趙凱歌，周正虎，金 鷹，王傳寬

(東北林業(yè)大學(xué)生態(tài)研究中心，森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

工農(nóng)業(yè)迅速發(fā)展過程中氮氧化物的大量排放導(dǎo)致全球氮(N)沉降速率不斷提高，引發(fā)了諸如土壤酸化、生物多樣性喪失等生態(tài)問題，N沉降對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)的影響受到了廣泛關(guān)注[1-2]。土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)分解、營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)，以及土壤肥力形成過程中發(fā)揮著重要作用[3]。N沉降會(huì)通過影響森林植被組成、凋落物化學(xué)成分、細(xì)根生物量和性狀、土壤酸化、N可利用性等過程影響土壤微生物群落[1]；微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的改變反過來也會(huì)顯著影響土壤碳(C)和養(yǎng)分循環(huán)[4]。有研究認(rèn)為N沉降會(huì)通過降低微生物對(duì)惰性有機(jī)質(zhì)的分解，進(jìn)而促進(jìn)土壤惰性有機(jī)碳的累積，有利于土壤碳的長期固存[5]。然而，在貢嘎山針葉林中的研究發(fā)現(xiàn)N添加促進(jìn)了土壤惰性碳的分解，進(jìn)而引起土壤呼吸速率的顯著升高[6]。微生物通過產(chǎn)生胞外酶將環(huán)境中的有機(jī)質(zhì)分解成可溶性的小分子物質(zhì)之后才能被自身吸收利用，微生物胞外酶活性的大小直接影響著土壤C、N、磷(P)的循環(huán)過程[7]。例如，過氧化物酶、酚氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶主要分解惰性有機(jī)質(zhì)，而β-葡萄糖苷酶、纖維素酶等水解酶主要分解活性有機(jī)質(zhì)，幾丁質(zhì)酶和磷酸酶控制著有機(jī)質(zhì)中N、P的礦化和釋放[8-9]。因此，分析微生物胞外酶活性有助于揭示森林土壤C、N、P循環(huán)對(duì)N添加的響應(yīng)機(jī)制。

和針葉林相比，闊葉林的枯落物質(zhì)量較高(N含量高且木質(zhì)素含量低)，進(jìn)而更容易被微生物分解[10-11]，這可能會(huì)改變N添加對(duì)微生物生長和活性的影響。此外，不同樹種形成的菌根類型也會(huì)對(duì)土壤C、N、P循環(huán)過程產(chǎn)生顯著影響。叢枝菌根(AM)占據(jù)優(yōu)勢的森林土壤被認(rèn)為具有較高的N含量、開放的N循環(huán)，以及較低的碳氮比(含量經(jīng)記為C/N，下同)和較高的C循環(huán)速率[12-13]。相反，外生菌根(ECM)占主導(dǎo)的森林枯落物具有較高的木質(zhì)素濃度、C/N，導(dǎo)致ECM樹種葉片凋落物的分解速率要慢于AM樹種[13]。然而，相同氣候和土壤條件下不同菌根類型森林土壤C、N、P循環(huán)過程對(duì)N添加的響應(yīng)尚無定論。落葉松(Larixgmelinii)和水曲柳(Fraxinusmandshurica)是東北地區(qū)優(yōu)勢樹種和主要造林樹種，且落葉松和水曲柳分別屬于針葉樹種和闊葉樹種，以及ECM樹種和AM樹種[14-16]。與落葉松相比，水曲柳的凋落葉質(zhì)量更高，比如水曲柳葉片具有較高的N含量、較低的木質(zhì)素含量[16]。因此，水曲柳凋落葉的分解速率顯著高于落葉松凋落葉的分解速率，最終導(dǎo)致落葉松人工林中地表凋落葉的現(xiàn)存量顯著高于水曲柳人工林的[16-17]。為此，本研究基于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山生態(tài)站落葉松和水曲柳人工林長達(dá)16 a的N添加試驗(yàn)，揭示長期N添加對(duì)落葉松和水曲柳人工林土壤C、N、P組分及相關(guān)酶活性的影響，并探討樹種的調(diào)控響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山森林生態(tài)站(127°30′ E，45°20′N)開展。長期氣象數(shù)據(jù)(1980—2017年)顯示該地區(qū)年平均氣溫為 2 ℃，1月和7月的平均氣溫分別為-20.7和20.5 ℃；年均降水量為702 mm，其中81%的降雨量出現(xiàn)在生長季節(jié)(5—9月)；無霜期為130～172 d[18]。該地區(qū)的頂級(jí)群落為闊葉-紅松林，現(xiàn)有植被是頂級(jí)植被屢遭人為干擾后形成的次生林和人工林，主要造林樹種為落葉松(Larixgmelinii)、紅松(Pinuskoraiensis)和水曲柳(Fraxinusmandshurica)。土壤為典型暗棕壤。

