王浩宇，高云鵬，朱銘瑋，吳 洋，徐林橋，李淑嫻*

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.鹽城林場，江蘇 鹽城 224136)

加拿大紫荊(Cerciscanadensis)為豆科(Leguminosae)紫荊屬(Cercis)落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于美國東部和中西部地區(qū)，是集觀賞、藥用和生態(tài)價值于一身的優(yōu)良樹種，現(xiàn)已在我國很多地區(qū)引種栽培。加拿大紫荊花色多樣，是春季優(yōu)良的觀花植物，觀賞價值較高[1]；其樹皮、樹干、花及果實(shí)具有活血通經(jīng)和祛風(fēng)解毒等醫(yī)藥功能，是重要的藥用植物[2]；它還有較強(qiáng)的抗逆性及生態(tài)適應(yīng)性，可用于保持水土及防治沙漠化，具有較高的生態(tài)效益。

生產(chǎn)上加拿大紫荊以播種繁殖為主，然而成熟種子的種皮透性差，育苗前需采用熱水處理，然后在25℃恒溫箱中浸種24 h才能解除其硬實(shí)性[3]。與很多豆目植物的種子不同，解除硬實(shí)性的加拿大紫荊種子還需要進(jìn)行一段時間的低溫層積處理才能萌發(fā)[4]，因此加拿大紫荊種子具有物理和生理雙重休眠特性[4-5]。種子休眠是植物進(jìn)化過程中形成的一個重要適應(yīng)性狀[6-7]，植物種類不同，造成種子休眠的原因也有差異，其中由內(nèi)源抑制物引起的生理休眠是很多植物種子休眠的重要原因[7-8]。內(nèi)源抑制物質(zhì)是存在于植物種子不同部位(果皮、種皮、胚乳和胚)的化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)即使極微量存在于種子中，也能影響種子的生理活動，如阻礙細(xì)胞的分裂、分化、伸長和發(fā)育，最終阻礙種子萌發(fā)[9-10]。內(nèi)源抑制物一直是種子休眠的研究熱點(diǎn)，楊曉玲等[11]研究發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)是造成山楂(Crataeguspinnatifida)種子休眠的重要原因，而青錢柳(Cyclocaryapaliurus)果皮中的香草酸對種子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用[12]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)脫落酸、茉莉酸和茉莉酸甲酯等對歐洲白蠟(Fraxinusexcelsior)種子的休眠和萌發(fā)有重要的調(diào)控作用[13]。以往對加拿大紫荊種子休眠原因的探究主要集中在種子吸水機(jī)制即物理休眠方面[3,14]，對造成其生理休眠的內(nèi)源抑制物的研究較少。本研究采用系統(tǒng)溶劑法對加拿大紫荊種子種皮及胚乳提取液進(jìn)行萃取，結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)與高效液相色譜(HPLC)技術(shù)，進(jìn)行加拿大紫荊種子休眠解除過程中內(nèi)源抑制物含量動態(tài)監(jiān)測，探究內(nèi)源抑制物質(zhì)與加拿大紫荊種子休眠之間的關(guān)系，以期為加拿大紫荊種子生理休眠特性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用的加拿大紫荊種子采集自美國Elsberry Missouri (90°47′17″W,39°10′9″N)(2018年10月下旬)，2019年2月通過上?，庣鲌@林科技有限公司進(jìn)口，種子生活力為98.0%，儲存于4 ℃冰箱中待用；發(fā)芽試驗用的市售白菜(Brassicarapa)種子為矮腳黃，純度≥95.0%，發(fā)芽率≥85.0%。

1.2 種子發(fā)芽試驗

選取籽粒飽滿的加拿大紫荊種子，參照張琪等[3]的方法，采用始溫90 ℃的熱水處理5 min，再將種子與濕潤細(xì)沙按體積比1∶3混勻后放入發(fā)芽盒中，置于4 ℃冷庫中低溫層積，定期翻動種子使其保持良好的通氣條件，并注意澆水以保持適宜的濕度。分別于層積第0、15、30、45、60天取出一定數(shù)量的種子，洗凈備用。

