卜 瑩，鄭 楠，王加啟，趙圣國

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

動物胃腸道直接與外界相通，被視為抵御外界病原體的一道重要屏障，因此，動物機體健康與胃腸道健康緊密相關。健康動物可以產(chǎn)出更高質(zhì)量的動物產(chǎn)品，為畜牧生產(chǎn)帶來更高的經(jīng)濟效益。胃腸道健康水平可反映動物機體的健康程度，微生物的功能和種類組成影響著胃腸道的穩(wěn)態(tài)平衡。微生物群通過定植在胃腸道黏膜，在黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)育中起著至關重要的作用，且對宿主的免疫和健康水平也起著重要作用[1]。反芻動物的胃腸道微生物通過發(fā)酵作用產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)和微生物蛋白(microbial proteins,MCPs)[2]，為機體提供優(yōu)質(zhì)氮源和能量，其中能量供應占機體需求的70%[3]。

目前，對胃腸道內(nèi)微生物群落調(diào)控的方式有很多種，如益生菌(乳酸菌類、芽孢桿菌類、酵母類等)和益生元(低聚果糖、纖維素、果膠等)。益生菌制劑作為一種飼料添加劑，常被用于改善腸道微生態(tài)平衡[4]。此外，益生菌代謝產(chǎn)生的過氧化氫和細菌素等也可抑制潛在的病原菌[5]。但由于胃腸道菌群組成的不確定性以及胃腸道內(nèi)外環(huán)境不穩(wěn)定性等原因，使其推廣應用受到一定的限制。因此，需要一種方法去調(diào)控動物胃腸道微生物，從而調(diào)控胃腸道功能和健康，且該方法需對動物機體的正面影響最小化和高效化。

免疫調(diào)節(jié)是一種高效且相對安全的調(diào)節(jié)方式。免疫球蛋白進入胃腸道內(nèi)能夠對相應的病原或細菌起到抑制作用[6]。近年來，免疫球蛋白常被用于調(diào)控動物機體健康、胃腸道功能代謝，以及維護胃腸道健康。作者就現(xiàn)階段免疫球蛋白對胃腸道功能調(diào)節(jié)的研究進展進行綜述，以期為應用免疫球蛋白調(diào)控動物胃腸道健康和促進營養(yǎng)代謝提供指導。

1 免疫球蛋白種類和性質(zhì)

動物體內(nèi)的免疫球蛋白根據(jù)理化性質(zhì)和生物學功能可以分為多種，主要有IgG、IgM、IgE、IgA、IgY及納米抗體(VHH)等，由于IgM產(chǎn)量少、失效短，IgE含量極低，不易測得，因此對這2種免疫球蛋白沒有進行介紹，主要介紹了以下4種，其結構圖見圖1。

1.1 IgG

IgG的分子質(zhì)量為150 ku，具有較長的血清半衰期，因此在免疫球蛋白介導的防御機制中起著重要的作用[7]。IgG在免疫反應中起直接作用，主要由脾臟和淋巴結中的漿細胞產(chǎn)生，IgG免疫性高，在體內(nèi)廣泛分布，其被巨噬細胞吞噬后具有中和抗原的功能[8]。人IgG分為4個亞類，分別為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；牛IgG主要有2個亞類，分別為IgG1和IgG2。

1.2 IgA

IgA主要分布于黏膜表面，如呼吸道、泌尿道、腸道、乳腺和皮膚[9]。IgA的分子質(zhì)量為160 ku，存在2個亞類：IgA1和IgA2，前者是在血清中發(fā)現(xiàn)的主要亞類，后者在分泌物中的含量高于血清。IgA在黏膜表面起保護作用，一般血清中IgA濃度低于IgG濃度。分泌性IgA(sIgA)通過中和作用或阻止黏膜表面附著來保護黏膜表面免受細菌、病毒和毒素侵害[10]。sIgA是由2個IgA單體(每個單體含2條輕鏈和2條重鏈)、1條J鏈和1條分泌片構成的異源十聚體，是唾液中的重要成分，占總免疫球蛋白的85%以上[11]，西門塔爾牛唾液IgA濃度約為0.56 mg/mL[12]。