長期N添加試驗(yàn)在落葉松和水曲柳兩種人工林中開展。兩種人工林均栽種于1986年，且立地條件一致[19]，株行距為1.5 m × 2.0 m。2002年5月，在每種人工林中隨機(jī)設(shè)立了6個(gè)20 m × 30 m的樣地、3個(gè)N添加處理樣地和3個(gè)對(duì)照樣地。自2003年起開始施加NH4NO3，N添加量為10 g/(m2·a)，其中5、6、7、8和9月的施N量分別是總量的15%、21%、28%、21%和15%[20]。

1.2 樣品采集

2018年7月，在每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)選擇7個(gè)位置采集0～10 cm土壤樣本，將每個(gè)樣地內(nèi)的7個(gè)土壤樣品混合。去除土壤樣品中的石塊和植物根系，過孔徑2 mm土壤篩。一部分樣品儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中，用于分析有效N、有效P、微生物生物量和酶活性；另一部分樣品風(fēng)干粉碎后用于分析土壤總有機(jī)C、全N、全P和土壤C組分。

1.3 樣品分析方法

用2 mol/L KCl提取土壤無機(jī)氮(IN)；用0.5 mol/L NaHCO3提取土壤有效磷(AP)。土壤全氮(TN)采用濃硫酸+硫酸銅+硫酸鉀進(jìn)行土壤消煮，全磷(TP)采用高氯酸進(jìn)行土壤消煮，浸提液和消煮液中的IN、AP和TN、TP含量均由連續(xù)流動(dòng)分析儀(BRAN+LUEBBE-AA3, Germany)測定。土壤總有機(jī)碳(TOC)含量由Multi N/C 2100s分析儀固體模塊(Analytik Jena AG，Germany)測定。采用酸水解法[21]測定有機(jī)碳組分，將總有機(jī)碳分為活性碳庫Ⅰ(LPⅠ-C)、活性碳庫Ⅱ(LPⅡ-C)和惰性碳(RP-C)庫。首先用2.5 mol/L H2SO4在105 ℃下水解30 min提取活性碳庫Ⅰ；然后在室溫下用13 mol/L H2SO4水解過夜，提取活性碳庫Ⅱ；總有機(jī)碳濃度與兩個(gè)活性碳庫濃度的差值為惰性C庫的濃度。

土壤微生物生物量碳(MBC)、土壤微生物生物量氮(MBN)采用氯仿熏蒸-浸提法測定[22]。新鮮土樣置于燒杯中，于25 ℃真空條件下用氯仿熏蒸處理24 h。未熏蒸組不添加氯仿同樣條件下處理24 h。用0.5 mol/L K2SO4分別浸提熏蒸組和未熏蒸組的C、N元素。利用Multi N/C 2100s分析儀液體模塊測定兩組浸提液中的C、N濃度，其中未熏蒸組的C、N含量分別為土壤溶解性有機(jī)氮(DOC)、溶解性有機(jī)碳(DON)含量。MBC、MBN分別為熏蒸組和未熏蒸組浸提液中C、N含量的差值。