隨機(jī)取上述不同層積階段的加拿大紫荊種子50粒，重復(fù)3次，置于裝有濕沙的發(fā)芽盒中，在25 ℃、3 000 lx光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗，按ISTA(2021)的標(biāo)準(zhǔn)[15]統(tǒng)計種子的發(fā)芽率，參考Riis等[16]的方法計算發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子總數(shù)/試驗所用的種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt。其中，Dt為發(fā)芽天數(shù)，Gt為與相對應(yīng)時間點(diǎn)正常發(fā)芽的種子數(shù)。

1.3 種子浸提液生物活性測定

加拿大紫荊種子的離體胚不具有休眠特性[5]，故僅取熱水處理后種子的種皮和胚乳用于相關(guān)試驗。

1.3.1 種子浸提液制備

在各層積時間段隨機(jī)數(shù)取種子50粒，重復(fù)3次(共計18份種子單品)，將種皮和胚乳凍干、粉碎后直接稱取1 g粉末，加入50 mL 100%甲醇溶液，超聲波提取(40 kHz、40 ℃)1 h，靜置過夜后過濾浸提液，剩余物中再次加入50 mL 100%甲醇溶液繼續(xù)浸提，共重復(fù)浸提3次，合并所有浸提液[10-11]。將獲得的浸提液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至有機(jī)提取劑(甲醇)完全去除，最后將獲得的固體物質(zhì)用10 mL 100%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶液(色譜級)充分溶解[10-11]，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，所得濾液即為種子浸提液(種皮和胚乳浸提液)。

1.3.2 種子浸提液處理下白菜籽發(fā)芽試驗

取18個培養(yǎng)皿，在其底部各鋪一層濾紙，分別加入不同制備階段的浸提液0.5 mL(對照處理中加0.5 mL蒸餾水)，重復(fù)3次，置于通風(fēng)櫥中，待有機(jī)溶劑甲醇完全揮發(fā)(濾紙干燥)，再向各培養(yǎng)皿中分別加入5 mL蒸餾水。隨機(jī)抽取供試白菜種子100粒均勻鋪在上述培養(yǎng)皿中，置于25 ℃、3 000 lx光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗，3次重復(fù)。每8 h統(tǒng)計各處理白菜籽的萌發(fā)粒數(shù)、發(fā)芽時間，直至連續(xù)3 d每天的發(fā)芽率不超過重復(fù)粒數(shù)的1%時即認(rèn)為發(fā)芽結(jié)束[8,12,16]。計算各處理白菜籽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)[16]。

1.4 種子內(nèi)源抑制物含量測定

1.4.1 種子不同分離相提取液生物活性的測定

將加拿大紫荊種皮和胚乳浸提液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸除甲醇后加入蒸餾水定容至10 mL。參照系統(tǒng)溶劑法[10,17]，對種皮和胚乳的甲醇提取液進(jìn)行分離，分別得到石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相提取液；再將種皮和胚乳的4個有機(jī)分離相提取液蒸餾濃縮，并用相應(yīng)有機(jī)溶劑定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中備用。分別取種皮和胚乳各有機(jī)相的提取溶液，以白菜籽為材料(100?！?個重復(fù))進(jìn)行生物活性測定。

1.4.2 種子各分離相中提取液有效物質(zhì)的GC-MS法鑒定

取上述4個有機(jī)相的提取液樣品送至清華大學(xué)分析測試中心，使用GC-MS(Agelient 6890N/5973N，USA)進(jìn)行內(nèi)源抑制物分離鑒定。其中，氣相色譜條件為：1NNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；50 ℃保持2 min，再以5 ℃/min升溫至280 ℃并維持20 min；載體為高純氮?dú)?，氣化室溫度?25 ℃。質(zhì)譜條件為：離子源為EI，離子源溫度為200 ℃，電離電壓為70 eV，收集電流為300 μA，發(fā)射電流為1 mA，儀器分離率為600；掃描范圍(m/z)為10～500。

使用GC-MS對各分離相萃取液進(jìn)行分析，得到各有機(jī)相的總離子流色譜圖，將總離子進(jìn)行積分，采用峰面積歸一化法，獲得各有機(jī)物的相對含量。

1.4.3 發(fā)芽抑制物半抑制濃度(IC50)的測算

根據(jù)GC-MS鑒定結(jié)果，篩選出可能對加拿大紫荊種子發(fā)芽有影響的物質(zhì)，購買標(biāo)準(zhǔn)品。參考Zhao 等[17]的方法，將各標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度為1、10、100、1 000 mg/L的溶液，以蒸餾水為對照進(jìn)行白菜籽發(fā)芽試驗，確定各抑制物的生物活性，計算各種標(biāo)準(zhǔn)品對白菜籽的抑制率：抑制率=(A0-A1)/A0×100%。式中：A0為對照組48 h后白菜籽平均胚根長度，mm；A1為處理組48 h后白菜籽平均胚根長度，mm。

