāng)歸用量[3]。金元時(shí)期“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”名揚(yáng)天下，史載于《內(nèi)外傷辨惑論·暑傷胃氣論》，方中當(dāng)歸用量少于黃芪，1∶5的歸芪比沿用至今[4]。

陳芳等[5]從中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出含有當(dāng)歸、黃芪的2632首方劑，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，研究當(dāng)歸黃芪配比狀況數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸與黃芪在方劑中出現(xiàn)的配比關(guān)系主要有52種，可歸納為3種情況。(1)當(dāng)歸<黃芪量：據(jù)統(tǒng)計(jì)，當(dāng)歸與黃芪以此配伍比例出現(xiàn)在方劑中的數(shù)目為874個(gè)，其中比例在1∶2和2∶3處最為集中，分別為288和146個(gè)。所占頻率分別為32.95%和16.7%。(2)當(dāng)歸量=黃芪量：當(dāng)歸與黃芪以此配伍比例出現(xiàn)在方劑中的數(shù)目為1301個(gè)，此配伍比例在方劑中出現(xiàn)的概率最大，為49.43%。(3)當(dāng)歸量>黃芪量：當(dāng)歸與黃芪以此配伍比例出現(xiàn)在方劑中的數(shù)目為457個(gè)，其中配伍比例在2∶1，3∶2，5∶3處出現(xiàn)最多，分別為103，68，60個(gè)。所占頻率分別為22.54%，14.88%，13.13%。

統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖1所示。

圖1 黃芪與當(dāng)歸在方劑中出現(xiàn)的配比關(guān)系數(shù)目Fig.1 Number of proportion relations between Astragalus membranaceus and Angelica sinensis in the formula

本文結(jié)合文獻(xiàn)研究黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)9種不同配伍比例、6種不同濃度體外抗氧化性的強(qiáng)弱，篩選其中抗氧化最強(qiáng)配比。為臨床用藥提供依據(jù)，同時(shí)也為經(jīng)典名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃芪、當(dāng)歸購(gòu)自于西安藻露堂大藥房。黃芪為膜莢黃芪Astragalusmembranaceu(sFisch.)Bunge的干燥根，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TE124S電子天平；DC-3010電子恒溫電浴鍋；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵；SpectraMax M2 多功能全自動(dòng)酶標(biāo)儀；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；微量移液器；CS501 型超級(jí)恒溫水浴鍋；KQ-50DB超聲清洗器。

1.3 藥品試劑

95%乙醇、甲醇、抗壞血酸、過(guò)硫酸鉀(K2S2O8) 、1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺(ABTS)三吡啶三吖嗪(TPTZ)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的制備

精密稱(chēng)取配比中當(dāng)歸 ∶黃芪的量約共12 g，將藥材倒入250 mL錐形瓶中，加10倍量的乙醇-水(70+30)恒溫加熱，控制溫度在90 ℃，提取30 min，用濾紙將提取液過(guò)濾至燒杯中，濾渣再加10倍量乙醇-水(70+30)，在同樣條件下加熱過(guò)濾。合并濾液后用雙層濾紙抽濾一次，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，最后用乙醇-水(70+30)定容于 50 mL 容量瓶中，此時(shí)當(dāng)歸-黃芪質(zhì)量濃度為 240.00 g/L。將提取液分別配置成含藥材9.60 g/L，19.20 g/L，24.00 g/L，28.80 g/L，48.00 g/L，120.00 g/L的六種濃度溶液，置于4 ℃下冷藏備用。

1.4.2 清除DPPH自由基試驗(yàn)

在96孔板中加入6種不同濃度的樣品液20 μL，再分別加入100 μLDPPH溶液，最后加甲醇80 μL至每個(gè)檢測(cè)孔為200 μL，避光靜置30 min。另將DPPH溶液換為甲醇溶液，重復(fù)上述操作，以甲醇做空白對(duì)照。每份樣品平行操作3次，取平均值。利用多功能酶標(biāo)儀震蕩5 s，測(cè)定519 nm處的A值，計(jì)算DPPH的清除率。

式中：As為樣品+DPPH溶液;Ab為樣品+甲醇溶液;Ac為DPPH溶液;Ab′為甲醇溶液。

1.4.3 清除ABTS自由基試驗(yàn)

在96孔板中分別加入六種不同濃度的樣品液20 μL再分別加入100 μL ABTS工作液，最后加甲醇80 μL至每個(gè)檢測(cè)孔為200 μL，室溫下孵育6 min。利用多功能酶標(biāo)儀震蕩5 s，測(cè)745 nm處的A值，計(jì)算ABTS的清除率。

式中：A1為樣品的A值;A2為空白對(duì)照;A0為ABTS工作液的A值。

1.4.4 鐵還原能力測(cè)定(FRAP)

取TPTZ溶液、TPTZ稀釋液、檢測(cè)緩沖液按1∶10∶1的比例混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)，放入37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱孵育5 min。在96孔板中，加入100 μL已配制好的FRAP工作液，再分別加入20 μL不同濃度的樣品液，最后加甲醇至每個(gè)檢測(cè)孔為200 μL，室溫下孵育5 min。利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)593 nm處的A值，以A值對(duì)不同濃度的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算總抗氧化能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基結(jié)果

