呂航 李小冬 劉宏鵬 王順 宿慧
骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是骨密度及骨質(zhì)量降低,骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞的一種疾病[1]。酒精對骨密度和骨量存在較大影響[2];酒精能對骨組織的異常代謝進行誘導(dǎo),對成骨-破骨平衡進行破壞[3]。但目前尚未清楚酒精作用在哪個階段來影響B(tài)MSCs抑成骨/促成脂分化的能力。祖國醫(yī)學(xué)認為,酒精性骨質(zhì)疏松癥,以腎虛血瘀為主要病機,以補腎活血法主之[4]。人臍靜脈間充質(zhì)干細胞(human umbilical vein mesenchymal stem cells,hUV-MSCs)來源豐富,具有減輕和消除炎癥、修復(fù)組織損傷等多種生物學(xué)功能,已越來越多地應(yīng)用于器官損傷的治療[5]。以往研究顯示酒精對腎虛血瘀型OP的治療有消極作用[6],但關(guān)于酒精對hUV-MSCs治療腎虛血瘀型OP分子機制方面的研究少見?;诖吮狙芯繉⑼ㄟ^動物實驗對此進行探討,現(xiàn)報道如下。
SPF級健康4周齡SD雄性大鼠40只,大鼠重量240~260 g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK(黑)2019-0004。
試劑:75%醫(yī)用酒精(生產(chǎn)廠家:山東朱氏藥業(yè)集團有限公司,批準(zhǔn)文號:魯衛(wèi)消證字2015第1603號,配置為20%濃度);堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)ELISA檢測試劑盒均購自北京博奧派克生物科技有限公司。
儀器:酶標(biāo)儀(生產(chǎn)廠家:上海賽默科技生物發(fā)展有限公司,型號:DP-6100);-80 ℃超低溫冰箱(生產(chǎn)廠家:日本SANYO三洋電機,型號:MDF-C8V);光學(xué)顯微鏡(生產(chǎn)廠家:日本奧林巴斯,型號:STT-300);熒光顯微鏡(生產(chǎn)廠家:日本奧林巴斯,型號:LF50);臺式高速冷凍離心機(生產(chǎn)廠家:湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司,型號:H2050R)。
細胞株:人臍帶間充質(zhì)干細胞hUV-MSCs,購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。
采用酒精腹腔注射法制備腎虛血瘀型OP大鼠模型,造模成功后將SD大鼠隨機分為酒精組、治療組和對照組,每組10只。酒精組尾靜脈注射酒精 [20%,10 ml/(kg·次),1次 /周 ],對照組在酒精組基礎(chǔ)上尾靜脈注射hUV-MSCs(1次/周,107個細胞/次),治療組停止酒精注射但尾靜脈注射注射 hUV-MSCs(1次 /周,107個細胞 /次);取SD大鼠10只腹腔注射法生理鹽水作為假手術(shù)組,尾靜脈注射生理鹽水 [10 ml/(kg·次),1次 /周 ]。四組均連續(xù)治療8周。
處死大鼠后,取大鼠腰椎骨進行以下檢測:(1)采用HE染色對大鼠骨組織的病理損傷情況進行檢測,觀察骨小梁面積變化。(2)采用TUNEL染色檢測觀察骨組織細胞凋亡情況,熒光顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的TUNEL陽性細胞并拍照。(3)采用醫(yī)學(xué)顯微CT檢測骨組織的骨體積分數(shù)(bone volume fraction,BVF)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)和骨小梁分離距離(trabecular separation/spacing,Tb.Sp)。(4)采用 ELISA 檢測血清ALP和TRAP水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
假手術(shù)組、酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積分別為(71.25±3.64)%、(38.19±2.57)%、(52.10±2.76)%、(56.31±2.90)%,四組大鼠骨組織骨小梁面積比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=206.5,P<0.05)。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積均小于假手術(shù)組(P<0.05),治療組與對照組大鼠骨組織骨小梁面積均大于酒精組(P<0.05),治療組大鼠骨組織骨小梁面積大于對照組(P<0.05)。四組大鼠骨組織病理學(xué)HE染色情況,見圖1。
圖1 四組大鼠骨組織病理學(xué)HE染色情況(×100)
假手術(shù)組、酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織 TUNEL陽性細胞數(shù)分別為(5.16±1.08)、(36.29±2.43)、(27.18±2.05)、(24.71±2.36),四組比較大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=407.5,P<0.05)。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)均多于假手術(shù)組(P<0.05),治療組與對照組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)均少于酒精組(P<0.05),治療組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)明顯少于對照組(P<0.05)。四組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞熒光顯色圖片,見圖2。
圖2 四組大鼠骨組織TUNEL陽性細胞熒光顯色圖片(×200)
