儲 蓄，張軍霞，王 晶

(1．北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院-美國俄克拉荷馬州立大學(xué)動物科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

動物生產(chǎn)中抗生素的濫用已成為重大公共安全問題，嚴(yán)重危害動物和人類健康。因此，通過營養(yǎng)手段提高機(jī)體免疫力和抗病毒能力成為目前畜禽替抗研究的熱點(diǎn)之一。宿主防御肽(host defense peptides,HDPs)又稱抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)，是一種具有抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等多種功能的小分子肽[1]。豬源HDPs發(fā)現(xiàn)較早，主要分為Cathelicidin和Defensin兩大家族。研究發(fā)現(xiàn)，HDPs具有抗炎抑炎[2]和抑制細(xì)菌真菌增殖[3]等能力，且HDPs不易產(chǎn)生耐藥性[4]，這些特性使得HDPs成為一種潛在的抗生素替代物，用以增加動物機(jī)體免疫力。目前體外合成HDPs價格較昂貴，還存在穩(wěn)定性差、易酶解等問題，而通過營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源HDPs是提高機(jī)體免疫的可能途徑之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，維生素、脂肪酸、益生菌、氨基酸、礦物質(zhì)等均能誘導(dǎo)內(nèi)源性HDPs的表達(dá)[5-6]。

丁酸是一種揮發(fā)性脂肪酸，主要由機(jī)體腸道中一些特定的微生物發(fā)酵產(chǎn)生[7]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可顯著增加豬腎細(xì)胞(PK-15)中pBD3、pBD128、pBD123、pBD115和pEP2C基因的表達(dá)，且不引起炎癥反應(yīng)[8]；而在仔豬飼糧中添加0.2%的丁酸鈉，也可顯著增加仔豬回腸和結(jié)腸pBD2和pBD3基因的表達(dá)，減輕仔豬炎癥反應(yīng)，并降低糞便中產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)含量[9]。丁酸鈉與某些HDPs誘導(dǎo)劑之間存在一定的協(xié)同效應(yīng)，如丁酸鈉與渥曼青霉素、橡精和粉防己堿可協(xié)同誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞β防御素9(AvBD9)基因的表達(dá)[10]；同時飼喂毛喉素和丁酸鈉也可協(xié)同誘導(dǎo)雞嗉囊和空腸中AvBD9基因的表達(dá)[11]。北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)研究室在前期開展的高通量篩選研究中，從1 261個天然產(chǎn)物化合物中篩選出黃腐酚(xanthohumol)、異丹葉大黃素(isorhapontigenin)、去氧紫草素(deoxyshikonin)和毛蕊異黃酮(calycosin)4種可明顯誘導(dǎo)豬腸上皮細(xì)胞IPEC-J2和豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/31 HDPs表達(dá)的中藥單體[12]。然而，這些中藥單體與丁酸鈉在誘導(dǎo)豬細(xì)胞HDPs表達(dá)方面是否具有潛在的協(xié)同作用尚不清楚。因此，為獲得更多提高豬HDPs表達(dá)的可能，本研究擬對上述4種中藥單體成分與丁酸鈉在IPEC-J2和3D4/31細(xì)胞中是否對HDPs表達(dá)具有協(xié)同作用進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期為動物生產(chǎn)實(shí)踐中提高機(jī)體防御功能提供新方法和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腸道上皮細(xì)胞IPEC-J2和豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/31均由美國俄克拉荷馬州立大學(xué)饋贈；ETEC(F4+ETEC),血清型O149∶K91，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。丁酸鈉(sodium butyrate)購自Sigma公司；黃腐酚(C21H22O5)、異丹葉大黃素(C15H14O4)、去氧紫草素(C16H16O4)、毛蕊異黃酮(C16H12O6)均購自Target Molecule公司；胎牛血清、DMEM/F12、RPMI 1640培養(yǎng)基均購自Gibco公司；RNAzol RT購自Molecular Research Center公司；iScriptTMcDNA試劑盒和iTapTMUniversal SYBR@Green Supermix試劑盒均購自Bio-Rad公司；Trypticase soy培養(yǎng)基購自Thermo公司。超凈工作臺、臺式離心機(jī)、DS-11超微量光度計、QuantStudio 3 Real-Time PCR儀、超聲細(xì)胞破碎儀、酶標(biāo)儀。