9種配比當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)對(duì)DPPH自由基均有一定清除作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大。當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)抗氧化能力大小依次為⑨1∶0>⑦3∶2>⑧5∶3>②2∶3>⑤1∶1>⑥2∶1>④0∶1>①1∶2>③1∶5。見(jiàn)表1。由此我們得知DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)，當(dāng)歸∶黃芪配比為1∶0時(shí)自由基清除率最大，達(dá)到97.7%。當(dāng)歸∶黃芪配比為1∶5時(shí)自由基清除率為60.72%。而當(dāng)歸∶黃芪配比為1∶0時(shí)的清除率相較于1∶5時(shí)高出近37%。

表1 當(dāng)歸-黃芪不同配比對(duì)DPPH自由基清除率%Table 1 DPPH free radical scavenging rate of Angelica and Astragalus membranaceus in different proportions (%)

2.2 清除ABTS自由基結(jié)果

清除ABTS自由基9種配比當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)對(duì)ABTS自由基均有一定清除作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率隨濃度增大而增大。9種當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)抗氧化能力大小依次為②2∶3>⑨1∶0>⑦3∶2>⑤1∶1>⑥2∶1>⑧5∶3>①1∶2>④0∶1>③1∶5。見(jiàn)表2。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到當(dāng)歸∶黃芪配比為2∶3時(shí)自由基清除率高達(dá)101.93%。當(dāng)歸∶黃芪配比比例為1∶0時(shí)的清除率為98.77%僅次于配比為2∶3的自由基清除率。而當(dāng)歸∶黃芪配比為1∶5自由基清除率僅為70.12%。

表2 當(dāng)歸-黃芪不同配比對(duì)ABTS自由基清除率%Table 2 ABTS free radical scavenging rate of Angelica and Astragalus membranaceus in different proportions (%)

2.3 鐵還原能力測(cè)定(FRAP)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在FRAP值中當(dāng)歸-黃芪藥對(duì)各個(gè)部位抗氧化能力大小依次為⑨1∶0>⑥2∶1>⑦3∶2>⑧5∶3>②2∶3>⑤1∶1>①1∶2>④0∶1>③1∶5。結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)結(jié)果得知當(dāng)歸∶黃芪配比為1∶0時(shí)抗氧化能力最強(qiáng)，當(dāng)歸∶黃芪配比為1∶5時(shí)抗氧化能力最弱。

表3 當(dāng)歸-黃芪不同配比的FRAP值Table 3 FRAP values of different proportions of Angelica and Astragalus

3 結(jié) 論

自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷與人體的多種疾病有著緊密的關(guān)系。中藥是抗氧化成分的重要來(lái)源，許多研究發(fā)現(xiàn)中藥的藥理作用與抗氧化活性成分有關(guān)。中藥抗氧化成分多為酚類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、萜烯等[6]，經(jīng)過(guò)配伍后彼此間起到了良好的抗氧化協(xié)同效應(yīng)。黃芪-當(dāng)歸是近代中藥方劑中的常見(jiàn)藥對(duì)，二者均為益氣補(bǔ)血常用藥，經(jīng)歷代醫(yī)家證實(shí)其臨床療效確切[7]。黃芪是我國(guó)中醫(yī)最常用的“扶正固本，補(bǔ)中益氣”中藥之一?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有提高免疫功能、抗應(yīng)激、抗衰老、抗氧化等作用[8-9]。當(dāng)歸是中醫(yī)補(bǔ)血活血最常用的中藥之一，研究表明有促進(jìn)機(jī)體造血功能、降血脂、免疫調(diào)控同時(shí)具有抗血栓、抗腫瘤、抗氧化作用，兩藥合用協(xié)同抗氧化可以改善多種疾病[10-11]。

抗氧化活性可以用在特定條件下，樣品對(duì)檢測(cè)體系中自由基的清除能力、抗過(guò)氧化能力及樣品的還原能力、總抗氧化能力等來(lái)衡量和表征[12]。DPPH自由基是一種合成的、具有單電子、穩(wěn)定的、以氮為中心的順磁化合物。如果物質(zhì)能夠清除DPPH自由基，則說(shuō)明受試物能降低氧自由基和碳自由基的有效濃度，從而達(dá)到阻斷自由基反應(yīng)鏈的作用。ABTS[2，2-連-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]主要用于測(cè)定樣品血紅蛋白含量。FRAP該方法的原理是氧化還原反應(yīng)，能反映待測(cè)樣品的還原能力[13]。

本次課題研究通過(guò)采用 DPPH法、ABTS法及FRAP法，對(duì)黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)體外抗氧化能力進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)測(cè)定9組不同配伍比例下6種濃度的抗氧化能力，反應(yīng)黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)不同配伍的抗氧化能力的強(qiáng)弱，對(duì)其揭示傳統(tǒng)藥方的經(jīng)典配伍比例的作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)出自《內(nèi)外傷辨惑論》中當(dāng)歸補(bǔ)血湯經(jīng)典配比當(dāng)歸∶黃芪為1∶5時(shí)抗氧化能力相較于配比為 1∶0時(shí)的抗氧化能力差距較大，本課題實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)歸-黃芪配比為1∶0時(shí)自由基清除率相較于配比為1∶5高出近37%。在采用DPPH法和ABTS法FRAP法三種方法對(duì)黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)體外抗氧化能力檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸比例高于黃芪比例的的藥對(duì)中抗氧化性也越強(qiáng)，同時(shí)自由基的清除率隨濃度的增加而增加。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究也顯示中藥的配伍所采用的藥對(duì)濃度可能會(huì)對(duì)人體療效產(chǎn)生較大的影響，而中藥對(duì)于治療人體疾病的藥性可能也會(huì)隨著所采用藥物濃度的大小而改變。此研究為后續(xù)對(duì)于黃芪-當(dāng)歸配比用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為其臨床用藥治療上提供了方案。