以處理組抑制物濃度對數(shù)值為X軸，以抑制物的抑制率為Y軸，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，根據(jù)擬合的回歸方程求出lg(IC50)，反向求解后可得發(fā)芽抑制半抑制濃度(IC50，胚根伸長抑制率達(dá)到50%時該抑制物的濃度)。

1.4.4 發(fā)芽抑制物標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

根據(jù)加拿大紫荊種子成分的GC-MS分析結(jié)果，參照幾種發(fā)芽抑制物的半抑制濃度，將油酸、亞油酸、硬脂酸和棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別稀釋為5、10、50、100 mg/L；將2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)和鄰苯三酚標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度稀釋為10、50、100 mg/L，以不同的濃度梯度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，確定標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到5種物質(zhì)的線性回歸方程。

1.4.5 種子浸提液內(nèi)發(fā)芽抑制物含量的測定

將低溫層積不同階段的加拿大紫荊種子浸提液送清華大學(xué)化學(xué)分析測試中心，采用GC-MS(美國 Agelient 6890N/5973N)定量分析加拿大紫荊種子中脂肪酸(油酸、亞油酸、棕櫚酸)含量的變化。氣相色譜條件為：TR-WAXMS (Thermo Scientific，30 m×250 μm×0.25 μm) 石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口 250℃，載體為高純氮?dú)?，流量?1 mL/min，分流比10。升溫程序：80 ℃保持2.5 min，以15 ℃/min 升溫至210 ℃，然后以2 ℃/min 升至230 ℃保持10 min。質(zhì)譜條件：離子源為EI；源溫為230 ℃；電離電壓為70 eV；收集電流為300 μA；發(fā)射電流為1 mA；儀器分離率為600；掃描范圍 (m/z)為45～500。

采用HPLC(美國 Agelient HP1100)進(jìn)行加拿大紫荊種子中酚類物質(zhì)(BHT、鄰苯三酚)含量的定量分析。BHT含量測定的HPLC色譜條件：色譜柱為Discovery C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃。流動相為甲醇-水(梯度洗脫)，甲醇(體積分?jǐn)?shù))65%，0～7 min；65%～100%，7～13 min；65%，13～25 min；流速為1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。鄰苯三酚含量測定HPLC色譜條件：色譜柱為Discovery C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃；流動相為40%甲醇-60%水(等度洗脫)，流速為1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和制圖，以SPSS 23.0對各測定指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、LSD法多重比較和皮爾遜相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 層積催芽過程中加拿大紫荊種子發(fā)芽能力的變化

研究發(fā)現(xiàn)，層積0 d時即熱水處理后加拿大紫荊種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均為0，表明該種子具有明顯的休眠特性(表1)；隨著低溫層積時間的延長，發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)不斷上升；層積15 d時，已經(jīng)有46.0%的種子能夠發(fā)芽，但種子發(fā)芽極不整齊，發(fā)芽指數(shù)僅為5.6；層積45 d 時，種子發(fā)芽率為95.3%，與層積60 d 時的發(fā)芽率(97.3%)差異不顯著，但二者發(fā)芽指數(shù)差異顯著。表明層積45 d 時，加拿大紫荊種子的休眠已基本解除，但層積60 d 時種子萌發(fā)更快、更整齊。

表1 不同層積時間加拿大紫荊種子發(fā)芽能力的變化

2.2 層積過程中加拿大紫荊種子浸提液抑制物活性變化

休眠解除過程中加拿大紫荊種子的浸提液對白菜籽發(fā)芽能力的影響見表2。采用低溫層積0、15、30、45 d種子浸提液處理白菜籽，其發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照組。層積0 d種子的浸提液處理后，白菜籽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為20.3%和6.8，分別較對照下降了75.8%、80.0%；層積45 d的浸提液處理后，白菜籽的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)提高到55.7%和21.0，但較對照仍然下降了33.7%和38.2%；層積60 d時，白菜籽的發(fā)芽率進(jìn)一步提高至82.3%，略低于對照組的發(fā)芽率，但差異不顯著，發(fā)芽指數(shù)提高到32.0，與對照組相比差異也不顯著。總體來看，低溫層積過程中，加拿大紫荊浸提液對白菜籽發(fā)芽的抑制作用呈逐漸降低的趨勢，說明層積過程中加拿大紫荊種子的休眠在逐漸變淺。

