王 淼，陳雪陽，王興明，梁雄燕，楊玉瑩

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)是反轉(zhuǎn)錄病毒科、α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的一員，根據(jù)病毒囊膜基因env和宿主范圍等的不同可將ALV分為11個亞群，其中A～E、J和K亞群的自然宿主是雞[1]。ALV不僅可以引起雞產(chǎn)生腫瘤性疾病，還可以引起雞出現(xiàn)亞臨床癥狀，如雞體消瘦、產(chǎn)蛋下降等，給中國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。目前市場上仍沒有出現(xiàn)針對ALV的疫苗和有效的治療藥物，主要通過撲殺陽性雞的方法來凈化雞群。禽白血病病毒K亞型(ALV-K)是自2012年新出現(xiàn)的亞型[3]，多來自于無癥狀或亞臨床癥狀的雞，其可能是由于亞群之間的自然重組[4-7]。研究表明，ALV在不同年齡、不同毒株中致病力不同，經(jīng)試驗接種后，發(fā)病情況各不相同，這與毒株、雞品種、接種途徑、劑量、雞的日齡有很大關(guān)系[8-9]。

RNA病毒在復(fù)制過程中的不穩(wěn)定性較高，其中的非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒并不經(jīng)過DNA階段復(fù)制，因此很多情況下無法應(yīng)用DNA重組技術(shù)開展病毒基因組的分析，使得研究存在很大的局限性。反向遺傳學(xué)研究是在已知DNA序列的前提下，通過核苷酸定點突變、插入或缺失等基因改造手段，獲取病毒基因組的cDNA，再借助體內(nèi)、外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)獲得具有感染性的轉(zhuǎn)錄體，通過在易感細胞內(nèi)的包裝、病毒拯救等重新獲得改造的活病毒粒子或者類似病毒物質(zhì)[10-11]，研究病毒改造后產(chǎn)生的表型效應(yīng)，進而研究相關(guān)的生物學(xué)功能，這類能夠拯救病毒的遺傳材料稱為感染性克隆。近年來，反向遺傳學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，廣泛地應(yīng)用于在體內(nèi)對病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和病毒-宿主的相互作用以及新型疫苗的研發(fā)等方面。

本試驗基于分離到的兩株致病力不同的ALV-K，通過測序分析顯示兩株病毒核酸序列差異集中在5′-端長末端重復(fù)序列(5′-LTR)，為研究病毒的致病性是否與5′-LTR相關(guān)，使用反向遺傳學(xué)技術(shù)對這兩株病毒的5′-LTR進行置換，并進行感染性克隆構(gòu)建及病毒拯救，為進一步研究ALV-K的致病性打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

感染性克隆TOPO-HB2015032-ABC[12]和TOPO-HB2018003-ABC[13]由本實驗室凍存；UMNSAH/DF-1細胞株購自中科院上海細胞庫，由本實驗室凍存。

2×F8 FastLong PCR MasterMix (PC8002)、One Step Seamless Cloning Kit(CV1901)和Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit(CV1701)均購自北京艾德萊生物科技有限公司；組織/細胞DNA提取試劑盒(GK0122)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(GK2403-50)和質(zhì)粒提取試劑盒(GK2004-50)均購自上海捷瑞生物工程有限公司；0.25%胰酶(GP3108-100ML)購自Genview公司；胎牛血清(FBS,900-108)購自Gemini公司；DMEM細胞培養(yǎng)基(C11995500BT)購自Gibco公司；禽白血病抗原P27 ELISA檢測試劑盒購自IDEXX公司;TurboFect Transfection Reagent購自賽默飛生物有限公司；FITC標記的羊抗鼠 IgG (D110105)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計及合成

參考HB2018003毒株和HB2015032毒株基因序列(GenBank登錄號：KY581580)，根據(jù)用HB2018003毒株5′-LTR替換HB2015032毒株5′-LTR和用HB2015032毒株5′-LTR替換HB2018003毒株5′-LTR的原則，分別設(shè)計擴增HB2018003株5′-LTR和除5′-LTR外的基因組，HB2015032株5′-LTR和除5′-LTR外的基因組的引物(表1)；參考GenBank已發(fā)表ALV基因序列設(shè)計ALV-A/J/K特異性鑒定引物(表1)；M13引物為Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit中所列鑒定引物(表1)。引物由武漢擎科生物有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 目的基因的PCR擴增

以質(zhì)粒TOPO-HB2015032-ABC為模板，分別以TOPO-032和032-LTR為引物PCR擴增TOPO-032和032-LTR；以質(zhì)粒TOPO-HB2018003-ABC為模板,分別以TOPO-003和003-LTR為引物擴增TOPO-003和003-LTR，4個片段均使用25 μL反應(yīng)體系：2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，質(zhì)粒模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 1 min；94 ℃變性 10 s，退火 10 s(溫度見表1)，72 ℃延伸(時間與產(chǎn)物大小相關(guān))，共33個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物并切膠回收。