四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均低于假手術(shù)組(P<0.05),Tb.Sp均高于假手術(shù)組(P<0.05);治療組與對照組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于酒精組(P<0.05),Tb.Sp均低于酒精組(P<0.05);治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于對照組(P<0.05),Tb.Sp低于對照組(P<0.05),見表 1。
表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較(±s)
表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較(±s)
*與假手術(shù)組比較,P<0.05;#與酒精組比較,P<0.05;△與對照組比較,P<0.05。
組別 BVF(%) Tb.Th(mm) Tb.Sp(mm)假手術(shù)組(n=10) 31.60±2.98 0.079±0.003 0.13±0.04酒精組(n=10) 8.42±1.05* 0.034±0.002* 0.65±0.07*對照組(n=10) 17.53±2.14*# 0.048±0.005*# 0.54±0.06*#治療組(n=10) 20.90±2.36*#△ 0.060±0.007*#△ 0.26±0.03*#△F值 175.8 167.2 235.0 P 值 <0.001 <0.001 <0.001
四組血清ALP與TRAP水平比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。酒精組、對照組、治療組大鼠血清ALP與TRAP水平均高于假手術(shù)組(P<0.05),治療組與對照組大鼠血清ALP與TRAP水平均低于酒精組(P<0.05),治療組大鼠骨血清ALP與TRAP水平均低于對照組(P<0.05),見表2。
表2 四組血清ALP和TRAP水平比較(±s)
表2 四組血清ALP和TRAP水平比較(±s)
*與假手術(shù)組比較,P<0.05;#與酒精組比較,P<0.05;△與對照組比較,P<0.05。
組別 ALP(U/L) TRAP(pg/ml)假手術(shù)組(n=10) 17.36±2.48 14.30±1.69酒精組(n=10) 60.17±3.95* 35.72±3.68*對照組(n=10) 41.60±2.72*# 26.47±2.16*#治療組(n=10) 33.80±2.49*# △ 21.05±2.24*# △F值 357.5 125.6 P 值 <0.001 <0.001
酒精性O(shè)P是繼發(fā)性O(shè)P,是指因人體長期大量飲酒引起骨量丟失,骨微觀結(jié)構(gòu)退化致使骨脆性增加的一種全身性骨骼疾病[6]。長期慢性飲酒可致多種疾病發(fā)生,酒精可干擾骨代謝,損害骨骼系統(tǒng)引起骨質(zhì)疏松,導(dǎo)致骨折,為家庭帶來沉重經(jīng)濟負擔(dān)[7]。hUV-MSC能分化成為中胚層間質(zhì)組織,具備自我更新及多向分化的潛能。hUV-MSCs來源豐富、取材操作方便、不涉及倫理學(xué)問題,能促進成骨細胞的增殖活性[8]。國外學(xué)者通過構(gòu)建骨質(zhì)疏松性下頜骨壞死大鼠模型,探討臍帶間充質(zhì)干細胞的治療效果,結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松性下頜骨壞死大鼠骨再生明顯增強,成骨細胞數(shù)量增高[9]。
以往有研究顯示,長期酒精攝入可導(dǎo)致大鼠骨小梁數(shù)量減少、間隙增大、厚度降低,使骨骼彈性模量、最大載荷及破壞載荷等生物力學(xué)性能降低,骨骼抵抗外力性能下降,骨折風(fēng)險明顯增加[10];還有研究顯示,酒精可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞ROS水平及自噬水平升高,抑制成骨而促進成脂分化[11]。本研究結(jié)果顯示,酒精組、對照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均低于假手術(shù)組,骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均高于假手術(shù)組(P<0.05);治療組與對照組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于酒精組,骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于酒精組(P<0.05);治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于對照組,骨組織TUNEL陽性細胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于對照組(P<0.05)。提示酒精對hUV-MSCs治療OP大鼠有消極的影響。ALP是堿性磷酸的一種同工酶,由成骨細胞產(chǎn)生,是成骨細胞成熟和具有活性的標(biāo)志,對了解成骨細胞的狀態(tài)有重要意義。隨著OP病情的進展ALP水平逐漸升高,表明其與骨質(zhì)疏松有密切的關(guān)系[12-13]。TRAP過度表達的大鼠模型表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松。骨吸收時,破骨細胞附著在骨的表面,分泌的酸和蛋白酶在骨基質(zhì)與破骨細胞之間形成一個空隙,磷酸酐酶和H+-ATP酶質(zhì)子泵形成一個酸性環(huán)境,位于破骨細胞微粒體TRAP,即通過破骨細胞波狀緣分泌進入此空隙,與其他酶一起參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解[14-15]。
綜上所述,酒精影響hUV-MSCs成骨/成脂分化平衡,進而影響了其在腎虛血瘀型OP中的治療效果。