1.3 IgY

IgY的分子質(zhì)量為180 ku，由2條重鏈(H)和1條輕鏈(L)組成。IgY在被動免疫中起重要作用，是在禽類中發(fā)現(xiàn)的主要免疫球蛋白，卵黃中含有大量IgY (8～25 mg/mL)，IgY與IgG有相似的生物功能[13]。IgY被廣泛應用于免疫檢測、免疫組化、診斷等領域[14]，被認為是一種很有前途的調(diào)節(jié)微生物群的工具[15]。

1.4 VHH

VHH是一種存在于駱駝科及鯊魚科動物外周血液且天然缺失輕鏈的免疫球蛋白，分子質(zhì)量為15 ku，該抗體只含有1個重鏈可變區(qū)和2個常規(guī)的CH2和CH3區(qū)，與常規(guī)免疫球蛋白相比，相當于典型免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)[16]。VHH是目前已知的可結合目標抗原的最小單位，晶體長4.8 nm，寬2.5 nm[17]，具有穩(wěn)定性好、開發(fā)周期短、特異性強、親和力高等特點，常用于醫(yī)療研究，如疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過構建VHH基因庫，從而篩選出含目的基因的VHH，再利用該VHH代替之前的傳統(tǒng)免疫球蛋白，對疫苗的研發(fā)和動物疾病的防御具有重要作用[18]。

圖1 IgY(A)、IgG(B)、sIgA(C)及納米抗體(D)的結構圖[19-21]Fig.1 Structure of IgY(A),IgG(B),sIgA(C) and nanobodies(D)[19-21]

2 免疫球蛋白調(diào)控瘤胃微生物功能代謝

2.1 抑制甲烷排放

瘤胃內(nèi)的微生物菌群代謝時會產(chǎn)生氣體，如甲烷、CO2等，其中甲烷是反芻動物正常消化代謝的產(chǎn)物，由瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌利用產(chǎn)生的CO2和H2生成。反芻動物瘤胃內(nèi)甲烷的排放是一種能量損失，同時也增強了大氣的溫室效應。因此，減少瘤胃內(nèi)甲烷的生成對提高飼料能量利用率和碳減排具有重要意義[22]。瘤胃產(chǎn)甲烷菌在甲烷桿菌目中分為3個主要屬：甲烷短桿菌屬、甲烷菌屬和甲烷菌屬。甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)是瘤胃的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌屬，用16S rRNA對瘤胃樣本進行測序，結果表明有超過50%的基因序列都來自于甲烷短桿菌[23]。人們通過給動物接種特異性甲烷菌疫苗，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，使得產(chǎn)甲烷菌的功能與其產(chǎn)生甲烷的能力受到限制。Zhang等[24]利用產(chǎn)甲烷短桿菌M1膜蛋白EhaF制備疫苗免疫山羊，結果表明，疫苗接種組血清和唾液滴度為320 000和440，顯著高于對照組，且瘤胃液IgG滴度與對照組相比顯著提高了5倍，對照組和接種組平均甲烷排放量分別為13.5和14.3 g/kg DM，雖然未降低甲烷產(chǎn)量，但抗體滴度顯著增加。Williams等[25]利用5種產(chǎn)甲烷菌混合配制成疫苗給綿羊皮下免疫，結果表明，綿羊血漿、唾液中IgG滴度增加，瘤胃中甲烷菌多樣性顯著增加，可能是該疫苗改變了甲烷菌群組成，但未顯著減少甲烷生成量。Wright等[26]測試2種不同疫苗佐劑對甲烷減排效果，經(jīng)皮下免疫注射，結果表明，IgG含量升高4～9倍，綿羊的甲烷排放量減少7.7%，IgG對甲烷排放量起到了抑制作用。Cook等[27]制備抗甲烷菌IgY免疫母雞進行2個體外瘤胃試驗，結果表明，在12 h時降低了甲烷產(chǎn)量，24 h時平均甲烷產(chǎn)量為27.03 mg/g DM，所有處理組甲烷水平均與對照組相似，證明IgY可以短暫減少產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生的甲烷，抗體對甲烷產(chǎn)生的抑制瞬時作用可能是由瘤胃液中抗體的不穩(wěn)定性或不受施用抗體活性影響的產(chǎn)甲烷菌存在引起的。由于瘤胃微生物菌群的復雜性和產(chǎn)甲烷菌的多樣性，抗原選擇上應具有廣譜性，目前大量甲烷菌還未被培養(yǎng)，抗原信息還有限，所以需要利用基因組或宏基因組篩選抗原靶點，制備出更廣譜的疫苗去針對特異性產(chǎn)甲烷菌，抑制甲烷產(chǎn)量。

