邵淑玉，李 佳，馬 卓,2，于 暢,2，張 瑩，張金龍,2，馬志禹,2

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009；2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125)

蛙皮素(bombesin)作為一種重要的神經(jīng)肽，在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮重要的生理功能[1]。哺乳動(dòng)物蛙皮素受體主要包括：神經(jīng)介素B受體(neuromedin B receptor，NMBR)、胃泌素釋放肽受體(gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)和蛙皮素樣受體3(bombesin-like receptor 3，BRS3)，均為G蛋白偶聯(lián)受體，具有典型的7次跨膜結(jié)構(gòu)域[2-3]。在體內(nèi)，NMBR與其內(nèi)源性配體(NMB)結(jié)合，刺激胃腸道和泌尿生殖道平滑肌收縮[4]、調(diào)節(jié)垂體促甲狀腺激素合成和分泌[5]、影響正常和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[6]和生殖功能等多種生物學(xué)作用[7-10]。研究發(fā)現(xiàn)，NMBR基因在人、大鼠、小鼠、兔、豬等的睪丸組織中均有表達(dá),且主要分布于睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cells)中[11-13]；一定濃度的NMB能夠調(diào)節(jié)豬[14]和兔[15]Leydig細(xì)胞睪酮的合成和分泌，說(shuō)明NMB在雄性動(dòng)物生殖調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

過(guò)表達(dá)技術(shù)在研究基因功能中愈來(lái)愈重要，通過(guò)構(gòu)建外源基因過(guò)表達(dá)能夠有效增加細(xì)胞中特定基因的表達(dá)。NMBR基因可能在豬Leydig細(xì)胞睪酮合成和分泌過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，但NMBR基因過(guò)表達(dá)在豬上的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。由于與其他的載體系統(tǒng)相比，慢病毒載體能夠攜帶較長(zhǎng)的目的基因片段和穩(wěn)定高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系或原代細(xì)胞，并且不會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞的免疫應(yīng)答機(jī)制。pCD513B-1屬于第3代慢病毒過(guò)表達(dá)載體，具有生物安全性更高，病毒包裝效率更高等優(yōu)點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)擬以pCD513B-1質(zhì)粒為載體，通過(guò)重組構(gòu)建豬NMBR基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體，包裝獲得豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒，并將獲得的慢病毒轉(zhuǎn)染豬Leydig細(xì)胞，為后續(xù)研究NMBR基因過(guò)表達(dá)在豬Leydig細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器

豬Leydig細(xì)胞由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)；pMD19-T載體、RNAiso Plus、XbaⅠ、EcoR Ⅰ、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；2×TaqPlus MasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green Master Mix Kit均購(gòu)自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；DMEM、TurboFect、胎牛血清(FBS)、Advanced DMEM和Opti-MEM均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；豬NMBR基因克隆質(zhì)粒、pCD513B-1慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。恒溫振蕩培養(yǎng)箱(IS-RDV1)購(gòu)自Benchmark公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-2500)購(gòu)自上海天能科技有限公司；PCR儀(T100)、熒光定量PCR儀(7500)均購(gòu)自Bio-Rad公司；Ti-E倒置熒光顯微鏡(CKX53)購(gòu)自Nikon公司。

1.2 豬NMBR CDS序列的獲得

1.2.2 目的片段的擴(kuò)增與純化 以豬NMBR基因克隆質(zhì)粒為模板，使用2×TaqPlus MasterMix對(duì)目的片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPlus MasterMix 12.5 μL，模板2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并按照膠回收試劑盒說(shuō)明書純化、回收目的片段。