土壤酶活性的測定參考Martens等[23]的方法。β-1,4-葡萄糖苷酶或幾丁質(zhì)酶活性的測定方法為：精確稱取鮮土1 g，加入4 mL醋酸緩沖液(pH為5.0，0.1 mol/L)和1 mL對(duì)硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷(BG底物, 0.025 mol/L)或β-N-乙酰氨基葡萄糖苷(NAG底物, 0.01 mol/L)，漩渦震蕩混勻，然后將土漿在35 ℃下培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)結(jié)束后加入1 mL CaCl2溶液(0.5 mol/L)和4 mL NaOH溶液(0.5 mol/L)，漩渦震蕩后過濾，分光光度計(jì)410 nm下測量濾液吸光值。酸性磷酸酶活性的測定與BG、NAG的步驟相同，具體將緩沖液改為通用緩沖液(pH為6.0)，底物為對(duì)硝基苯磷酸二鈉(0.025 mol/L)。酚氧化酶的測定方法以50 mmol/L鄰苯三酚(1,2,3-三羥基苯)為底物，培養(yǎng)2 h，在460 nm處測定吸光值。除了向反應(yīng)液中加入H2O2，過氧化物酶測定步驟與酚氧化酶的測定步驟相同，加入H2O2后的總活性減去酚氧化酶活性即為過氧化物酶活性。以上所有酶活性的單位為μg/(g·h)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)落葉松和水曲柳人工林間土壤C、N、P組分及相關(guān)酶活性的差異顯著性(α= 0.05)。自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的響應(yīng)比(RR，公式中以RRR表示)用于量化N添加對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響程度：

式中，xt和xc分別是N添加和對(duì)照處理相應(yīng)變量的平均值。若RRR大于0且95%置信區(qū)間不包含0，表明N添加導(dǎo)致該參數(shù)顯著增加；若RRR小于0且95%置信區(qū)間不包含0，表明N添加導(dǎo)致該參數(shù)顯著減少；若95%置信區(qū)間包含0，則表明N添加沒有顯著改變該參數(shù)。采用線性回歸分析量化變量間的相關(guān)性，利用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SigmaPlot 14.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水曲柳和落葉松人工林土壤C、N、P組分和微生物活性對(duì)比

經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，水曲柳和落葉松兩種人工林間土壤總有機(jī)C含量沒有顯著差異(表1)。此外，兩種人工林間土壤溶解性有機(jī)碳(表1)和微生物生物量碳(表2)大小也相當(dāng)。然而，兩種人工林間酸水解法劃分的土壤C組分具有顯著差異(表1)。落葉松人工林土壤活性碳庫Ⅰ是水曲柳人工林的1.3倍，但落葉松人工林土壤惰性C庫比水曲柳人工林的惰性C庫低9.8%。兩種人工林間土壤全氮、溶解性有機(jī)氮、微生物生物量氮以及無機(jī)氮含量均無顯著差異(表1、表2)。盡管落葉松人工林的全磷和有效磷含量均高于水曲柳人工林，但兩者間差異并不顯著(表1)。水曲柳和落葉松兩種人工林土壤β-1,4-葡萄糖苷酶活性差異顯著，前者是后者的1.4倍(表2)。盡管幾丁質(zhì)酶、酸性磷酸酶、酚氧化酶、過氧化物酶活性均呈現(xiàn)水曲柳人工林大于落葉松人工林，但兩者間差異并不顯著(表2)。

