魏佳榮，張貝貝，馬騰壑，2，李夢霄，李雪男，王 斌，付冠華，王紅娜，劉 超

(1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，邯鄲 056038；2.河北工程大學醫(yī)學院，邯鄲 056038；3.河北天凱食品有限責任公司，邢臺 054100)

B型細胞周期蛋白(cyclin B,CCNB)是細胞周期蛋白家族成員之一，主要分布于細胞質內，CCNB在細胞分裂進程中發(fā)揮重要的信號轉導作用[1]。到目前為止，在家禽上總共發(fā)現(xiàn)了3種CCNB，即CCNB1、CCNB2和CCNB3，分別由CCNB1、CCNB2和CCNB3基因編碼[2-3]。研究證明，CCNB在細胞中的積累與降解會影響細胞周期激酶(cyclin-dependent kinases，CDK1)的激活與失活，從而影響卵母細胞的減數分裂恢復[4-5]。CCNB作為CDK1激活的重要結合因子，可緩解由于DNA損傷導致的G2/M阻滯，從而恢復CDK1部分功能，減少因細胞缺陷引起的病變[6]。CCNB2調控細胞的增殖和分化[7-8]。Wu等[9]研究結果顯示，CCNB2在G1期合成，隨后表達量驟降，其缺陷會使G2/M檢查點失效進而導致細胞的劇烈增殖。Luo等[10]在小鼠上的試驗證明，CCNB2在卵母細胞分裂前期表達量上升，到后期急速下降，推測CCNB2基因表達量的差異會影響卵母細胞的正常增殖。張璐瑩[11]在黃當歸醇抑制腫瘤細胞增殖試驗中檢測到CCNB2基因的表達出現(xiàn)顯著上升，使得細胞的增殖與遷移加快?？傊?，CCNB2是細胞分裂增殖過程中的一個細胞周期調節(jié)因子，是G2/M過渡時的一個催化要素[12]。已有研究表明，CCNB2基因對家畜卵母細胞的成熟具有關鍵作用[13-14]，但其在家禽上的表達規(guī)律及其在卵泡成熟過程的功能鮮見報道。

選擇性剪接(alternative splicing,AS)是通過不同的剪接方法和剪接位點從單個前體mRNA產生不同成熟mRNA剪接異構體的過程[15]。AS事件通常被分為五大類：外顯子跳過、5′-端可變剪接、3′-端可變剪接、互斥外顯子和內含子保留[16]，Pandey等[17]研究了12種不同的后生動物基因組中不同類型剪接體事件的程度，結果表明外顯子跳過事件在脊椎動物中更普遍，而內含子保留事件在無脊椎動物中更豐富。細胞周期蛋白表達過程中廣泛存在選擇性剪接現(xiàn)象，本研究以河北省地方雞品種太行雞為試驗動物，克隆鑒定分析CCNB2基因不同剪接異構體，研究其在雞卵泡不同發(fā)育時期中的表達模式，為進一步探討該基因不同剪接異構體的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 太行雞來自河北天凱食品有限責任公司太行雞育種基地。取5只飼養(yǎng)條件相同、體重相近的43周齡健康太行雞母雞，頸靜脈放血處死，打開腹腔，立即取出卵巢，取不同發(fā)育時期卵泡，包括小白卵泡(small white follicle,SWF)、大白卵泡(large white follicle,LWF)、小黃卵泡(small yellow follicle,SYF)、大黃卵泡(large yellow follicle,LYF)以及F6～F1等級卵泡。液氮快速凍存，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及儀器 EASY spin Plus RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit、熒光定量PCR試劑盒和常規(guī)PCR試劑均購自江蘇諾唯贊生物科技股份有限公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

實時熒光定量PCR儀購自德國耶拿分析儀器股份公司；普通PCR儀購自上海研福生物科技中心；高速離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；超低溫冰箱、低溫冰箱均購自青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；恒溫培養(yǎng)箱購自上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平購自奧豪斯(常州)有限公司；高溫鼓風干燥箱購自上海藍豹試驗設備有限公司；小型振蕩器購自北京銘成基業(yè)科技有限公司。

1.2 引物設計與合成

根據原雞CCNB2基因序列(GenBank登錄號：XM_015278893.2和XM_015278892.2)，利用Primer Premier 5.0軟件按照圖1設計CCNB2基因剪接異構體鑒定引物，引物序列為：CCNB2-F：5′-AAGATGAAAAGCAGTGGGA-3′；CCNB2-R：5′ -AAGACAGAGGACAGGGATAC-3′。引物由蘇州金唯智股份有限公司合成。

