賈展慧，賈曉東，許夢洋，莫正海，翟 敏，宣繼萍，張計育，王 剛，王 濤, 郭忠仁

(江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇省農業(yè)種質資源保護與利用平臺,江蘇 南京 210014)

薄殼山核桃(Caryaillinoinensis)是世界上重要的干果樹種之一，含有豐富的酚類物質[1]。Villarreal-Lozoya等[2]發(fā)現(xiàn)在成熟的薄殼山核桃種仁中主要的酚類物質是鞣花酸和沒食子酸，以及少量的兒茶素(catechin, C)和表兒茶素(epicatechin, EC)。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，兒茶素、表兒茶素及由兩者縮合形成的原花青素(proanthocyanidins，PAs)是薄殼山核桃未成熟期種仁中的主要酚類成分，含量是其他酚類物質的數倍[3]。原花青素又稱縮合單寧，是植物體內重要的黃酮類化合物，不僅對植物的生長發(fā)育、防護紫外光輻射和防御病蟲害等有著重要作用，而且是目前國際上公認的清除人體內自由基有效的天然抗氧化劑，已成為抗氧化、抗衰老和預防氧化相關疾病的研究熱點。

原花青素生物合成起始于苯丙氨酸，二氫黃烷酮4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是該途徑中合成花青素、兒茶素和原花青素的上游關鍵酶。該基因可將二氫黃酮醇還原為相應的黃烷-3, 4-二醇(無色花青素，leucoanthocyanidins)。DFR屬于NADPH依賴性短鏈還原酶家族或者是 DFR 亞家族，一般以單基因或小基因家族的形式出現(xiàn)在植物中，最早從玉米(Zeamays)和金魚草(Antirrhinummajus)中克隆得到[4-5]。由無色花青素合成原花青素屬于核心類黃酮途徑，經無色花青素還原酶(leucoanthocyanidin reductase, LAR)途徑和花青素還原酶(anthocyanidin reductase, ANR)途徑通過多酶促反應完成，在許多植物中已有過研究。LAR途徑指由LAR還原無色花青素形成2，3-反式黃烷-3-醇(兒茶素)，然后縮合成原花青素[6]。LAR是兒茶素形成的關鍵酶，最早在豆科植物金錢草(Desmodiumuncinatum) 的葉片中克隆得到[7]；ANR途徑指由花青素合成酶(anthocyanidin synthase，ANS)催化將無色花青素還原成2，3-順式黃烷-3-醇(表兒茶素)，然后聚合成原花青素[8-9]。ANR是表兒茶素形成的關鍵酶，屬于DFR超家族的脫氫酶類[10-11]。首先在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中分離得到ANR基因，編碼342個氨基酸，與DFR有較高的相似性。多數植物同時具有LAR和ANR基因，能同時合成兒茶素和表兒茶素。

Jia等[3]研究發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃未成熟種仁的強抗氧化性與高含量的兒茶素類物質呈極顯著正相關，但在成熟種仁中，兒茶素類物質含量快速下降，而抗氧化活性并不低。推測可能是由(表)兒茶素形成的原花青素隨著種仁發(fā)育逐漸積累，成為后期抗氧化性的主要來源。Robbins等[12]報道薄殼山核桃成熟種仁中兒茶素二聚體、三聚體、四至六聚體的含量分別為47.%、21.1%和14.8%，因此原花青素單體(兒茶素類物質)可能是薄殼山核桃酚類物質代謝途徑的重要前體物質。目前對于原花青素分支代謝通路，尤其是縮合過程的研究仍不透徹。筆者在薄殼山核桃果實品質形成期種仁的轉錄組研究中獲得了3個編碼DFR的unigene序列、2個編碼LAR的unigene序列和1個編碼ANR的unigene序列[13]。因此，本研究借助轉錄組結果，擬克隆薄殼山核桃兒茶素合成上游關鍵基因LAR，表兒茶素合成上游關鍵基因ANR，及兩者共同的上游關鍵基因DFR，并進行生物信息學分析和表達分析，以期為今后的基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為薄殼山核桃‘波尼’(‘Pawnee’)，栽培于南京市六合區(qū)南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司生產基地(118.91°E,32.33°N)，樹齡8～12 a，株行距為5.0 m×7.0 m，選取生長發(fā)育良好、樹勢相對一致的植株6株，2株為1個小區(qū)，重復3次。2014年于花后95～165 d每10 d每株按東、南、西和北4個方位，每個方位各取健康飽滿、無病蟲害的果實2個，即每株取果實8個，每個生物學重復包含16個樣品，每個采樣日期取樣48個。取樣后放入冰盒，迅速帶回實驗室。樣品-20 ℃冰箱過夜，剖開取種仁。將種仁在液氮中速凍混勻后，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