表1 水曲柳和落葉松人工林土壤C、N、P組分對(duì)比

表2 水曲柳和落葉松人工林土壤微生物生物量及相關(guān)酶活性對(duì)比

TOC.土壤總有機(jī)碳 soil total organic carbon；MBC.微生物生物量碳 microbial biomass carbon；LPI-C.活性碳庫Ⅰ labile carbon pool I；LPⅡ-C.活性碳庫Ⅱ labile carbon pool Ⅱ；RP-C.惰性碳庫 recalcitrant carbon pool；DOC.溶解性有機(jī)碳 dissolved organic carbon；TN.土壤全氮 soil total nitrogen；DON.溶解性有機(jī)氮 dissolved organic nitrogen；MBN.土壤微生物生物量氮 microbial biomass nitrogen；IN.土壤無機(jī)氮 inorganic nitrogen；TP.土壤全磷 soil total phosphorus；AP.土壤有效磷 available phosphorus。圖1 氮添加對(duì)水曲柳和落葉松人工林土壤碳、氮、磷組分的影響Fig.1 Effects of nitrogen addition on soil carbon, nitrogen and phosphorus fractions in F. mandshurica and L. gmelinii plantations

2.2 N添加對(duì)土壤C、N、P組分的影響

N添加對(duì)兩種人工林土壤TOC以及酸水解法劃分的土壤C組分均沒有顯著影響，但導(dǎo)致水曲柳和落葉松人工林的MBC含量均顯著降低(圖1a)，降低幅度達(dá)32.9%和24.2%。N添加沒有顯著改變兩種人工林的土壤TN含量，卻顯著增加了兩種人工林的無機(jī)氮含量，并顯著降低了水曲柳和落葉松人工林的MBN含量(圖1b)，降低幅度達(dá)37.7%和36.3%。N添加沒有顯著改變土壤TP和AP的大小(圖1c)。回歸分析顯示，土壤微生物生物量隨著土壤pH的降低而顯著降低(圖2a)，卻隨著土壤無機(jī)氮含量的增加而顯著降低(圖2e)。

圖2 水曲柳和落葉松人工林土壤微生物生物量碳以及胞外酶活性與土壤pH以及土壤無機(jī)氮間的關(guān)系Fig.2 Relationships between microbial biomass carbon or extracellular enzymes and soil pH or inorganic nitrogen in F. mandshurica and L. gmelinii

2.3 N添加對(duì)土壤酶活性的影響

N添加顯著抑制了落葉松人工林的幾丁質(zhì)酶活性，但并不影響該人工林的其他酶活性(圖3)。與落葉松人工林不同，N添加導(dǎo)致水曲柳人工林β-1,4-葡萄糖苷酶、酚氧化酶和過氧化物酶活性分別降低了24.5%、46.7%和28.6%，卻顯著促進(jìn)幾丁質(zhì)酶活性提高27.0%。回歸分析顯示，β-1,4-葡萄糖苷、酚氧化酶和過氧化物酶活性隨著土壤pH的減小而顯著降低(圖2b、2c、2d)，但3種酶活性與土壤無機(jī)氮含量無關(guān)(圖2f、2g、2h)。

3 討 論

3.1 水曲柳和落葉松人工林土壤C組分比較

樹種通過影響凋落物數(shù)量和質(zhì)量以及改變土壤理化性質(zhì)進(jìn)而影響土壤C含量及其組分大小[24]。盡管Lin等[13]的整合分析發(fā)現(xiàn)叢枝菌根(AM)森林土壤C含量略高于外生菌根(ECM)森林，但在溫帶森林中AM和ECM林型間并沒有顯著差異，與本研究結(jié)果一致。通常低質(zhì)量的凋落葉中因含有大量難分解物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致土壤中累積更多的穩(wěn)定性有機(jī)質(zhì)[25]。但微生物效率-基質(zhì)穩(wěn)定假說(MEMS)認(rèn)為微生物的C利用率及其殘?bào)w輸入是土壤穩(wěn)定性有機(jī)C的主要決定者[17]。凋落物質(zhì)量越高，凋落物分解過程中更多的C將會(huì)和土壤礦質(zhì)形成更穩(wěn)定的有機(jī)質(zhì)，這可能導(dǎo)致水曲柳土壤惰性C比例顯著高于落葉松。筆者研究發(fā)現(xiàn)水曲柳和落葉松人工林間土壤惰性C的絕對(duì)差值很小。這可能是因?yàn)橥寥烙袡C(jī)C的穩(wěn)定性不僅取決于自身的化學(xué)組成，還依賴于微團(tuán)聚體和礦質(zhì)保護(hù)作用。本研究中兩種林型位置相鄰，這可能導(dǎo)致兩種林型惰性C差異較小。微生物生物量大小主要受到土壤C和養(yǎng)分驅(qū)動(dòng)[26]，兩種人工林的土壤TOC、TN、TP含量相同，一定程度解釋了兩種人工林具有相同的MBC。