2.2 減緩尿素分解

通過在飼料中添加尿素給反芻動物提供非蛋白氮來源，可以替代飼糧中的部分蛋白質(zhì)飼料。從飼料或血液循環(huán)到瘤胃的尿素被脲酶水解為氨，并被用于合成微生物蛋白，節(jié)約豆粕用量。脲酶活性偏高，導致尿素在瘤胃內(nèi)分解速度較快，氨的產(chǎn)生速度是同化速度的4倍，使得氨被吸收入血液，大部分被排出體外。當血液中氨濃度在2 mg/100 mL以上時會引起氨中毒；而當血液中氨濃度為5 mg/100 mL時會引起動物中毒死亡[28]。研究者通過開發(fā)和研究不同的脲酶抑制劑來減少瘤胃內(nèi)氨的生成，但其功效會隨著時間延長而降低，同時部分抑制劑也會殘留在動物體內(nèi)，對其健康及生殖性能造成危害。因此，目前通過免疫的方法對瘤胃脲酶進行調(diào)控，以減緩尿素在瘤胃內(nèi)水解，從而節(jié)約蛋白質(zhì)飼料成本。脲酶由2～3個結構亞基組成，亞基UreC包含1個尿素結合位點和1個催化位點。Zhao等[29]通過基因工程的方法來抑制奶牛瘤胃內(nèi)尿素的分解，表達制備幽門螺桿菌脲酶作為抗原，加入弗氏佐劑后免疫奶牛，結果發(fā)現(xiàn)對奶牛的健康、產(chǎn)奶量等均無明顯影響，但接種疫苗的奶牛從第7天開始血清IgG和IgA滴度顯著高于對照組，而唾液IgG和IgA滴度分別從第7和21天開始顯著高于對照組，在第49天(第3次免疫后2周)免疫組的脲酶活性比對照組低17%，說明抗脲酶的特異性抗體可以降低脲酶活性。Marini等[30]以刀豆脲酶作為抗原免疫調(diào)控瘤胃中脲酶活性，結果表明，經(jīng)刀豆脲酶免疫后，奶牛血清內(nèi)免疫球蛋白濃度顯著升高，但細菌脲酶活性沒有降低，也沒有改變尿素代謝。表明相比較于植物脲酶，細菌脲酶與瘤胃細菌脲酶的親緣關系更近，所產(chǎn)生的免疫球蛋白對瘤胃脲酶活性調(diào)控效果更佳。因此，需要表達出特異性細菌脲酶產(chǎn)生更近的親緣關系，可以更高效地調(diào)控脲酶，從而減緩瘤胃內(nèi)尿素分解。