1.2 IPEC-J2和3D4/31細(xì)胞培養(yǎng)

將IPEC-J2細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素)的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時消化傳代，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

將3D4/31細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、1%雙抗和1%丙酮酸鈉的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時消化傳代，并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 不同中藥單體和丁酸處理對IPEC-J2和3D4/31細(xì)胞HDPs和細(xì)胞因子表達(dá)的影響

取生長狀態(tài)良好的IPEC-J2和3D4/31細(xì)胞分別按1.25×105和4×105/孔接種到12孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后處理細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)。試驗(yàn)所用化合物濃度均基于前期試驗(yàn)結(jié)果[12]，均為誘導(dǎo)HDPs表達(dá)的最佳處理濃度。試驗(yàn)分為10組，具體分組信息見表1，每組3個復(fù)孔，試驗(yàn)重復(fù)3次。

培養(yǎng)24 h后，每孔加入250 μL RNAzol RT裂解細(xì)胞，提取總RNA，置于冰上保存。使用DS-11超微量光度計檢測RNA濃度與純度，A260 nm/A280 nm值在1.8～2.0，A260 nm/A230 nm值>2時，表明RNA純度較高。按iScriptTMcDNA試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，測定HDPspBD2、pEP2C、pBD3、PG1-5基因及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-1β基因的表達(dá)。實(shí)時熒光定量PCR所用引物序列參照前期研究結(jié)果[12]，引物信息見表2。反應(yīng)體系10 μL：iTaqUniversal SYBR Green Supermix 5 μL，cDNA 4 μL，上、下游引物各0.3 μL，無RNA酶H2O 0.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)設(shè)計及分組Table 1 Experimental design and grouping

表2 實(shí)時熒光定量PCR引物信息Table 2 Primer information for Real-time PCR

續(xù)表

1.4 不同中藥單體和丁酸鈉處理對3D4/31細(xì)胞抑菌活性的影響

將ETEC劃線接種于Trypticase soy瓊脂平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜活化。挑取單菌落至液體Trypticase soy培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min搖晃培養(yǎng)至對數(shù)生長期。配制含1 mmol/L NaH2PO4和25 mmol/L NaHCO3的溶液，并與Trypticase soy液體培養(yǎng)基1∶4混勻制備成稀釋液，將ETEC稀釋到2.5×105CFU/mL備用。

取生長狀態(tài)良好的3D4/31細(xì)胞以每孔8×105個細(xì)胞均勻接種到6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。按1.3方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用HBSS平衡液清洗細(xì)胞，之后刮取細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入120 μL純水重懸，于-80 ℃靜置20 min，隨后置于冰上5 min以裂解細(xì)胞。用超聲細(xì)胞破碎儀對細(xì)胞進(jìn)行再次裂解后，離心取50 μL上清裂解液與50 μL上述制備的ETEC菌液分別共同培養(yǎng)3、6、9和24 h，用酶標(biāo)儀測定D600 nm值。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法比較共同處理組與單獨(dú)處理組間的差異。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用Origin 2019進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié) 果

2.1 不同中藥單體和丁酸鈉共同處理對IPEC-J2細(xì)胞HDPs表達(dá)的影響

由圖1可知，黃腐酚與丁酸鈉共同處理組的pEP2C基因表達(dá)量顯著高于黃腐酚單獨(dú)處理組(P<0.05)，與丁酸鈉單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)；pBD2、pBD3和pG1-5基因表達(dá)量在黃腐酚與丁酸鈉共同處理組與單獨(dú)處理組間差異不顯著(P>0.05)。異丹葉大黃素與丁酸鈉共同處理組pBD3和pEP2C基因表達(dá)量極顯著高于異丹葉大黃素及丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.01)；pBD2和PG1-5基因表達(dá)量極顯著高于異丹葉大黃素單獨(dú)處理組(P<0.01)，但與丁酸鈉單獨(dú)處理組相比差異不顯著(P>0.05)。去氧紫草素和丁酸鈉共同處理組PG1-5基因表達(dá)量極顯著高于去氧紫草素和丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.01)；pBD3基因表達(dá)量顯著高于去氧紫草素和丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05)；pBD2和pEP2C基因表達(dá)量均極顯著高于去氧紫草素單獨(dú)處理組(P<0.01)，但與丁酸鈉單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)。毛蕊異黃酮和丁酸鈉共同處理組pBD2、pEP2C、pBD3和PG1-5基因的表達(dá)均顯著或極顯著高于毛蕊異黃酮和丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05；P<0.01)。