采用天根生化科技(北京)有限公司RNA simple Total RNA Kit試劑盒提取不同發(fā)育期的種仁總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和Onedrop光譜儀檢測確定總RNA的純度、濃度和完整性；采用HiScript? Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)進行反轉錄，具體操作見試劑盒使用說明書。

將‘波尼’ 115和135 d種仁cDNA 混合后用于薄殼山核桃CiDFR、CiLAR和CiANR基因的克隆。不同發(fā)育期的種仁cDNA用于實時熒光定量PCR分析。

1.2.2 基因的克隆與序列分析

借助轉錄組[12]所獲得的unigene序列設計引物：3個編碼DRF的unigene序列表達差異顯著，挑選其中高表達的1個DRF(comp 47692_c0)設計引物；2個編碼LAR的unigene序列無差異表達，挑選其中表達量較高的1個LAR(comp 59380_c0)設計引物。引物由上海英俊(Invitrogen)生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 薄殼山核桃引物序列

采用2 ×TaqMaster Mix 試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)進行PCR擴增，反應體系為：2 ×TaqMaster Mix 25 μL，上下游引物各2 μL (10 μmol/L)，模板cDNA 5 μL，補足ddH2O至終體積50 μL。

PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，重復35個循環(huán)后再72 ℃延伸10 min。

采用Biospin瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的片段進行回收純化，具體操作見試劑盒使用說明書。取3 μL回收純化后的DNA產物進行1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計檢測回收DNA產物的質量?；厥债a物與pMD?18-T載體(TaKaRa, Japan)連接并轉化到DH5α感受態(tài)細胞(實驗室保存)，挑取單克隆菌落經PCR驗證(反應程序和反應體系同上)后，對PCR產物長度合適的單克隆送南京集思慧遠生物公司測序。

1.2.3 生物信息學分析

克隆獲得的原花青素生物合成關鍵酶相關基因的cDNA或氨基酸序列使用不同的網絡程序或本地軟件進行相關生物信息學分析，即在NCBI數據庫中提交克隆序列，并運行BlastN查找同源序列(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；再用BioXM查找序列的最大開放閱讀框并推導氨基酸序列；而后用pI/Mw tool(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)、ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)和Kyte-Doolittle(http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1)分析相關蛋白的理化性質，同時將推導的蛋白序列用SMART預測蛋白結構域、GOR預測其二級結構(http://smart.embl-heidelberg.de/)；用DNAman 7.0進行多重序列比對，再用MEGA 5.1構建鄰接樹，均用500次重復進行Bootstrap檢驗，采用默認的Poisson correction模型和Complete deletion選項。

1.2.4 實時熒光定量PCR分析

采用Beacon designer 7.0軟件設計引物序列(表2)。以反轉錄獲得的cDNA稀釋15 倍作為模板，熒光定量PCR反應體系為：SYBR GreenReal-time PCR Master Mix (2x) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L) 1.0 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，加入ddH2O補足到20 μL。Real-time PCR反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，72 ℃單點檢測信號。PCR反應結束后進行熔解曲線分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，連續(xù)檢測信號。相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法。利用SPSS 17.0軟件分析數據，P<0.05。