2.3 減少原蟲數(shù)量

反芻動物瘤胃原蟲與氮等營養(yǎng)素代謝密切相關。瘤胃內(nèi)原蟲不能利用氨態(tài)氮(NH3-N)合成自身蛋白質(zhì)，只能利用微生物或飼料中的蛋白質(zhì)作為主要氮源，推測減少瘤胃原蟲數(shù)量可能有利于提高瘤胃氮利用率。因此，研究者通過免疫球蛋白調(diào)控瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量，穩(wěn)定瘤胃內(nèi)氮的產(chǎn)量。Williams等[31]利用綿羊瘤胃的內(nèi)纖毛蟲作為抗原制備疫苗免疫綿羊，結果表明，接種后的綿羊IgG滴度比對照組升高了5倍，瘤胃內(nèi)原蟲特異性滴度升高了3倍，但瘤胃內(nèi)纖毛蟲數(shù)目并沒有減少；進一步將過量特異性抗體注入瘤胃內(nèi)，使過量的抗體在瘤胃內(nèi)停留時間延長，從而使原蟲和抗體充分結合，結果表明原蟲數(shù)量顯著降低[32]。苑文珠等[33]研究發(fā)現(xiàn)，原蟲是瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷微生物之一，驅除瘤胃原蟲后，瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)量減少。Leahy等[34]利用產(chǎn)甲烷菌的基因組序列及一些小分子的抑制劑作為免疫球蛋白，用產(chǎn)甲烷菌制備疫苗，發(fā)現(xiàn)其可以對產(chǎn)甲烷菌的功能起到一定作用，顯著減少了甲烷產(chǎn)量，說明纖毛蟲抗原與抗體特異性結合的程度越高，對其數(shù)量的影響越顯著。因此，目前需要基于基因組序列去篩選以識別編碼具有良好疫苗靶標屬性蛋白質(zhì)的基因來確定原蟲疫苗靶點，從而進一步調(diào)控原蟲數(shù)量。

2.4 減緩淀粉分解

為了追求高質(zhì)量的畜產(chǎn)品，飼養(yǎng)反芻動物時往往會飼喂一些高淀粉含量的精料。淀粉分解菌主要是靠消化胃腸道內(nèi)的淀粉而生長繁殖[35]，但通常情況下瘤胃內(nèi)pH為6.5～7.5。當大量攝入淀粉后，瘤胃內(nèi)會大量積累乳酸，使得pH迅速下降，當pH低于5.5時，就會發(fā)生酸中毒[36]。Dennis等[37]通過在飼糧中添加抗生素來降低淀粉的分解率，但抗生素的使用存在著很多的弊端，如藥物殘留等。牛鏈球菌是淀粉分解菌屬中的一種，會在胃腸內(nèi)產(chǎn)生大量乳酸。Gill等[38]利用牛鏈球菌作為抗原去免疫綿羊，結果表明，免疫組動物瘤胃pH顯著升高，瘤胃內(nèi)乳酸濃度顯著降低，免疫后血清和唾液中免疫球蛋白水平均顯著升高。Mizuguchi等[39]利用抗脂多糖(lipoolysaccharide,LPS)免疫球蛋白，研究免疫球蛋白中和LPS的作用，結果表明，抗LPS免疫球蛋白可以減緩瘤胃LPS釋放和pH降低。Shu等[40]以肉牛為試驗動物，以牛鏈球菌和乳酸桿菌作為抗原制備疫苗，經(jīng)免疫后動物瘤胃內(nèi)乳酸濃度顯著降低，且酶鏈免疫結果表明，IgG滴度升高。因此，免疫球蛋白可用于調(diào)控瘤胃內(nèi)的乳酸濃度。

3 免疫球蛋白維護動物胃腸道健康

胃腸道內(nèi)致病菌會使家畜感染或菌群失調(diào)，從而導致腹瀉，主要致病菌和病毒有輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒及大腸桿菌。