2.2 不同中藥單體和丁酸鈉共同處理對3D4/31細(xì)胞HDPs表達(dá)的影響

由圖2可知，黃腐酚和丁酸鈉共同處理組與黃腐酚單獨(dú)處理組相比，pEP2C和pBD3基因表達(dá)均差異不顯著(P>0.05)。異丹葉大黃素和丁酸鈉共同處理組pBD2和pEP2C基因表達(dá)量均顯著高于異丹葉大黃素單獨(dú)處理組(P<0.05)；pBD3基因表達(dá)量極顯著高于異丹葉大黃素單獨(dú)處理組(P<0.01)，但與丁酸鈉單獨(dú)處理組相比差異不顯著(P>0.05)。去氧紫草素和丁酸鈉共同處理組各基因表達(dá)差異均不顯著(P>0.05)，其他基因未表現(xiàn)增強(qiáng)效果。毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理組pBD3基因表達(dá)量分別極顯著和顯著高于毛蕊異黃酮單獨(dú)處理組(P<0.01)和丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05)；pBD2基因表達(dá)量極顯著高于毛蕊異黃酮單獨(dú)處理組(P<0.01)，但與丁酸鈉單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)；PG1-5和pEP2C基因的表達(dá)與丁酸鈉或毛蕊異黃酮單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同中藥單體和丁酸鈉共同處理對IPEC-J2細(xì)胞因子表達(dá)的影響

由圖3可知，黃腐酚、異丹葉大黃素、去氧紫草素和毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理組IPEC-J2細(xì)胞IL-6基因表達(dá)量與對應(yīng)的中藥單體及丁酸鈉單獨(dú)處理組差異均不顯著(P>0.05)。黃腐酚、毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理組IPEC-J2細(xì)胞IL-1β基因表達(dá)量較對應(yīng)中藥單體單獨(dú)處理組顯著升高(P<0.05)，但與丁酸鈉單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同中藥單體和丁酸鈉共同處理對3D4/31細(xì)胞因子表達(dá)的影響

由圖4可知，黃腐酚和丁酸鈉共同處理組3D4/31細(xì)胞IL-6基因表達(dá)量顯著高于丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05)，但與黃腐酚單獨(dú)處理差異不顯著(P>0.05)；異丹葉大黃素、毛蕊異黃酮和丁酸鈉共同處理后3D4/31細(xì)胞IL-6基因含量顯著低于各自單獨(dú)處理組(P<0.05)，但與丁酸鈉單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)。黃腐酚、異丹葉大黃素、去氧紫草素、毛蕊異黃酮和丁酸鈉共同處理組3D4/31細(xì)胞IL-1β基因表達(dá)量與各自單獨(dú)處理組差異均不顯著(P>0.05)。

①C，空白組；NaB，丁酸鈉；XN，黃腐酚；ISO，異丹葉大黃素；DEO，去氧紫草素；CAL，毛蕊異黃酮。圖2～4同。②共同處理組與丁酸鈉組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。共同處理組與對應(yīng)的中藥單體組相比，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01)；無#，差異不顯著(P>0.05)。圖2～4及表3同 ①C,Control group;NaB,Sodium butyrate;XN,Xanthohumol;ISO,Isorhapontigenin;DEO,Deoxyshikonin;CAL,Calycosin.The same as fig.2-fig.4.②Compared with the sodium butyrate group,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);No *，No significant difference (P>0.05).Compared with the corresponding Chinese herbal monomers group,#,Significant difference (P<0.05);##,Extremely significant difference (P<0.01);No #，No significant difference (P>0.05).The same as fig.2-fig.4,and table 3圖1 中藥單體與丁酸鈉處理對IPEC-J2細(xì)胞HDPs表達(dá)的影響Fig.1 Effects of Chinese herbal monomers and sodium butyrate on expression of HDPs in IPEC-J2 cells