表2 RT-qPCR 使用的引物

1.2.5 酚類代謝相關關鍵基因表達量與酚類代謝物含量的關聯(lián)分析

采用SPSS 19.0軟件進行相關性分析，之后采用MeV軟件繪制熱圖。繪制熱圖的數據包括：前期研究中測定的‘波尼’10個發(fā)育時期中的總酚含量、縮合單寧、總黃酮含量、兒茶素、表兒茶素、鞣花酸、沒食子酸、EGCG的含量和抗氧化性的動態(tài)變化[3]，以及CiDFR、CiLAR和CiANR基因在‘波尼’8個發(fā)育時期的表達量。

2 結果與分析

2.1 薄殼山核桃CiDFR基因的克隆和序列分析

通過PCR擴增得到了長度大約為1 200 bp的目的基因片段，測序結果為1 148 bp，其中包含1個開放閱讀框(ORF)長度為1 020 bp，編碼339個氨基酸。推導蛋白的分子質量為37.97 ku，等電點(pI)為5.91，疏水指數為-0.234，說明該蛋白偏親水性。該序列在GenBank數據庫中的登錄號為BankIt2133004 Seq3 MH613770。

薄殼山核桃CiDFR的氨基酸序列在NCBI上與其他植物的DFR氨基酸序列進行多重比對(圖1A)發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃CiDFR與核桃(Juglansregia)、歐洲栓皮櫟(Quercussuber)和棗(Ziziphusjujuba)等植物的同源性均大于80%。

CiDFR.薄殼山核桃Carya illinoensis；JrDFR. 核桃Juglans regia(XP_018821154.1)；QsDFR.歐洲栓皮櫟Quercus suber(XP_023872027.1)；LfDFR.楓香Liquidambar formosana(AGT28278.1)；VvDFR.葡萄Vitis vinifera(NP_001268144.1)；ZjDRF.棗Ziziphus jujuba(XP_015884708.1)；DzDFR.榴蓮Durio zibethinus(XP_022769017.1)；PbDFR.蘋果梨Pyrus×bretschneideri(XP_009365091.1)；MdDFR.蘋果Malus domestica(AAO39816.1)；PaDFR.歐洲甜櫻桃Prunus avium(AJO67977.1)；CmDFR. 英國山楂Crataegus monogyna(AAX16491.1)； FaDFR.草莓Fragaria×ananassa(AHL46451.1)；CoDFR.黃麻Corchorus capsalaris(OMO75166.1)；TcDFR.可可Theobroma cacao(EOY14811.1)；PlDFR.芍藥Paeonia lactiflora(AFI71899.1)。紅色與綠色下劃線分別為NADP(H)結合位點和底物特異性結合基序。兩個下拉箭頭表示保守位點。Red and green underlines represent the NADP(H)-binding site and the substrate specificity site。The two drop-down arrows indicate conserved sites.圖1 CiDFR氨基酸序列多重比對與系統(tǒng)進行分析Fig.1 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree constracting of amino acid homology of CiDFR in pecan

利用在線InterProScan程序檢索EBI的InterPro數據庫，發(fā)現(xiàn)該蛋白在N端存在一個由21個氨基酸組成的且高度保守的NAD (P)結合位點‘VTGASGFIGSWLIMRLLEHGY’[14]，其中富含甘氨酸(G)的NAD (P)結合位點區(qū)域(‘TGXXGXX’)允許NAD(P)進入，對結構域穩(wěn)定性起著關鍵作用。另外還存在一個由26個氨基酸構成的底物特異性結合的氨基酸基序“TVNVEEHQKPVYDESCWSDVEFCRAK”[15]，這段序列可以決定DRF底物的特異性，其中第103位的天冬酰胺(N) 和第114 位的谷氨酸(E) 直接影響DFR的底物特異性。進一步搜索NCBI的CDD數據庫，該基因在8～302 aa處含有FR_SDR_e結構域，在1～329 aa處含有PLN02650結構域。另外該蛋白還包含WcaG、HpnA、Epimerase等結構域，其中WcaG為核苷二磷酸糖表異構酶的保守結構域，主要在細胞壁和膜酯等的合成中發(fā)揮作用，Epimerase為NAD依賴表異構酶/脫氫酶家族共有的保守結構域，說明此蛋白屬于二氫黃酮醇還原酶家族。