圖1 CCNB2剪接異構體鑒定模式圖Fig.1 Schematic diagram of CCNB2 splice isoforms identification

1.3 太行雞CCNB2基因剪接異構體克隆鑒定

按照EASY spin Plus RNA快速提取試劑盒說明提取太行雞小黃卵泡總RNA。利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈，利用特異性PCR引物擴增CCNB2基因。PCR反應體系20 μL：2×TaqPlus MasterMix Ⅱ 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共33個循環(huán)；72 ℃再延伸2 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，連接至pMD19-T載體，連接體系為Solution Ⅰ 2 μL，pMD19-T載體1 μL，目的片段2 μL。在常溫條件下連接10 h，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并在含有氨芐的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單克隆后，在含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，經菌液PCR鑒定后送金唯智生物科技有限公司測序。

1.4 相似性比對及系統(tǒng)進化樹構建

利用Seqman Edit軟件拼接CCNB2基因完整開放閱讀框(ORF)。利用DNAMAN軟件對3種剪接異構體核苷酸序列進行比對，利用Mega 6.0軟件進行不同剪接異構體氨基酸序列的相似性分析并構建系統(tǒng)進化樹。原雞(登錄號：XP_015134378.3)、艾草榛雞(登錄號：XP_042680513.1)、雉雞(登錄號：XP_031472340.1)、紅松雞(登錄號：XP_042731524.1)、吐綬雞(登錄號：XP_003209452.1)、鵪鶉(登錄號：XP_015727897.1)、盜珠雞(登錄號：XP_021263444.1)、紅鴨(登錄號：XP_035192130.1)、雀鵝(登錄號：NXI68343.1)、鬃林鴨(登錄號：XP_ NXK48899.1)、云斑林鶉(登錄號：NXJ11666.1)、豬(登錄號：NP_001107754.1)、牛(登錄號：NP_776689.2)、馬(登錄號：XP_023472342.1)、羊(登錄號：XP_004010609.1)和小鼠(登錄號：CAJ18494.1)CCNB2基因氨基酸序列來源于GenBank數據庫。

1.5 不同剪接異構體的亞細胞定位及二級結構預測

1.5.1CCNB2基因剪接異構體蛋白的亞細胞定位預測 利用在線服務器PSORT WWW Server中的PSORTⅡ Prediction(http:∥psort.hgc.jp/form.html)程序進行CCNB2基因不同剪接異構體蛋白的亞細胞定位預測。

1.5.2CCNB2蛋白二級結構預測 利用在線軟件NPS@:Network Protein Sequence Analysis(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對太行雞CCNB2基因不同剪接異構體的蛋白二級結構進行預測分析。

1.6 太行雞CCNB2基因剪接異構體在卵巢和不同發(fā)育時期卵泡的表達規(guī)律

利用實時熒光定量PCR檢測3種剪接異構體在卵巢和不同發(fā)育時期卵泡(SWF、LWF、SYF、LYF以及F6～F1等級卵泡)中的相對表達量。采用Primer Premier 5.0軟件根據雞CCNB2基因序列(GenBank登錄號:XM_015278893.2)設計太行雞CCNB2基因實時熒光定量PCR引物序列，以GAPDH基因作為內參(表1)，引物均由蘇州金唯智股份有限公司合成。按照EASY spin Plus RNA快速提取試劑盒說明提取太行雞各組織總RNA，利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit將不同組織的總RNA進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。PCR反應體系20 μL：2×TaqPlus MasterMix Ⅱ 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個樣品3個重復。利用2-△△Ct法來計算基因相對表達量，以卵巢組織中的表達量為對照。

表1 太行雞CCNB2基因實時熒光定量PCR引物信息Table 1 Real-time quantitative PCR primer information of CCNB2 gene in Taihang chickens

1.7 數據統(tǒng)計分析

用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析模型進行數據分析，Duncan氏法進行組間差異顯著性分析，P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 太行雞CCNB2基因克隆