圖2 中藥單體與丁酸鈉處理對3D4/31細(xì)胞HDPs表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Chinese herbal monomers and sodium butyrate treatment on expression of HDPs in 3D4/31 cells

圖3 中藥單體與丁酸鈉處理對IPEC-J2細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Chinese herbal monomers and sodium butyrate treatment on cytokines expression in IPEC-J2 cells

圖4 中藥單體與丁酸鈉處理對3D4/31細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Chinese herbal monomers and sodium butyrate treatment on cytokine expression in 3D4/31 cells

2.5 不同中藥單體和丁酸鈉共同處理對3D4/31細(xì)胞抑制ETEC活性的影響

不同中藥單體和丁酸鈉共同處理對3D4/31細(xì)胞抑制ETEC活性的影響見表3。處理3 h時，去氧紫草素、毛蕊異黃酮和丁酸鈉共同處理組與丁酸鈉及對應(yīng)中藥單體單獨(dú)處理組相比，ETEC存活率顯著降低(P<0.05)。處理6 h時，異丹葉大黃素與丁酸鈉共同處理組ETEC存活率顯著低于丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05)，但與異丹葉大黃素單獨(dú)處理組差異不顯著(P>0.05)；毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理組較毛蕊異黃酮和丁酸鈉單獨(dú)處理組ETEC存活率分別顯著和極顯著下降(P<0.05；P<0.01)。處理9 h時，異丹葉大黃素、去氧紫草素、毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理組ETEC存活率均顯著或極顯著低于丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05；P<0.01)，但與對應(yīng)中藥單體單獨(dú)處理組沒有顯著差異(P>0.05)。處理24 h時，毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理組ETEC存活率分別顯著和極顯著低于毛蕊異黃酮和丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.05；P<0.01)；異丹葉大黃素、去氧紫草素與丁酸鈉共同處理組ETEC存活率極顯著低于丁酸鈉單獨(dú)處理組(P<0.01)，但與對應(yīng)中藥單體單獨(dú)處理組無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同中藥單體和丁酸鈉處理對3D4/31細(xì)胞抑制ETEC活性的影響Table 3 Effects of different Chinese herbal monomers and sodium butyrate treatment on the antibacterial activity of porcine 3D4/31 cells to ETEC

3 討 論

3～8個碳的短鏈脂肪酸鹽中，丁酸鈉對IPEC-J2細(xì)胞HDPs調(diào)控作用最強(qiáng)，對pBD2、pBD3和pEP2C基因表達(dá)有明顯誘導(dǎo)作用，長鏈脂肪酸鹽的調(diào)控作用較弱[13]。低濃度丁酸鈉(0.2～0.4 mmol/L)會促進(jìn)IPEC-J2細(xì)胞的分化，而高濃度(0.5 mmol/L或更高)時則可能通過p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路降低細(xì)胞活性并引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]。竇秀靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉對IPEC-J2細(xì)胞和PK-15細(xì)胞pBD3和pEP2C基因表達(dá)呈濃度和時間依賴效應(yīng)，IPEC-J2細(xì)胞最佳濃度為4 mmol/L，最佳時間為24 h。實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，丁酸鈉濃度為8 mmol/L時，誘導(dǎo)HDPs表達(dá)效果最優(yōu)，因此后續(xù)試驗(yàn)中采用該濃度。此外，研究發(fā)現(xiàn)一些中草藥活性成分與丁酸鈉在人和雞的相關(guān)研究中對HDPs表達(dá)有協(xié)同誘導(dǎo)作用[16-17]，然而在豬上的協(xié)同表達(dá)效果鮮見文獻(xiàn)報道。

本試驗(yàn)所用黃腐酚是一種從啤酒花中提取的戊基化類黃酮[18]，具有抗病毒[19]、抗炎和抗氧化[20]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃腐酚可與人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/6)中組蛋白H2A、H28和H4等靶點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮抗癌作用，并推測黃腐酚可調(diào)節(jié)組蛋白的翻譯后修飾，然而具體機(jī)制尚不清楚[21]。丁酸鹽主要通過促進(jìn)組蛋白H3乙?；せ頜APK、JNK和Erk1/2信號通路，表達(dá)促炎細(xì)胞因子、趨化因子和β防御素[22]。本研究中，黃腐酚與丁酸鈉單獨(dú)處理可誘導(dǎo)豬IPEC-J2細(xì)胞HDPs表達(dá)，但并不表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，這是否和它們作用于不同的組蛋白位點(diǎn)有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