利用MEGA 5.1對薄殼山核桃及高同源性植物進行進化樹構建發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃與核桃親緣關系最近，其次是歐洲栓皮櫟和棗，然后是薔薇科的蘋果(Malusdomestica)、草莓(Fragaria×ananassa)和甜櫻桃(Prunusavium)等植物(圖1B)。

2.2 薄殼山核桃CiLAR基因的克隆和序列分析

薄殼山核桃CiLAR序列長度為1 390 bp，包含1個長度為1 050 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼349個氨基酸。推導蛋白的分子質量為38.51 ku，等電點(pI)為5.77。平均親水性(GRAVY)值為-0.061，說明該蛋白是一種親水蛋白。該序列在GenBank數據庫中的登錄號為BankIt2133004 Seq4 MH613771。

氨基酸序列多重比對結果(圖2A)表明，薄殼山核桃CiLAR的氨基酸序列與核桃的同源性最高，其次為歐洲栓皮櫟、楊梅(Morellarubra)和榴蓮(Duriozibethinus)等。通過比較不同物種的LAR氨基酸序列，結合NCBI的CDD數據庫，發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃CiLAR蛋白中包含典型的苯(基)香豆素芐基醚還原酶(PCBER, phenylcoumaran benzylic ether reductase)的結構域，屬于短鏈脫氫/還原酶(SDR superfamily, short-chain dehvdrogenaselreductase)超家族成員。利用MEGA 5.1將薄殼山核桃LAR氨基酸序列與在NCBI中比對到的同源性最高的其他14種植物的LAR氨基酸序列構建進化樹發(fā)現(xiàn)，與DFR情況一致，薄殼山核桃與核桃、歐洲栓皮櫟、楊梅的LAR進化關系較近，與草莓、西洋梨(Pyruscommunis)、桃(Prunuspersica)和梅(Prunusmume)等薔薇科的植物的LAR進化關系較遠(圖2B)，說明同科植物基因在進化中相對保守，而不同科屬植物間的基因及氨基酸差異較大。

CiLAR.薄殼山核桃Carya illinoinensis；JrLAR.核桃Juglans regia(XP_018836086.1)；QsLAR.歐洲栓皮櫟Quercus suber(XP_023925115.1)；MrLAR.楊梅Morella rubra ((AIX02997.1)；DzLAR.榴蓮Durio zibethinus(XP_022777001.1)；HlLAR.啤酒花Humulus lupulus(AEV89964.1)；FaLAR.草莓Fragaria×ananassa(ABH07785.2)；TcLAR.可可Theobroma cacao(XP_017971349.1)；PcLAR.西洋梨Pyrus communis(ABB77696.1)；HbLAR.橡膠Hevea brasiliensis(XP_021682051.1);PpLAR. 桃Prunus persica(XP_007222274.1)；MnLAR. 桑樹Morus alba(XP_024019396.1)；VaLAR.兔眼藍莓Vaccinium ashei(BAM42674.1)；AcLAR.中華獼猴桃Actinidia chinensis var. chinensis(PSS13414.1)；PmLAR.梅Prunus mume(XP_008243165.1)。圖2 CiLAR氨基酸序列多重比對與系統(tǒng)進行分析Fig.2 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree constructed of amino acid homology of CiLAR in pecan

2.3 薄殼山核桃CiANR基因的克隆和序列分析

薄殼山核桃CiANR序列長度為1 104 bp，包含1個長度為1 014 bp的ORF，編碼337個氨基酸。推導蛋白的分子質量為36.35 ku，等電點(pI)為6.10。GRAVY值為0.064，說明該蛋白是一種疏水蛋白。該序列在GenBank數據庫中的登錄號為BankIt2133004 Seq5 MH613772。