太行雞CCNB2基因剪接異構體PCR鑒定結果見圖2A，條帶大小約為247 bp。將擴增產物連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR結果如圖2B所示，其中2、4和6泳道的樣品經菌液測序，發(fā)現(xiàn)為CCNB2基因的3種剪接異構體，經序列拼接后，分別命名為CCNB2-AS1，CCNB2-AS2和CCNB2-AS3，長度分別為1 173、1 152和1 206 bp，分別編碼390、383和401個氨基酸。核酸序列比對分析結果表明，3種剪接異構體核酸序列相似，差異序列主要位于序列前端(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1，CCNB2基因剪接異構體PCR擴增產物；2、4和6，菌液PCR產物；3、5、7、8和9，空質粒 M，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification products of CCNB2 gene splice isoforms；2，4 and 6，PCR products of bacterial solution；3,5,7,8 and 9，Empty plasmids圖2 太行雞CCNB2基因剪接異構體(A)和菌液(B)PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of CCNB2 gene splice isoforms (A) and bacterial fluid (B) in Taihang chickens

圖3 太行雞CCNB2基因3種剪接異構體的部分核苷酸序列比對Fig.3 Partial nucleotide sequence alignment of 3 splice isoforms of CCNB2 gene in Taihang chickens

2.2 不同物種CCNB2基因的氨基酸序列相似性比對

太行雞CCNB2-AS1、CCNB2-AS2和CCNB2-AS3 3個剪接體之間的氨基酸序列相似性均為97.00%，這3個剪接體均與原雞的相似性最高，分別為99.71%、99.71%和100%(表2)。系統(tǒng)進化樹結果顯示，3種剪接異構體在進化上與原雞親緣關系最近，其次為雉雞(圖4)，與相似性分析結果一致。

表2 不同物種間CCNB2基因氨基酸序列相似性分析Table 2 Similarity analysis of amino acid sequence of CCNB2 gene among different species %

圖4 太行雞CCNB2基因3種剪接異構體氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of 3 splice isoforms of CCNB2 gene in Taihang chickens

2.3 生物信息學分析

2.3.1 太行雞CCNB2基因剪接異構體蛋白的亞細胞定位預測 太行雞CCNB2-AS1蛋白主要定位于細胞質(52.2%)，其他定位于細胞核(26.1%)、細胞骨架(13.0%)、液泡(4.3%)和線粒體(4.3%)。CCNB2-AS2蛋白主要定位于細胞質(52.2%)，其他定位于線粒體(17.4%)、細胞核(8.7%)、液泡(4.3%)、細胞骨架(4.3%)、內質網(4.3%)和細胞外(8.7%)。CCNB2-AS3蛋白主要定位于細胞質(52.2%)，其他定位于細胞核(26.1%)、線粒體(17.4%)、液泡(4.3%)和細胞外(4.3%)。

2.3.2 太行雞CCNB2蛋白二級結構預測 太行雞CCNB2-AS1蛋白二級結構中，217個氨基酸參與α-螺旋，占比為55.64%；13個氨基酸參與氨基酸殘基構成的延伸鏈，占比為3.33%；155個氨基酸參與無規(guī)則卷曲；占比為39.74%(圖5A)。CCNB2-AS2蛋白二級結構中，220個氨基酸參與α-螺旋，占比為57.44%；20個氨基酸參與氨基酸殘基構成的延伸鏈，占比為5.22%；136個氨基酸參與無規(guī)則卷曲，占比35.51%(圖5B)。CCNB2-AS3蛋白二級結構中，237個氨基酸參與α-螺旋，占比為59.10%；15個氨基酸參與氨基酸構成的延伸鏈，占比為3.74%；142個氨基酸參與無規(guī)則卷曲，占比為35.41%(圖5C)。3種剪接異構體的二級結構均以α-螺旋為主。

最長線，α-螺旋；次長線，延伸鏈；短線，無規(guī)則卷曲 Longest line,Alpha helix;Secondary long line,Extended chain；Short line,Random coil圖5 太行雞CCNB2-AS1(A)、CCNB2-AS2(B)和CCNB2-AS3(C)蛋白二級結構預測Fig.5 Secondary structure prediction of CCNB2-AS1 (A),CCNB2-AS2 (B) and CCNB2-AS3 (C) proteins in Taihang chickens

2.4 太行雞CCNB2基因3種剪接異構體在卵巢和不同發(fā)育時期卵泡的表達規(guī)律

CCNB2-AS1在F6時期卵泡中的表達量顯著高于其他時期(P<0.05)，從F5開始，表達量顯著下降，且F5～F1的表達量無顯著差異(P>0.05)，除了大黃卵泡，其他等級前卵泡中的表達量顯著高于卵巢以及F6以外的等級卵泡(圖6A)；CCNB2-AS2在大白卵泡中的表達量顯著高于其他時期(P<0.05)，且從小黃卵泡開始，隨著卵泡發(fā)育始終以較低水平表達(圖6B)；CCNB2-AS3在F6～F4時期卵泡中的表達量顯著高于其他時期(P<0.05，圖6C)。