異丹葉大黃素是一類二苯乙烯類化合物，是白蘆藜醇的甲氧基化類似物[23]，具有抗炎和抗氧化的功能[24-26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，異丹葉大黃素與丁酸鈉共同處理細(xì)胞對pBD2、pBD3和pEP2C基因的表達(dá)具有明顯的協(xié)同效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽和白蘆藜醇均具有抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化作用，兩者同時作用可協(xié)同增強(qiáng)結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco2)的分化，但沒有協(xié)同抑制增殖的能力[27]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)白蘆藜醇4-羥基上修飾丁酸酯可更好地增強(qiáng)其抗癌活性[28]。另外，通過包被的方法，丁酸鹽-白蘆藜醇酯表現(xiàn)更穩(wěn)定且有著更強(qiáng)的過氧化氫清除能力[29]。因此，推測異丹葉大黃素和丁酸鹽也存在類似的協(xié)同作用，其中也包括對豬HDPs的誘導(dǎo)。此外，研究發(fā)現(xiàn)白蘆藜醇可通過SIRT1(一種NF-κB的抑制劑)誘導(dǎo)人原發(fā)髓細(xì)胞HDPs基因的表達(dá)[30]，王鑫[31]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉通過NF-κB途徑促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)宿主防御肽BMAP-34和DEFB1基因的表達(dá)。因此推測異丹葉大黃素與丁酸鈉的協(xié)同表達(dá)作用也可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)的，但這一推測還有待進(jìn)一步證實(shí)。

去氧紫草素是一類天然萘醌類化合物，有較強(qiáng)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能[32]。本研究結(jié)果表明，去氧紫草素和丁酸鈉共同處理IPEC-J2細(xì)胞可協(xié)同誘導(dǎo)PG1-5基因表達(dá)，共同處理3D4/31細(xì)胞時pEP2C基因的表達(dá)呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。Yang等[33]發(fā)現(xiàn)去氧紫草素可增加組蛋白乙?；剑芎齕34]也發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可通過抑制組蛋白去乙?；富钚砸栽黾咏M蛋白乙?；潭?，進(jìn)而誘導(dǎo)豬HDPs表達(dá)。因此，推測去氧紫草素和丁酸鈉共同促進(jìn)組蛋白乙酰化程度進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞HDPs表達(dá)，并呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。

毛蕊異黃酮是黃芪的主要藥效成份，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用[35-36]。Deng等[37]發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可通過調(diào)控IGF1R/PI3K/Akt、NF-κB和MAPK等信號通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化或抑制成骨細(xì)胞凋亡。而Dai等[22]發(fā)現(xiàn)丁酸鹽可通過上調(diào)MAPK信號通路促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞β防御素的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，毛蕊異黃酮與丁酸鈉可協(xié)同誘導(dǎo)IPEC-J2細(xì)胞pEP2C、pBD2、pBD3和PG1-5基因表達(dá)和3D4/31細(xì)胞pBD3和pEP2C基因的表達(dá)，但毛蕊異黃酮和丁酸鈉是否通過同時作用于MAPK信號通路促進(jìn)了HDPs的表達(dá)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

丁酸鈉和20 μmol/L維生素D3共同使用時可使IPEC-J2細(xì)胞pBD3 基因表達(dá)提高30倍[38]，而丁酸鈉和1,25二羥基VD3可使雞AvBD9基因的表達(dá)量提高4 900倍[16]，因此，不同物種可能影響HDPs的協(xié)同表達(dá)效果。本研究所涉及的4種化合物與丁酸鈉的協(xié)同效果是否能在其他物種體現(xiàn)還需進(jìn)行更多的研究。此外，化合物在誘導(dǎo)相同物種不同類型細(xì)胞HDPs的表達(dá)中也表現(xiàn)顯著差異[39-40]。Zeng等[13]發(fā)現(xiàn)8 mmol/L丁酸處理后IPEC-J2細(xì)胞pBD2基因表達(dá)量提高了84倍，而在3D4/31細(xì)胞中僅為6.6倍。本試驗(yàn)前期研究也發(fā)現(xiàn)，本研究所涉及的4種化合物在不同細(xì)胞之間的表達(dá)量也存在差異。