表2 層積不同時間加拿大紫荊種子浸提液對白菜籽發(fā)芽能力的影響

2.3 加拿大紫荊種子內(nèi)源抑制物的抑制活性分析

2.3.1 種皮與胚乳各分離相提取液的生物活性

加拿大紫荊種子種皮和胚乳的各分離相提取液對白菜籽發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響見表3。由表3可知，種皮和胚乳的各分離相提取液對白菜籽發(fā)芽的影響不盡相同。其中乙醚相和甲醇相的提取液使白菜籽的發(fā)芽率顯著下降，并且乙醚相提取液的抑制作用最強(qiáng)，處理后白菜籽發(fā)芽率由對照的91.0%下降到54.7%，下降了39.9%；甲醇相提取液處理后白菜籽發(fā)芽率為65.0%，較對照下降了28.6%。而石油醚相、乙酸乙酯相和水相提取液處理后的白菜籽發(fā)芽率與對照相比無顯著差異。

種皮和胚乳各分離相提取液對白菜籽發(fā)芽指數(shù)均有一定的抑制作用，且除石油醚相提取液外，其余各相提取液均使得白菜籽發(fā)芽指數(shù)顯著下降。各分離相提取液中，乙醚相的抑制作用最強(qiáng)，處理后發(fā)芽指數(shù)由對照的15.4下降到6.2；其次是甲醇相，發(fā)芽指數(shù)下降到7.0，下降了54.5%；乙酸乙酯相和水相，白菜籽的發(fā)芽指數(shù)分別為8.5和7.8，較對照顯著下降了44.8%和49.4%。由于發(fā)芽指數(shù)能夠更好地反映種子質(zhì)量的變化[15-16]，根據(jù)發(fā)芽指數(shù)，本研究上述5個分離相提取液對白菜籽發(fā)芽抑制作用由大到小依次為：乙醚相>甲醇相>水相≈乙酸乙酯相>石油醚相。

表3 加拿大紫荊種子種皮與胚乳的各相提取液對白菜籽發(fā)芽的影響

2.3.2 種皮和胚乳各分離相提取液的GC-MS鑒定結(jié)果

采用GC-MS分析得到種皮和胚乳各有機(jī)相提取液的總離子流色譜圖，通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行核對，選擇總離子流色譜圖中峰面積較大、相似度較高(高于80%)的波峰，將得到的吻合性較好的物質(zhì)列于表4。由表4可知，種皮和胚乳石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相提取物中分別鑒定出25、14、14、10種物質(zhì)。由于甲醇相、乙醚相、乙酸乙酯相提取物對白菜籽發(fā)芽的抑制作用較強(qiáng)，因此認(rèn)為造成加拿大紫荊種子難以萌發(fā)的內(nèi)源抑制物質(zhì)主要存在于上述3個有機(jī)相提取物中，并且推測其中相對含量較高的油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、鄰苯三酚可能對加拿大紫荊種子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用。由于乙醚相對白菜籽發(fā)芽的抑制作用最強(qiáng)(表3)，而采用GC-MS技術(shù)鑒定出的乙醚相的物質(zhì)(表4)主要是有機(jī)酸類、醇類等物質(zhì)，已有研究表明它們對白菜籽發(fā)芽的影響并不是特別大，故推測某種含量較低的物質(zhì)可能對種子萌發(fā)有一定影響。進(jìn)一步篩查發(fā)現(xiàn)，該相中存在2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)(由于其相對含量較低，僅0.61%，故表4中沒有列出)。Zhao等[17]和朱銘偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，BHT對很多種子的萌發(fā)有重要影響，因此推測BHT可能對加拿大紫荊種子萌發(fā)具有一定的抑制作用。綜上，在加拿大紫荊種子抑制作用較強(qiáng)的3個有機(jī)相中篩選出油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、BHT、鄰苯三酚等6種可能對加拿大紫荊種子萌發(fā)具有抑制作用的有機(jī)物。