通過NCBI的BLASTp分析發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃CiANR的氨基酸序列與核桃的同源性最高，其他同源性較高的植物有歐洲栓皮櫟、櫻桃李(Prunuscerasifera)、桃等，同源性均大于80%，多重比對結果見圖3A。通過NCBI的CDD數據庫預測保守結構域，發(fā)現(xiàn)該蛋白中也包含有與DFR類似的FR_SDR_e、WcaG、HpnA和Epimerase等保守結構域，同時還含有PLN00198(原花青素還原酶)的結構域。利用MEGA 5.1對薄殼山核桃和高同源性植物進行進化樹構建發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃與核桃的進化關系最近，而與茶(Camelliasinensis)、美麗葡萄(Vitisbellula)和葡萄(Vitisvinifera)的進化關系較遠(圖3B)。

CiANR.薄殼山核桃Carya illinoensis;；JrANR.核桃Juglans regia(XP_018805546.1)；QsANR.歐洲栓皮櫟Quercus suber(XP_023876696.1)；PcANR.紅葉李Prunus cerasifera(AKV89239.1)；PpANR.桃Prunus persica(XP_007213813.1)；VbANR.美麗葡萄Vitis bellula(AFG28175.1)；MrANR.楊梅Morella rubra(AIX02996.1)；PaANR.歐洲甜櫻桃Prunus avium(XP_021828308.1)；VvANR.葡萄Vitis vinifera(NP_001267885.1)；PnANR.黑楊Populus nigra(ART94427.1)；PmANR. 梅Prunus mume(XP_008224881.1)；GhANR.棉花Gossypium hirsutum(ABM64802.1)；MdANR.蘋果Malus domestica(NP_001280930.1)；TcANR.可可Theobroma cacao(XP_007025907.2)；CsANR. 茶Camellia sinensis(ADF43751.1)。圖3 CiANR氨基酸序列多重比對與系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree constructed of amino acid homology of CiANR in pecan

2.4 薄殼山核桃CiDFR、CiLAR和CiANR基因的表達特性

利用克隆得到的基因序列設計引物，采用熒光定量PCR檢測各基因在薄殼山核桃種仁發(fā)育中后期(95～165 d)各采樣點的表達量見圖4。

圖4 薄殼山核桃CiDFR、CiLAR和CiANR基因相對表達量Fig.4 Changes of relative expression of CiDFR, CiLAR and CiANR gene in pecan

從結果(圖4)中可看出，CiDFR與CiANR基因在種仁發(fā)育中期(95～105 d)表達量較高，之后快速下降至較低值。而CiLAR基因在95 d表達量較高，之后快速降低，在種仁發(fā)育后期(135～155 d)表達量又逐漸升高，在155 d回到峰值。

2.5 原花青素生物合成關鍵酶相關基因表達量與酚類代謝物含量的關聯(lián)分析

以8個發(fā)育時期的原花青素生物合成關鍵酶基因表達量與酚類代謝物含量數據為對象，進行相關性熱圖的繪制(圖5)。從熱圖中可看出，DFR與ANR顯著正相關，而LAR與DFR、ANR均不顯著相關。DFR和ANR均與TPC、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、EGCG和DPPH顯著正相關，而LAR除與ABTS顯著正相關外，與CT、TFC和鞣花酸為負相關，與其他變量均為正相關。綜上可看出，DFR、ANR表達量與酚類代謝物含量變化相關性較強，而LAR相關性較弱，即DFR、ANR表達量高時酚類物質含量也較高，DFR、ANR表達量低時酚類物質含量也較低。

DFR. CiDFR在qRT-PCR中的表達量 relative expression values by RT-qPCR of CiDFR；LAR.CiLAR在qRT-PCR中的表達量relative expression values by qRT-PCR of CiLAR；ANR.CiANR在qRT-PCR中的表達量relative expression values by qRT-PCR of CiANR；TPC.總酚含量total phenolic content；CT.縮合單寧condensed tannin；TFC.總黃酮含量total flavone content；C.兒茶素catechin；EC.表兒茶素epicatechin；EA.鞣花酸ellagic acid；GC.沒食子酸gallic acid；EGCG.表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯epigallocatechin gallate。圖5 薄殼山核桃酚類代謝相關關鍵基因表達量與酚類代謝物含量的相關性熱圖Fig.5 Heat map of the expression values of key candidate genes involved in phenolic synthesis of pecan with phenolic content