3 討 論

選擇性剪接現(xiàn)象在家禽生長發(fā)育過程中廣泛存在，有報道稱約有30%基因存在剪接異構體[18]。雖然目前為止已發(fā)現(xiàn)的編碼細胞周期蛋白的基因只有15種，但是由于剪接異構體的存在使得機體內蛋白質的種類增加數倍，約50種的細胞周期蛋白在機體內發(fā)揮作用，參與機體細胞的DNA復制[19-20]。目前關于CCNB2基因在人上研究較多，一般將其作為肝癌的預后標志物[21]。CCNB2基因作為腫瘤轉移惡化的關鍵因子，調控肺癌細胞周期和轉移[22]，誘導膠質瘤細胞衰老[23]，并可調控乳腺癌細胞增殖，這些功能的發(fā)揮都與其細胞周期調節(jié)功能有關。在家畜上，牛CCNB2基因可參與體外培養(yǎng)的卵母細胞成熟過程[24]。而在家禽中其是否參與調控卵泡發(fā)育的研究鮮見報道。本研究在太行雞(國家畜禽遺傳資源委員會審定的河北省第一個地方家禽品種)小黃卵泡中克隆鑒定到CCNB2基因的3種剪接異構體，長度分別為1 173、1 152和1 206 bp，分別編碼390、383和401個氨基酸，ORF的5′-端1 035個核苷酸、345個氨基酸是一致的，說明其功能的差異可能由ORF起始序列引起的。

通過氨基酸序列相似性比對分析發(fā)現(xiàn),相較于鵝和鴨，不同品種雞中CCNB2的相似性較高，但是也存在一定差異，說明該基因在雞中功能保守，可能發(fā)揮相似功能，而且該基因與其他物種相似性較低，說明不同物種可能發(fā)揮不同功能，具體CCNB2在雞中發(fā)揮的功能還有待進一步探究。在牛上細胞周期蛋白發(fā)揮功能的主要位置在細胞質[25]，這與本研究結果一致，本試驗對3種剪接異構體亞細胞定位預測結果顯示其同樣主要定位于細胞質中。蛋白質功能的發(fā)揮與其在細胞中的位置密切相關，因此，對蛋白質二級結構預測結果顯示，3種剪接異構體的主要折疊方式為α-螺旋。

由于卵泡選擇是影響雞生殖力的重要因素[26]。本研究發(fā)現(xiàn)3種剪接異構體在不同時期卵泡中呈不同的表達模式，整體而言CCNB2-AS1在等級前卵泡中表達水平高于等級卵泡，CCNB2-AS2則在白卵泡中表達水平高于其他時期，而CCNB2-AS3表達模式則與CCNB2-AS1相反，值得注意的是，在卵泡選擇的關鍵時期，即小黃卵泡向大黃卵泡發(fā)育過程中CCNB2-AS2表達并無顯著差異，可能CCNB2-AS2并不參與卵泡選擇而是參與調控其他功能。卵泡之所以在整個性成熟期能夠發(fā)育，主要是通過卵泡顆粒細胞的調控[27-28]，CCNB2-AS3與CCNB2-AS1相反的表達情況，推測可能作為2種不同的調控因子在不同時期卵泡中發(fā)揮作用。前人研究顯示雞卵泡顆粒細胞膜上有大量促卵泡素受體(FSHR)，在等級前卵泡中伴隨著FSHR高表達的同時，CCNB2基因表達量上升，在排卵后期表達水平則較低[29-30]，與本研究中CCNB2-AS1 mRNA表達結果相似。另外，3種剪接異構體在卵泡選擇前后的SYF卵泡與LYF卵泡中的表達情況并不一致，具體功能仍需要進一步深入研究。

4 結 論

本研究鑒定到太行雞CCNB2基因的3種剪接異構體，二級結構均是以α-螺旋為主，其在各時期卵泡中均有表達，3種剪接異構體在等級前卵泡中的表達趨勢存在差異，但在等級卵泡發(fā)育過程中的表達均呈下降趨勢。結果為進一步研究太行雞CCNB2基因對雌性繁殖功能的影響提供理論支持。