表4 種皮和胚乳各分離相化合物的種類及相對含量

2.3.3 幾種化合物半抑制濃度(IC50)的確定

首先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品BHT抑制中濃度的確定。種皮和胚乳提取物中BHT質(zhì)譜圖與計算機(jī)檢索譜圖的吻合性為96%。對BHT標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度進(jìn)行生物測定，得到擬合方程：y=-1.936 7x3+13.587 7x2-11.566 9x+39.205 0(R=0.937 9)，經(jīng)反對數(shù)求出IC50為54.83 mg/L，即白菜籽胚根生長抑制率達(dá)到50%時BHT的質(zhì)量濃度為54.83 mg/L，說明較低含量的BHT即可對白菜籽胚根的伸長起到較強(qiáng)的抑制作用。

按照相同的方法確定其他化合物的擬合方程及半抑制濃度(IC50)，結(jié)果見表5。由表5可知，較低濃度的鄰苯三酚也會對白菜籽的發(fā)芽有較為顯著的影響，棕櫚酸、亞油酸和硬脂酸的IC50較BHT和鄰苯三酚明顯要高很多，而油酸對白菜籽發(fā)芽基本沒有抑制作用，故后續(xù)試驗只進(jìn)行另外5種物質(zhì)含量變化的研究。

表5 抑制物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程及IC50

2.3.4 層積過程中加拿大紫荊種子中內(nèi)源抑制物質(zhì)量濃度的動態(tài)變化

休眠解除過程中加拿大紫荊種子中內(nèi)源抑制物質(zhì)量濃度的變化如圖1所示。隨著層積時間的延長，種子中棕櫚酸、硬脂酸、BHT和鄰苯三酚4種物質(zhì)的質(zhì)量濃度均呈逐漸下降的趨勢。4種物質(zhì)中，鄰苯三酚質(zhì)量濃度的下降幅度最明顯，0 d時其質(zhì)量濃度為325.88 mg/L，比IC50(51.20 mg/L)高出5倍多；層積45 d(休眠基本解除)時，質(zhì)量濃度迅速下降到18.72 mg/L，遠(yuǎn)低于IC50，比0 d時下降了94.26%；層積60 d時，質(zhì)量濃度僅為12.57 mg/L，比0 d時下降了96.14%。層積過程中，棕櫚酸質(zhì)量濃度由15.25 mg/L(0 d)下降到8.78 mg/L(60 d)，下降了42.43%；硬脂酸質(zhì)量濃度由層積前的20.23 mg/L下降到9.71 mg/L(層積60 d)，下降了52.00%；BHT的質(zhì)量濃度在層積過程中變化不太大，僅由層積前的6.07 mg/L下降到5.72 mg/L，下降了5.77%?？偟膩碚f，層積過程中，加拿大紫荊種子中棕櫚酸、硬脂酸、BHT的質(zhì)量濃度雖然都呈下降的變化趨勢，但下降幅度遠(yuǎn)低于鄰苯三酚；棕櫚酸、硬脂酸、BHT三者層積前的質(zhì)量濃度均遠(yuǎn)低于IC50，因此它們在加拿大紫荊種子休眠中的抑制作用要弱于鄰苯三酚。層積過程中亞油酸的質(zhì)量濃度呈先下降(0～15 d)再上升(15～45 d)再下降(45～60 d)的變化趨勢。

不同小寫字母表示同一物質(zhì)質(zhì)量濃度在不同層積時間差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference among dormancy release stages of the same substance.圖1 加拿大紫荊種子休眠解除不同階段抑制物質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes of inhibitory substances in C. canadensis seeds at different stages of dormancy release

2.4 層積過程中加拿大紫荊種子各指標(biāo)相關(guān)性分析

層積時間與種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)以及層積過程中棕櫚酸、硬脂酸、BHT、鄰苯三酚質(zhì)量濃度6項指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)呈一定的相關(guān)性(表6)。具體來看：層積時間與發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.924(P<0.05)和0.999(P<0.01)；層積時間與棕櫚酸、硬脂酸、BHT和鄰苯三酚質(zhì)量濃度之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而層積時間與亞油酸質(zhì)量濃度之間無顯著相關(guān)。由表6還可以發(fā)現(xiàn)，硬脂酸、BHT和鄰苯三酚質(zhì)量濃度與發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)之間有著顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，棕櫚酸質(zhì)量濃度僅與發(fā)芽指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，亞油酸質(zhì)量濃度與發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)間無相關(guān)關(guān)系。綜上所述，層積過程中，加拿大紫荊種子中棕櫚酸、硬脂酸、BHT、鄰苯三酚4種物質(zhì)質(zhì)量濃度與層積時間、發(fā)芽能力有著顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能的原因是低溫層積處理改變了種皮透性，促進(jìn)了內(nèi)源抑制物的外滲，或通過激活水解酶加速內(nèi)源抑制物的代謝分解。