丁酸不僅可給細(xì)胞提供能量，還對機(jī)體免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。丁酸鹽可調(diào)控新生仔豬回腸炎癥因子IL-8、干擾素-γ(IFN-γ)和IL-1β基因的表達(dá)，對腸道健康有潛在的保護(hù)作用[41]。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所用4種中藥單體在誘導(dǎo)HDPs表達(dá)時，不會引起細(xì)胞明顯的炎癥反應(yīng)[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，丁酸鈉與中藥單體共同處理IPEC-J2細(xì)胞時與中藥單體處理相比未引起IL-6基因表達(dá)的明顯變化，但I(xiàn)L-1β基因表達(dá)量的變化可能由于丁酸鈉的誘導(dǎo)效應(yīng)發(fā)生相應(yīng)的變化。IL-1β是細(xì)胞因子IL-1超家族成員，與IL-18結(jié)構(gòu)相似[42]。研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽可激活I(lǐng)PEC-J2細(xì)胞中GPR109A(一種結(jié)腸中丁酸鹽的受體)使得NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)活化，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β基因表達(dá)[43-44]，而NLRP3基因的表達(dá)產(chǎn)物正是IL-1β和IL-18的激活劑[45]。本研究中，中藥單體與丁酸鈉共同處理后IL-1β基因表達(dá)量與丁酸鈉單獨(dú)處理相近，因此,推測丁酸鈉和中藥單體共同處理IPEC-J2細(xì)胞時可能主要通過丁酸鈉激活NLRP3誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)。此外，研究結(jié)果顯示，異丹葉大黃素、毛蕊異黃酮與丁酸鈉共同處理3D4/31細(xì)胞，IL-6基因表達(dá)量顯著低于異丹葉大黃素、毛蕊異黃酮單獨(dú)處理；IL-1β基因的表達(dá)量也呈現(xiàn)類似趨勢，但差異不顯著。因此,推測異丹葉大黃素、毛蕊異黃酮和丁酸鈉共同處理可一定程度緩解3D4/31細(xì)胞的炎性反應(yīng)，但其作用效果和機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

由于缺乏豬HDPs的有效抗體，無法直接驗(yàn)證丁酸鈉與中藥單體是否在蛋白水平上對豬細(xì)胞有協(xié)同誘導(dǎo)HDPs的能力,本研究通過細(xì)胞抑菌能力的提升，間接證實(shí)丁酸鈉與中藥單體誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生HDPs從而發(fā)揮抑菌作用的能力。ETEC是導(dǎo)致仔豬黃痢、白痢、水腫甚至死亡的主要原因，國內(nèi)約有35%的仔豬因感染ETEC而導(dǎo)致腹瀉,給養(yǎng)殖業(yè)帶來了重大經(jīng)濟(jì)損失[46]。研究表明，丁酸鈉可通過抑制組蛋白乙?；富钚?，上調(diào)內(nèi)源HDPs的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞3D4/2清除ETEC的能力[34]，這表明丁酸鈉可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生HDPs以抑制細(xì)菌生長。4種中藥單體促進(jìn)3D4/31細(xì)胞抑菌能力提升也已被前期研究結(jié)果證明[12]。本研究結(jié)果表明，除黃腐酚外，其他中藥單體和丁酸鈉單獨(dú)或共同處理均可抑制ETEC的活性，其中毛蕊異黃酮與丁酸鈉具有最佳協(xié)同效果，這與HDPs基因表達(dá)的結(jié)果趨勢相同，說明中藥單體與丁酸鈉可通過協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生HDPs以提高機(jī)體抗菌能力。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，中藥單體與丁酸鈉可在一定程度上協(xié)同促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生HDPs以抑制ETEC等致病菌的生長，可為抗生素替代品的研究提供新的思路，并可為動物生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。需要注意的是，不同細(xì)胞系、不同物種對中藥單體與丁酸鈉的敏感程度有所不同，實(shí)際應(yīng)用中需綜合考慮并進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，此外，中藥單體與丁酸鈉發(fā)揮協(xié)同作用的內(nèi)在機(jī)制也需進(jìn)一步研究。