1.3 慢病毒過(guò)表達(dá)載體pCD513B-1-NMBR構(gòu)建

1.3.1 pMD19-T-NMBR質(zhì)粒的獲得 根據(jù)pMD19-T質(zhì)粒說(shuō)明書將目的片段插入pMD19-T質(zhì)粒構(gòu)建pMD19-T-NMBR重組質(zhì)粒，將4 μL目的片段、1 μL pMD19-T質(zhì)粒和5 μL Solution Ⅰ混合液在離心管中輕輕吹打混勻，16 ℃水浴30 min進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，混勻后冰上放置30 min，將靜置后的混合物在42 ℃水浴中熱激60 s，冰上靜置2 min后加入800 μL無(wú)氨芐LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床上復(fù)壯45 min，菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落置于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)過(guò)夜，通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)增pMD19-T-NMBR質(zhì)粒。按照高純度質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，并以質(zhì)粒為模板按照1.2.2方法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.3.2 雙酶切pCD513B-1和pMD19-T-NMBR質(zhì)粒 按照XbaⅠ和EcoRⅠ說(shuō)明書分別對(duì)pCD513B-1和pMD19-T-NMBR質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系50 μL：XbaⅠ和EcoRⅠ各2.5 μL，0.1% BSA 5 μL，10×M Buffer 5 μL，pCD513B-1/pMD19-T-NMBR質(zhì)粒25 μL，ddH2O 10 μL。酶切程序：37 ℃水浴2 h，加入10×Loading Buffer 6 μL 終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)線性化pCD513B-1和NMBR片段大小分別切取凝膠，然后通過(guò)膠回收試劑盒純化、回收獲得線性化pCD513B-1和NMBR片段。

1.3.3 pCD513B-1-NMBR重組質(zhì)粒的獲得 在T4 DNA連接酶作用下將線性化pCD513B-1和NMBR進(jìn)行連接，構(gòu)建pCD513B-1-NMBR重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞獲得DH5α-pCD513B-1-NMBR菌株，并通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)擴(kuò)增獲得pCD513B-1-NMBR重組質(zhì)粒。將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收后送南京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.4 豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒的獲得

1.4.1 HEK-293T細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 將保存的HEK-293T細(xì)胞37 ℃溫浴復(fù)蘇，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，傳2～3代即可進(jìn)行慢病毒的包裝。按照1×106/mL將HEK-293T細(xì)胞接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 慢病毒的包裝 將pCD513B-1-NMBR質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)各1.0 μg加入Opti-MEM中混勻，再加入TurboFect轉(zhuǎn)染試劑12 μL，輕輕混勻，室溫避光靜置20 min；然后將質(zhì)?；旌衔镏鸬渭尤際EK-293T細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)16 h；棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，換為Advanced DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h；通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒培養(yǎng)情況(GFP標(biāo)簽為綠色熒光)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心5 min，取上清液，于―80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 病毒效價(jià)測(cè)定 按照3×103/mL將HEK-293T細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行病毒效價(jià)測(cè)定。將病毒用DMEM培養(yǎng)液倍比稀釋為101～106倍；棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，加入稀釋的病毒液，病毒和細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，更換正常的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h；用熒光顯微鏡觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；根據(jù)GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算病毒效價(jià)。病毒效價(jià)(TU/mL)=GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)/接種病毒體積。

1.5 豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒的鑒定

1.5.1 慢病毒轉(zhuǎn)染豬Leydig細(xì)胞 傳代培養(yǎng)豬Leydig細(xì)胞，按照1×105/mL將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染(pCD513B-1-NMBR)，不轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞為對(duì)照組(Control)；細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，通過(guò)觀察綠色熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。然后更換正常的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書提取豬Leydig細(xì)胞過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中NMBR基因的表達(dá)情況。根據(jù)豬NMBR基因序列(GenBank登錄號(hào)：KM058699)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)豬NMBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物序列為：上游引物：5′-TAGGCCACATGATT-GTCAC-3′，下游引物：5′-GACTTCCTTCCGCA-ACAGA-3′；以β-actin為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物：5′-CTCCATCATGAAGTGCGACGT-3′，下游引物：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCT-GTC-3′[12]。引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×AceQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR SYBR Green Master Mix 10 μL，模板cDNA 2 μL,上、下游引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 5。用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中NMBR基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0軟件中的t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行作圖。P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬NMBR CDS序列的獲得

由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，條帶大小約為1 173 bp，與豬NMBR CDS序列片段大小一致，說(shuō)明成功獲得目的片段。

1、2，豬NMBR基因克隆質(zhì)粒；M，DL2000 DNA Marker 1 and 2,Porcine NMBR gene cloning plasmids;M,DL2000 DNA Marker圖1 豬NMBR CDS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of porcine NMBR CDS sequence

2.2 慢病毒過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

將目的片段插入pMD19-T質(zhì)粒構(gòu)建pMD19-T-NMBR重組質(zhì)粒，XbaⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒被雙酶切為2條特異性條帶(圖2A)，條帶大小分別約為2 700和1 173 bp，與pMD19-T質(zhì)粒和豬NMBR CDS序列片段大小一致，表明成功構(gòu)建pMD19-T-NMBR重組質(zhì)粒，并通過(guò)膠回收獲得線性化NMBR。