表6 休眠解除過程中加拿大紫荊種子各指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 加拿大紫荊種子內(nèi)源抑制物的種類

內(nèi)源抑制物是許多植物種子休眠的主要原因[19-20]。廖源林等[10]發(fā)現(xiàn)野鴉椿(Euscaphisjaponica)種殼和胚中的酚酸類、堿類抑制物是種子深度休眠的主要原因。史雷[21]在曼陀羅(Daturastramonium)種皮和種仁中發(fā)現(xiàn)了水溶性和脂溶性的萌發(fā)抑制物質(zhì)。Gao等[22]在紫荊(C.chinensis)種子休眠的研究中發(fā)現(xiàn)，種皮和胚乳浸提液對白菜籽萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用，認(rèn)為抑制物質(zhì)是其生理休眠的主要原因。本研究中熱水處理即解除物理休眠后的加拿大紫荊種子(層積0 d)仍不能順利萌發(fā)，因此推測該種子同樣具有生理休眠特性。層積0 d時種皮與胚乳浸提液處理白菜籽，其發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為20.3%和6.8，分別較對照下降了75.8%、80.0%，說明浸提液中存在抑制活性較強(qiáng)的物質(zhì)。隨著層積時間的延長，加拿大紫荊種子的發(fā)芽率在不斷提高，此過程中浸提液對白菜籽發(fā)芽的影響在逐漸減弱，可能的原因是低溫層積處理改變了種皮透性促進(jìn)了內(nèi)源抑制物外滲，或通過激活水解酶加速內(nèi)源抑制物的代謝分解[22-23]。說明種皮與胚乳中的內(nèi)源抑制物是造成加拿大紫荊種子生理休眠的主要原因之一。

對種子內(nèi)源抑制物的研究通常采用系統(tǒng)溶劑法[10,12]。張艷杰等[24]采用該方法對南方紅豆杉(Taxusmairei)種子各有機(jī)相提取液進(jìn)行生物活性測定時發(fā)現(xiàn)，抑制物質(zhì)主要存在于乙醚相和甲醇相提取液中；尚旭嵐等[12]對青錢柳種子果皮的浸提液進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)抑制物質(zhì)主要存在于果皮浸提液的乙醚相中；孫曉剛等[25]的研究認(rèn)為，‘鳳丹’牡丹(Paeoniaostii‘Fengdan’)種子胚乳乙醚相提取液中的化合物，可能是導(dǎo)致‘鳳丹’種子萌發(fā)受抑制的主要原因。本研究對加拿大紫荊種子種皮和胚乳成分進(jìn)行生物活性測定，結(jié)果表明，5個分離相提取液對白菜籽萌發(fā)的抑制作用從大到小依次為乙醚相>甲醇相>水相≈乙酸乙酯相>石油醚相，結(jié)合5個分離相對白菜籽發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)影響的試驗，認(rèn)為發(fā)芽抑制物質(zhì)主要存在于抑制作用較強(qiáng)的乙醚相、甲醇相和乙酸乙酯相提取液中，這與史鋒厚等[26]、韓寶瑞等[27]的研究結(jié)果相似。