3.2 水曲柳和落葉松人工林土壤微生物量及其胞外酶活性對(duì)N添加的響應(yīng)

長期N添加顯著降低了兩種人工林的MBC、MBN含量。首先，N添加會(huì)引起土壤酸化和鈣、鎂離子的流失并抑制土壤微生物的生長[27]。本研究土壤MBC含量隨土壤pH和IN的顯著變化表明，N添加通過土壤酸化途徑影響土壤微生物的生長。其次，該樣地的前期研究發(fā)現(xiàn)N添加會(huì)導(dǎo)致兩種人工林細(xì)根生物量顯著降低[28]，細(xì)根生物量的降低會(huì)減少根際分泌物，從而降低土壤微生物生物量。最后，本研究中N添加速率較大且時(shí)間較長，而N添加對(duì)土壤微生物生物量的抑制作用會(huì)隨著N添加速率和時(shí)間的增加而增加[27, 29]，這可能導(dǎo)致N添加對(duì)兩種人工林MBC的抑制作用是全球平均水平的5.2倍[10]。

長期N添加降低了兩種林型的β-1,4-葡萄糖苷酶和酚氧化酶活性。酚氧化酶活性的降低可能是因?yàn)镹添加會(huì)抑制土壤中產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶的關(guān)鍵類群[白腐擔(dān)子菌(White-rot,Basidiomycetessp.)和軟腐子囊菌(soft-rot,Ascomycetessp.)]的生長[27, 30-31]。然而，落葉松人工林酚氧化酶活性的降低并不顯著。落葉松凋落物分解速度很慢，其地表覆蓋較厚枯落物，這可能需要微生物投入大量的C水解酶進(jìn)行分解。此外，ECM真菌比AM真菌對(duì)惰性有機(jī)質(zhì)的分解能力更強(qiáng)[32]，這可能會(huì)抵消N添加的負(fù)面效應(yīng)。兩種林型的幾丁質(zhì)酶活性對(duì)N添加的響應(yīng)也不相同。Jian等[30]和Xiao等[33]的整合分析都發(fā)現(xiàn)N添加不會(huì)顯著影響幾丁質(zhì)酶活性，Chen等[34]的整合分析卻發(fā)現(xiàn)N添加顯著增加了幾丁質(zhì)酶活性，這表明N添加對(duì)幾丁質(zhì)酶的影響并無定論。并且，樹種會(huì)顯著改變微生物胞外酶活性對(duì)N添加的響應(yīng)。Weand等[35]在美國卡茨基爾山脈地區(qū)比較了5種人工林微生物胞外酶活性對(duì)N添加的響應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同樹種氧化酶和水解酶活性對(duì)N添加的響應(yīng)并不一致。此外，本研究僅在生長季旺期取樣1次，由于酶活性具有很大的季節(jié)變異性，這也可能會(huì)導(dǎo)致不同研究間結(jié)論的不一致性。例如，Allsion等[36]在阿拉斯加黑云杉(Piceamariana)林中的研究發(fā)現(xiàn)N添加對(duì)β-1,4-葡萄糖苷酶和幾丁質(zhì)酶的影響均因季節(jié)而異?？傊瑯浞N和季節(jié)對(duì)土壤生態(tài)學(xué)過程的調(diào)控及其對(duì)N添加的響應(yīng)還存在較大不確定性，潛在的機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