將線性化pCD513B-1和NMBR連接構(gòu)建pCD513B-1-NMBR重組質(zhì)粒，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小約1 173 bp(圖2B)，與目的片段大小一致。另外，pCD513B-1-NMBR質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與豬NMBR CDS序列堿基比對(duì)結(jié)果完全一致，表明成功構(gòu)建慢病毒過(guò)表達(dá)載體pCD513B-1-NMBR。

①A，pMD19-T-NMBR重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；B，pCD513B-1-NMBR重組質(zhì)粒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。②M1，DL5000 DNA Marker；1～3，pMD19-T-NMBR重組質(zhì)粒；M2，DL2000 DNA Marker；4、5，pCD513B-1-NMBR重組質(zhì)粒 ①A,The results of double digestion of recombinant plasmid pMD19-T-NMBR;B,The results of RT-PCR detection of recombinant plasmid pCD513B-1-NMBR.②M1,DL5000 DNA Marker;1-3,pMD19-T-NMBR recombinant plasmids;M2,DL2000 DNA Marker;4 and 5,pCD513B-1-NMBR recombinant plasmids圖2 豬NMBR重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of porcine NMBR recombinant plasmid

2.3 豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒包裝和效價(jià)測(cè)定

將pCD513B-1-NMBR/pCD513B-1和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞48 h，GFP表達(dá)情況結(jié)果顯示，pCD513B-1-NMBR轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞中呈現(xiàn)大量綠色熒光(圖3B)，與pCD513B-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h觀察到的現(xiàn)象(圖3C、3D)一致，表明豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒包裝成功。由圖4可知，與陰性對(duì)照相比，病毒稀釋10倍轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)GFP細(xì)胞較多，病毒稀釋103倍后表達(dá)GFP細(xì)胞數(shù)量明顯減少，當(dāng)病毒稀釋105倍后僅有幾個(gè)細(xì)胞表達(dá)GFP。通過(guò)計(jì)算得到病毒的效價(jià)約為4×106TU/mL。

A，pCD513B-1-NMBR組細(xì)胞的明場(chǎng)圖；B，pCD513B-1-NMBR組細(xì)胞的綠色熒光圖；C，pCD513B-1組細(xì)胞的明場(chǎng)圖；D，pCD513B-1組細(xì)胞的綠色熒光圖 A,The bright field diagram of the pCD513B-1-NMBR group;B,The green fluorescence diagram of the pCD513B-1-NMBR group;C,The bright field diagram of the pCD513B-1 group;D,The green fluorescence diagram of the pCD513B-1 group圖3 豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒包裝過(guò)程中GFP的表達(dá)(400×)Fig.3 Expression of GFP during the packaging of porcine NMBR gene overexpression lentivirus (400×)

2.4 豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒的鑒定

由圖5可知，豬NMBR慢病毒轉(zhuǎn)染豬Leydig細(xì)胞48 h后80%以上細(xì)胞表達(dá)GFP，表明大部分細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染慢病毒。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，GFP表達(dá)量明顯增加。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠極顯著增加豬NMBR mRNA的表達(dá)水平(P<0.01，圖6)。

A～D，分別為10、103、105倍豬NMBR慢病毒稀釋液組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的明場(chǎng)圖；E～H，分別為10、103、105倍豬NMBR慢病毒稀釋液組和陰性對(duì)照組細(xì)胞的綠色熒光圖 A-D,The bright field diagram of 10,103，105 porcine NMBR lentivirus diluent group and negative control group,respectively;E-H,The green fluorescence diagram of 10,103，105 porcine NMBR lentivirus diluent group and negative control group,respectively圖4 倍比稀釋法測(cè)定豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒效價(jià)(400×)Fig.4 Determination of porcine NMBR gene overexpression lentivirus titer by serial dilution (400×)

A、C，分別為48和72 h組細(xì)胞的明場(chǎng)圖；B、D，分別為48和72 h組細(xì)胞的綠色熒光圖 A and C,The bright field diagram of 48 h and 72 h group,respectively;B and D,The green fluorescence diagram of 48 and 72 h group,respectively圖5 豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染Leydig細(xì)胞效果檢測(cè)(400×)Fig.5 Transfection effect of porcine Leydig cells with porcine NMBR gene overexpression lentivirus (400×)