造成種子休眠的內(nèi)源抑制物質(zhì)種類不盡相同。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)酚類、有機(jī)酸類、酯類和醛類物質(zhì)可能是種子中影響發(fā)芽的內(nèi)源抑制物質(zhì)[23,28-29]，它們通過抑制種子的呼吸[30-31]、酶活性[10,32-33]、胚的生長[34]對種子的萌發(fā)起到一定的抑制作用。Einhellig[33]的研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)對種子萌發(fā)關(guān)鍵酶的活性具有較強(qiáng)的抑制作用，這可能是酚酸類物質(zhì)抑制種子萌發(fā)的主要原因。李淑嫻等[35]在烏桕(Sapiumsebiferum)種子休眠機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，BHT對烏桕種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用。王艷華[36]在大山櫻(Prunussargentii)種子休眠研究中發(fā)現(xiàn)，硬脂酸、棕櫚酸等有機(jī)酸類是種子內(nèi)的重要抑制物質(zhì)。本研究從加拿大紫荊種子抑制作用較強(qiáng)的乙醚相、甲醇相和乙酸乙酯相提取液中鑒定出了亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、BHT、鄰苯三酚共5種可能具有萌發(fā)抑制活性的化合物它們的半抑制濃度(IC50)顯示對發(fā)芽的抑制作用由強(qiáng)到弱的順序為鄰苯三酚>BHT>亞油酸>棕櫚酸>硬脂酸。

3.2 內(nèi)源抑制物與加拿大紫荊種子休眠的關(guān)系

多數(shù)發(fā)芽抑制物的抑制作用與其在種子中的濃度顯著相關(guān)，且通常表現(xiàn)為高濃度具抑制作用[11,37]。楊曉玲等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，成熟的山楂種子中酚類物質(zhì)含量較高，低溫層積過程中種子中酚類物質(zhì)的含量急劇下降，有利于種子休眠解除。胡曉輝等[38]在落花生(Arachishypogaea)種子休眠特性的分析中發(fā)現(xiàn)，種子休眠與油酸和烯酸含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與棕櫚酸和亞油酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。為了進(jìn)一步探討篩選出的5種內(nèi)源抑制物對加拿大紫荊種子順利萌發(fā)的影響，對其在種子層積過程中質(zhì)量濃度的變化進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)隨著層積時間的延長，棕櫚酸、硬脂酸、BHT、鄰苯三酚的質(zhì)量濃度均呈顯著下降的趨勢，且硬脂酸、BHT和鄰苯三酚與種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，棕櫚酸僅與發(fā)芽指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。由于棕櫚酸、硬脂酸、BHT這3種物質(zhì)在層積前的質(zhì)量濃度就比較低，遠(yuǎn)低于半抑制濃度，因此它們各自對加拿大紫荊種子休眠的影響可能不是特別大，特別是BHT，其層積前后僅相差5.77%。而鄰苯三酚含量的變化則不同，層積前其體積質(zhì)量為325.88 mg/L，比IC50(51.20 mg/L)高出5倍多，層積45 d時體積質(zhì)量僅為18.72 mg/L，遠(yuǎn)低于其IC50，較0 d時下降了94.3%，此時，加拿大紫荊種子的發(fā)芽率由層積前的0提高到了95.3%，因此休眠解除過程中含量變化最大的鄰苯三酚可能是導(dǎo)致其休眠的主要抑制物質(zhì)，由此也可以推測，加拿大紫荊種子休眠過程中酚類化合物比酸類化合物有更強(qiáng)的抑制效果，這與楊曉玲等[11]、Gao等[23]的研究結(jié)果相似。此外，休眠解除過程中，亞油酸含量呈先下降后升高再下降的變化趨勢，其與種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)無相關(guān)關(guān)系，且0 d時亞油酸的含量遠(yuǎn)低于抑制中濃度。因此，亞油酸可能對加拿大紫荊種子休眠的影響不是特別大，更可能是作為營養(yǎng)物質(zhì)為種子的萌發(fā)提供能量[39-40]。

總之，加拿大紫荊種子具有物理和生理雙重休眠，且種皮與胚乳中的內(nèi)源抑制物是其生理休眠的主要原因之一。對加拿大紫荊種子內(nèi)源抑制物的抑制活性進(jìn)行分析，在抑制作用較強(qiáng)的乙醚相、甲醇相和乙酸乙酯相提取液中，鑒定出了亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、BHT、鄰苯三酚共5種可能具有萌發(fā)抑制活性的化合物，對比5種發(fā)芽抑制物質(zhì)在種子層積過程中含量的變化以及其抑制中濃度，筆者認(rèn)為休眠解除過程中含量變化最大的鄰苯三酚可能是其休眠的主要抑制物質(zhì)。本研究僅從內(nèi)源抑制物角度探討了加拿大紫荊種子生理休眠的原因，但GC-MS技術(shù)不能鑒定出激素類物質(zhì)，因此內(nèi)源激素對加拿大紫荊種子萌發(fā)的影響還有待進(jìn)一步研究。