3.1 輪狀病毒

輪狀病毒(Rotavirus,RVA)是胃腸內(nèi)存在的一種致病畜腹瀉的病毒，RVA對外界環(huán)境的抵抗力較強，在18～20 ℃的糞便和乳汁中能存活7～9個月，因而其在家畜和幼畜之間容易反復循環(huán)感染[41]。研究者早期通過給幼畜飼喂初乳的方法來增強免疫活性，降低RVA感染率，之后相繼開發(fā)出一些疫苗來抵御該病毒。Odagiri等[42]用2個不同基因型的RVA從免疫母雞中獲取IgY來制備抗RVA免疫球蛋白，通過肌肉注射方式去探究其是否可以保護犢牛免受RVA的影響，結果表明，免疫后IgY濃度升高，2種抗原的IgY濃度分別為40.1和53.4 mg/mL，而對照組IgY濃度為30.3 mg/mL。Vega等[43]給荷斯坦牛口服滅活RVA后發(fā)現(xiàn)，添加IgY組顯著減少了糞便中RVA檢出時間，從11.6 d下降到4.5 d，同時減少了試驗動物腹瀉持續(xù)期，從7.2 d下降到3.2 d。因此，IgY對家畜抵御RVA表現(xiàn)出正面影響。

3.2 牛病毒性腹瀉病毒

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)也是一種致使病畜腹瀉的病毒之一，屬于黃病毒科瘟病毒屬[44]。目前已有針對BVDV的疫苗，其核心是BVDV結構蛋白E2與單鏈免疫球蛋白APCH的融合，統(tǒng)稱為APCH-E2。免疫球蛋白APCH將E2抗原靶向存在于抗原呈遞細胞上的主要組織相容性Ⅱ型分子(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)，該疫苗的優(yōu)點是可以在牛身上快速誘導并產(chǎn)生持續(xù)的中和免疫球蛋白反應[45]。Duan等[46]利用BVDV的非結構蛋白5 (nonstructural protein 5A,NS5B)，通過從納米基因庫中分離出NS5B特異性納米體，進一步建立穩(wěn)定表達的細胞株，探討其抗病毒活性，結果表明，免疫后雙峰駱駝的抗血清滴度增加到1∶128 000，隨機選取50個克隆進行測序分析，每個克隆包含1個明顯的VHH序列，該納米庫多樣性高，說明VHH對抵御BVDV起到了正面的作用。

3.3 致病性大腸桿菌

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)也是致使腹瀉的致病菌之一，隨著動物患病率越來越高，對大腸桿菌的免疫方法越來越受到人們的重視。根據(jù)大腸桿菌的致病特性不同，可分為4～5類，如腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasiveEscherichiacoli,EIEC)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)等[47-48]。Alustiza等[49]探討給仔豬飼喂1 011 CFU/mL IgY對ETEC的影響，結果表明，飼喂IgY組沒有出現(xiàn)腹瀉等癥狀，但未飼喂組在第4天中性粒細胞及白細胞數(shù)量顯著增加，胃腸道可能被ETEC感染。Virdi等[50]將羊駝抗ETEC重鏈免疫球蛋白的可變結構域與豬免疫球蛋白(IgG或IgA)的Fc部分融合，設計出抗ETEC免疫球蛋白，并在擬南芥種子中表達，通過這種方法產(chǎn)生了4個VHH-IgG和4個VHH-IgA，分別約為種子重量的3.0%和0.2%；對所有產(chǎn)生免疫球蛋白的種子提取物的體外分析表明，它們對細菌與豬腸道絨毛腸細胞的結合具有抑制作用，然而在仔豬飼糧試驗中發(fā)現(xiàn)，只有添加VHH-IgA的仔豬被保護，且ETEC數(shù)量逐漸減少，起到了積極免疫作用，證實了該免疫球蛋白可以抑制ETEC病原體的數(shù)目。Chin-Fatt等[51]用1個單一結構域VHH和1個免疫球蛋白的可結晶片段(Fc)融合而成嵌合融合蛋白，構建了一組本氏煙葉片轉化的內(nèi)部表達載體，通過分泌(Sec)或雙精氨酸易位(Tat)途徑將VHH-Fc靶向到該葉片的類囊體腔，對從Sec、Tat和基質(zhì)途徑純化的VHH-Fc的體外免疫熒光標記分析表明，該免疫球蛋白在結合大腸桿菌O157∶H7時仍然保留VHH功能，蛋白含量從50.24 mg/kg FW增加到110.90 mg/kg FW，證實了其在中和大腸桿菌O157∶H7對胃腸道上皮細胞的黏附方面具有重要作用，從而調(diào)控大腸桿菌的功能。