3.3 水曲柳和落葉松人工林土壤C、N、P組分對(duì)N添加的響應(yīng)

整合相關(guān)研究[37]，分析結(jié)果顯示N添加會(huì)通過抑制C分解、增加C輸入來增加土壤有機(jī)C，這種正效應(yīng)會(huì)隨著N添加時(shí)間增長而增加[38]，這與筆者的結(jié)果矛盾。這種矛盾可能主要由以下方面所致：首先，兩種人工林表層TOC本底值很高(接近100 g/kg，表1)，16年的N添加處理可能還難以導(dǎo)致TOC顯著增加；其次，以往研究顯示16年的N添加沒有顯著增加兩種人工林的生產(chǎn)力[18]，即N添加對(duì)地上植被生產(chǎn)力的促進(jìn)效應(yīng)在寒冷地區(qū)并不明顯[39]。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)N添加會(huì)導(dǎo)致兩種人工林細(xì)根生物量顯著降低[28]，而細(xì)根比地上凋落葉含更多的木質(zhì)素等難降解的物質(zhì)，是土壤惰性C的主要來源[40-41]。全球尺度上的研究表明森林地下根系凋落物對(duì)土壤有機(jī)碳的貢獻(xiàn)高達(dá)48%[42]。在北美五大湖區(qū)不同緯度闊葉林的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)根凋落物對(duì)土壤惰性C的輸入量是地上凋落葉的2倍以上[40]。因此，微生物分解作用的降低可能會(huì)被細(xì)根生物量的降低所抵消，導(dǎo)致人工林的TOC沒有顯著變化。N添加也沒有引起DOC和酸水解法劃分的C組分發(fā)生顯著變化，這與涂利華等[43]以及林偉等[44]的研究相符。以往研究認(rèn)為N添加通過降低氧化酶活性來減少惰性C分解，進(jìn)而增加土壤惰性C庫[5]。但最新C循環(huán)理論框架認(rèn)為土壤有機(jī)C的形成取決于微生物分解代謝及其殘?bào)w的輸入，而微生物殘?bào)w能夠貢獻(xiàn)土壤有機(jī)C儲(chǔ)量的30%～60%[45]。一方面，16年的N添加沒有降低落葉松人工林的氧化酶活性，這導(dǎo)致落葉松人工林土壤C組分并沒有發(fā)生變化；另一方面，微生物殘?bào)w輸入可能會(huì)改變土壤C組分對(duì)N添加的響應(yīng)。

N添加顯著增加了IN含量卻對(duì)TN含量沒有顯著影響。首先，TOC和TN之間具有緊密的耦合關(guān)系，N添加并不會(huì)改變這種關(guān)系[46]；其次，N添加會(huì)促進(jìn)凈N礦化、反硝化等過程[47]，進(jìn)而加快土壤N向大氣的釋放。長期N添加并沒有顯著改變土壤TP和AP的大小，這可能是由于土壤P主要依賴于土壤母質(zhì)特征[48]，而表層土壤P的變化主要依賴于風(fēng)化程度[49]以及植被在土壤剖面上的重新分配作用。

總之， N添加主要通過改變土壤pH來影響微生物生物量和C水解酶活性。N添加對(duì)兩種人工林β-1,4-葡萄糖苷酶和氧化酶活性的不同響應(yīng)可能與兩種人工林凋落物質(zhì)量和菌根類型不同有關(guān)。盡管N添加抑制了微生物生長并改變了胞外酶活性，但16年的N添加并沒有增加土壤C含量和改變土壤C組分，表明未來需要從土壤有機(jī)C的來源(植物和微生物殘?bào)w)和穩(wěn)定性(礦質(zhì)保護(hù))等過程揭示N添加對(duì)土壤C的影響機(jī)制。