**，差異極顯著(P<0.01) **,Significant difference (P<0.01)圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NMBR mRNA在豬Leydig細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression of NMBR mRNA in porcine Leydig cells detected by Real-time quantitative PCR

3 討 論

NMBR作為哺乳動(dòng)物蛙皮素受體家族中的一員，能夠與其配體NMB高效結(jié)合發(fā)揮多種重要的生物學(xué)作用[2-3]。NMB最初是在豬脊髓中分離的[16]，馬志禹等[12]成功克隆了豬NMBR基因，序列分析可知豬NMBR CDS序列為1 173 bp，編碼390個(gè)氨基酸。本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增成功獲得了豬NMBR基因全長(zhǎng)CDS序列，并在擴(kuò)增片段的兩端添加了不同的酶切位點(diǎn)，為后續(xù)構(gòu)建重組質(zhì)粒奠定基礎(chǔ)。隨著研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，過(guò)表達(dá)技術(shù)在基因功能研究中應(yīng)用越來(lái)越廣，但是NMBR基因過(guò)表達(dá)在豬上的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。而pCD513B-1質(zhì)粒作為第3代慢病毒過(guò)表達(dá)載體，含有強(qiáng)啟動(dòng)因子，能夠高效表達(dá)外源蛋白，具有易轉(zhuǎn)化、方便檢測(cè)(含有GFP標(biāo)簽)等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)重組成功構(gòu)建了慢病毒過(guò)表達(dá)載體pCD513B-1-NMBR，為獲得豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒提供條件。由于第3代慢病毒載體為四質(zhì)粒系統(tǒng)，所以該試驗(yàn)將重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)一起轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞包裝獲得豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒，但該慢病毒能否增加豬細(xì)胞中NMBR基因的表達(dá)需要進(jìn)一步確定。

研究發(fā)現(xiàn)，NMBR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的多個(gè)腦區(qū)(嗅球、海馬、丘腦、脊髓等)和外周組織器官的睪丸、胃腸道、食管、脂肪等多個(gè)組織中高表達(dá)[1-3]。在豬上，組織表達(dá)和分布定位研究發(fā)現(xiàn)，NMBR在睪丸中高表達(dá)，且主要存在于睪丸間質(zhì)細(xì)胞中[12]。在豬和兔上的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NMB能夠調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成和分泌、細(xì)胞增殖與凋亡[14-15]。而睪丸間質(zhì)細(xì)胞是雄性動(dòng)物睪丸生成雄激素(主要是睪酮)最重要部位[19]，在雄性生殖中發(fā)揮重要作用。在體內(nèi)，NMB通過(guò)與NMBR結(jié)合激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路發(fā)揮作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，NMBR基因過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)NMB對(duì)人子宮平滑肌細(xì)胞環(huán)氧合酶-2(COX-2)和白介素-6(IL-6)上調(diào)作用[21]。因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)NMBR基因的表達(dá)來(lái)研究NMB的生殖功能。本試驗(yàn)成功將豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染豬Leydig細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)慢病毒轉(zhuǎn)染豬Leydig細(xì)胞后能夠增加NMBR mRNA的表達(dá)，證實(shí)該載體構(gòu)建成功。因此，可以通過(guò)構(gòu)建NMBR基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型來(lái)研究NMB在豬Leydig細(xì)胞中的功能。除了Leydig細(xì)胞，也可以將豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染豬其他細(xì)胞中構(gòu)建NMBR基因過(guò)表達(dá)模型，研究NMBR基因過(guò)表達(dá)在豬其他細(xì)胞中的功能，為神經(jīng)肽在豬上的應(yīng)用和相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供條件。當(dāng)然，NMBR基因過(guò)表達(dá)是否能夠引起細(xì)胞相關(guān)功能的變化還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功將擴(kuò)增的豬NMBR CDS序列插入pCD513B-1質(zhì)粒，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCD513B-1-NMBR；成功包裝并獲得了豬NMBR基因過(guò)表達(dá)慢病毒；將慢病毒轉(zhuǎn)染豬Leydig細(xì)胞能夠顯著增加NMBR基因的表達(dá)，為后續(xù)研究NMBR基因過(guò)表達(dá)在豬Leydig細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。