1.4 感染性克隆的構(gòu)建及鑒定

使用One Step Seamless Cloning Kit將切膠回收的DNA片段TOPO-032和032-LTR、TOPO-003和003-LTR分別進行重組連接。TOPO-003-032反應(yīng)體系為2×OneStep Cloning Mix 5 μL，TOPO-032 4 μL，003-LTR 1 μL；TOPO-032-003反應(yīng)體系為2×OneStep Cloning Mix 5 μL，TOPO-003 3 μL，032-LTR 2 μL。上述反應(yīng)體系50 ℃孵育1 h后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，復(fù)蘇后均勻涂布在Amp抗性平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。

為了鑒定感染性克隆是否構(gòu)建成功，以TOPO-HB2015032-ABC為對照，M13R和003-LTR-R為引物通過PCR的方法檢測重組質(zhì)粒TOPO-003-032；以TOPO-HB2018003-ABC對照、M13F和032-LTR-R為引物檢測TOPO-032-003是否重組。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，質(zhì)粒模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min； 94 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30個循環(huán)； 72 ℃延伸5 min，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.5 病毒拯救及鑒定

將易感的DF-1細胞鋪6孔板，待生長至80%匯合度時，將鑒定和測序正確的質(zhì)粒TOPO-003-032和TOPO-032-003使用轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Reagent分別轉(zhuǎn)染鋪好的DF-1細胞，利用宿主細胞酶系統(tǒng)進行病毒的拯救。將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的DF-1細胞置于5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，加入1%血清DMEM培養(yǎng)基，72 h后收取細胞上清進行群特異性抗原P27 ELISA檢測。提取盲傳3代后DF-1細胞基因組DNA并使用ALV-A/J/K多重PCR對其進行鑒定。PCR反應(yīng)體系為：2×F8 FastLong PCR MasterMix 12.5 μL，ALV-A/J/K-F 2 μL，ALV-AR 1 μL，ALV-JR 1 μL，ALV-KR 0.5 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性 10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，使用1.0%瓊脂糖凝膠進行PCR擴增產(chǎn)物檢測。

1.6 間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定

將檢驗陽性的細胞培養(yǎng)物上清接種于DF-1細胞，在含有5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次；用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3 次；加入0.5% Triton X-100作用15 min，PBS洗滌后加入10% FBS封閉1 h，PBS洗滌3次；以本實驗室制備的抗ALV-K 抗體KM3為一抗(1 000倍稀釋)，孵育45 min，用PBS洗滌，最后加入200倍稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG，PBS洗滌后于倒置熒光顯微鏡(萊卡 DMi8)觀察。

2 結(jié) 果

2.1 目的基因擴增

PCR擴增結(jié)果顯示，TOPO-032、032-LTR、TOPO-003和003-LTR分別擴增出9 243、314、9 247和345 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

M1，DL10000 DNA Marker；1，TOPO-003；M2，DL2000 DNA Marker；2，032-LTR；3，TOPO-032；4，003-LTR圖1 目的基因擴增Fig.1 Objective gene amplification

2.2 重組感染性克隆PCR鑒定

通過PCR對構(gòu)建的重組質(zhì)粒TOPO-003-032和TOPO-032-003進行鑒定，結(jié)果顯示以TOPO-003-032質(zhì)粒為模板的擴增出417 bp大小的條帶，而以TOPO-HB2015032-ABC質(zhì)粒為模板未見任何條帶，表明已重組(圖2A)；以TOPO-032-003質(zhì)粒為模板的擴增出369 bp大小的條帶，而以TOPO-HB2018003-ABC質(zhì)粒為模板未見任何條帶，表明已重組(圖2B)。

M，DL2000 DNA Marker；1，TOPO-003-032；2，TOPO-HB2015032-ABC；3，TOPO-032-003；4，TOPO-HB2018003-ABC圖2 重組感染性克隆TOPO-003-032(A)和TOPO-032-003(B)的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant infectious clones TOPO-003-032 (A) and TOPO-032-003 (B)

2.3 病毒拯救及鑒定

提取轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒TOPO-003-032和TOPO-032-003并盲傳3代的DF-1細胞基因組DNA，應(yīng)用ALV-A/J/K多重PCR鑒定，結(jié)果顯示均在535 bp(ALV-K)處出現(xiàn)預(yù)期條帶，未出現(xiàn)715(ALV-A)和430 bp(ALV-J)條帶(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1，ALV-A/J/K陽性對照；2，陰性對照；3，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒TOPO-003-032的DF-1細胞；4，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒TOPO-032-003的DF-1細胞 M，DL2000 DNA Marker；1，ALV-A/J/K positive control；2，Negative control；3，DF-1 cells transfected with recombinant plasmid TOPO-003-032；4，DF-1 cells transfected with recombinant plasmid TOPO-032-003圖3 ALV-A/J/K多重PCR鑒定Fig.3 Mulit PCR identification of ALV-A/J/K