4 免疫球蛋白的應用方式

4.1 疫苗免疫

疫苗作為一種主動免疫方式，較其他免疫方法相對安全，成本低，方便制備。在畜牧業(yè)領域，各類病毒也有相關的疫苗已成功研發(fā)，目前被廣泛應用的疫苗主要有口蹄疫病毒疫苗、豬瘟疫苗等，但還有很多新的疫苗等待人們?nèi)パ邪l(fā)制備。F4是一種主要抗原，在感染的早期階段起著重要的作用。Faribrother等[52]以表達F4的非致病性大腸桿菌為載體研制了一種口服活疫苗，對豬的產(chǎn)后斷奶腹瀉(postpartum weaning diarrhea,PWD)免疫效果進行了評定，結果發(fā)現(xiàn)，接種疫苗后7和21 d，中度到重度腹瀉、F4-ETEC回腸定植和F4-ETEC糞便排泄的發(fā)生率顯著降低，且疫苗接種后3 d，F(xiàn)4-ETEC的腹瀉和排便的嚴重程度和持續(xù)時間降低，該抗原的特異性免疫功能得到證實。Buddle等[53]通過基因組來篩選用于識別合成甲烷的微生物蛋白，這些蛋白可用于開發(fā)抗血清和廣譜疫苗。Wedlock等[54]已研制出針對特定的產(chǎn)甲烷菌的疫苗。但是疫苗免疫也存在一定的弊端，如存在抗原損害可能性，免疫維持時間短，需要進行多次注射，疫苗的接種時間較長。因此，開發(fā)出新的更高效價疫苗已成為一個必然趨勢，而且隨著新冠肺炎疫情的暴發(fā)，在疫情的控制方面都離不開疫苗的開發(fā)與研究[55]。

4.2 飼糧飼喂

通過提取免疫球蛋白添加到飼料中，不僅避免了抗生素殘留等問題，同時可用于動物疾病的防疫。Vandeputte等[56]在家禽飼料中添加含抗空腸彎曲桿菌的IgY免疫球蛋白，結果表明，添加IgY免疫球蛋白后IgY滴度顯著提高(1∶32 768～1∶65 536)，免疫組有效降低了空腸彎曲桿菌的定植率，推測添加該抗體于飼料中可降低家禽的致病率。豬流行性腹瀉病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種高度傳染性的豬腸道病原體，該病毒對仔豬的致死率較高[57]。崔煥忠等[58]給仔豬飼喂抗PEDV抗體，結果表明，飼喂IgY 5 d后治愈率達100%，未口服組全部死亡。Lee等[59]制備了抗PEDV和抗PEDV S1蛋白的IgY免疫球蛋白，并研究了其對新生仔豬的免疫預防作用，結果表明，排泄物中病毒的滴度分別下降了42.6%和29.6%，說明口服抗PEDV和S1 IgY能有效降低新生仔豬免受PEDV感染的風險。

5 展 望

免疫球蛋白在調(diào)控瘤胃微生物功能代謝如抑制甲烷排放和尿素分解等方面研究較多，但由于瘤胃微生物菌群的復雜性和多樣性，抗原選擇上應具有廣譜性，所以仍需利用基因組或宏基因組篩選抗原靶點，制備出更廣譜的疫苗去針對特異性菌。在維護動物胃腸道方面，目前已有特異性免疫球蛋白去針對特異性疾病，但仍存在一些問題需要去改進和完善：①如何提高免疫球蛋白在機體內(nèi)水平；②如何減少免疫球蛋白的生產(chǎn)成本；③抗體如何發(fā)揮作用。以上問題將為人們進一步探討免疫球蛋白調(diào)控胃腸道微生物功能提供參考，從而為更高效的飼料營養(yǎng)設計和動物疫苗免疫提供新思路。