2.4 間接免疫熒光試驗鑒定

以本實驗室制備的抗ALV-K單抗KM3為一抗孵育接種了拯救的兩株病毒的DF-1細胞出現(xiàn)明顯的亮綠熒光，陰性對照則沒有出現(xiàn)熒光(圖4)。結(jié)果表明成功拯救出病毒，并分別將拯救的病毒命名為rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。

A，rHB2022050(TOPO-032-003)；B、D，陰性對照；C，rHB2022051(TOPO-003-032) A，rHB2022050(TOPO-032-003)；B and D，Negative control；C，rHB2022051(TOPO-003-032)圖4 間接免疫熒光試驗(200×)Fig.4 Indirect immunofluorescence assay (200×)

3 討 論

ALV可引起禽類免疫抑制病，生長緩慢，同時也可以引起多器官腫瘤，導(dǎo)致死亡，與馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥并稱禽類三大腫瘤性疾病，ALV感染后可導(dǎo)致髓細胞瘤、淋巴細胞瘤、成紅細胞瘤等[14]。2012年，自王鑫等[3]發(fā)現(xiàn)ALV-K后，在中國其他地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該毒株，海外地區(qū)如日本等也有相關(guān)報道[5-7,15-16]。由于ALV-K多在無臨床癥狀或者亞臨床癥狀的雞群中分離，且該亞群病毒致病力和病毒復(fù)制能力等較弱，在實際生產(chǎn)中極易被忽視。中國科學(xué)院國家基因研究中心(NCGR)對ALV-K進行監(jiān)測和分離，發(fā)現(xiàn)ALV-K的分離率逐漸上升，且新分離的毒株復(fù)制能力明顯增強，對新的ALV-K分離株進行序列分析等發(fā)現(xiàn)，pol基因存在單核苷酸缺失，導(dǎo)致病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶活性、病毒復(fù)制能力和垂直傳播水平等都有顯著提高[17]。在病毒復(fù)制過程中突變時發(fā)生，只有能夠幫助病毒獲得新功能或競爭優(yōu)勢的突變才能穩(wěn)定保留下來。ALV-J在5′-端非編碼區(qū)插入19個堿基可以提高其在DF-1細胞中的復(fù)制能力[18]，而在3′-端非編碼區(qū)缺失會使其致瘤性和致死率急劇上升[19]，說明病毒基因組在進化過程中保留的突變會帶來生物學(xué)特性極大的變化。ALV-K可能成為繼J亞群禽白血病病毒之后成為中國養(yǎng)雞業(yè)新的重大潛在威脅[6,20]。

ALV屬于RNA病毒，病毒在復(fù)制過程中極容易發(fā)生突變，而反向遺傳學(xué)技術(shù)是研究病毒分子特性的重要工具，可以獲得較為穩(wěn)定且遺傳背景清晰的病毒[21]。HB2015032為致瘤型ALV-K[22]，而HB2018003自然病例在剖檢等研究過程中未發(fā)現(xiàn)明顯的病變。通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)HB2018003和HB2015032兩株病毒的核苷酸同源性約為94.7%，且變異的區(qū)域主要集中在5′-LTR[23]。為驗證這種致瘤性的差異是否是由這種集中在5′-LTR區(qū)域的變異引起的，因此將兩株病毒的5′-LTR區(qū)進行互換后重組，以本實驗室前期構(gòu)建的HB2018003和HB2015032的感染性克隆為模板，使用PCR擴增相關(guān)的基因并進行同源重組，成功構(gòu)建出5′-LTR相互置換的兩株ALV-K。酶切法是構(gòu)建感染性克隆的經(jīng)典方法，應(yīng)用廣泛，但病毒基因組中可能需要插入相關(guān)的分子標記，此過程中可能會出現(xiàn)移碼、突變等問題。在設(shè)計引物的過程中添加20 bp左右病毒基因組作為同源臂從而避免引入外源酶切位點的問題。同源重組法可同時將2條或以上的片段一次性連接，并且操作相對簡單快捷，陽性率高，從而減少浪費大量時間。兩株重組病毒的構(gòu)建為后續(xù)研究ALV-K相關(guān)的生物學(xué)特性、致病性等方面提供材料，同時也為進一步了解ALV的進化和發(fā)展提供了一定的參考。

4 結(jié) 論

本研究以兩株ALV-K(HB2015012和HB2018003)為親本株采用同源重組的方法構(gòu)建了5′-LTR互換的感染性克隆TOPO-003-032和TOPO-032-003，并成功拯救出病毒rHB2022050(TOPO-032-003)和rHB2022051(TOPO-003-032)。