3 討 論

筆者前期通過對薄殼山核桃轉錄組數據的分析，篩選出可能影響薄殼山核桃原花青素生物合成的關鍵候選基因DFR、LAR和ANRunigene片段[12]。本研究克隆獲得了薄殼山核桃CiDFR、CiDFR和CiDFR基因cDNA片段，并對其進行了生物信息學分析和種仁發(fā)育過程中的表達分析。

DFR是原花青素生物合成途徑的上游關鍵酶，可將二氫黃烷醇還原為無色花色素。無色花色素是花色素苷、兒茶素和原花色素合成的共同前體，因此，DFR決定了花青素和原花青素通路的量，對植物體中兒茶素合成起關鍵作用。在本試驗中，通過PCR擴增獲得了編碼339個氨基酸的CiDFR開放閱讀框，經生物信息學分析發(fā)現(xiàn)該基因序列包含保守的NAD (P)結合位點和底物特異性結合位點，屬于二氫還原酶基因家族。DRF在還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的輔助下，可選擇性地催化3種二氫黃酮醇(DHK、DHQ和DHM)形成相應的不穩(wěn)定無色花青素。早期的研究發(fā)現(xiàn)DFR基因保守的底物特異性區(qū)域中，第134位氨基酸和第145位的氨基酸會直接影響到DFR的底物特異性。大多數植物的DFR在第l34位是天冬酰胺(N)或天冬氨酸(D)，在145位大多是谷氨酸(E)，能有效地把DHK還原為天竺葵色素。而一些植物的DFR，如矮牽牛(Petuniahybrida)和蘭花(Cymbidiumhybrida)，在134位和145位分別是天冬氨酸(D)和谷氨酰胺(Q)，可催化DHQ和DHM，但不能以DHK為底物[16-17]。在本試驗中，CiDFR的第103位為天冬酰胺(N)，第114 位為谷氨酸(E)，推測它們與其他植物的第134位和第145位相對應，能以DHK為底物。但Petit等[18]對葡萄DFR酶的晶體結構分析認為，DFR對底物的識別不能完全依賴于DFR酶的134位氨基酸。因此，后期還需要對其進行一系列酶活性分析進一步確定。

DFR作為原花青素和花青素合成途徑的關鍵酶在茶(Camelliaspp.)以及一些觀賞植物，尤其是觀花植物中得到了大量研究。當DFR功能遭到破壞后，植物體花青素和原花青素的含量明顯下降，而轉入DFR基因后花青素和原花青素的含量明顯上升[19-20]。不同發(fā)育階段植物DFR基因的特性表達具有一定的差異。DFR基因在白茶(Camelliasinensiscv. Fuding-dabaicha)萎凋32 h表達量最高，而后表達量逐漸降低[21]；葡萄風信子(Muscaribotryoides)的2個DFR基因，MaDFR2a和MaDFR2b都在花中優(yōu)勢表達，并在完全著色的花蕾(S3)時期表達量達到峰值，此后隨著花色變淡，表達量逐漸降低[22]；菊花(Chrysanthemumspp.)DFR基因在舌狀花初顯、伸長及花瓣伸長時表達量增高，而后隨著花序的開放表達量逐漸下降[23]；桂花(Qsmanthusfragrans)OfDFR基因的表達量隨花期呈現(xiàn)先上后下降的趨勢，初花期表達量最高，隨后顯著下降，盛花期表達水平降低[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，薄殼山核桃CiDFR基因在種仁發(fā)育中期(95～105 d)表達量高，之后顯著下降。這與前期轉錄組研究中編碼該DFR的unigene在種仁發(fā)育中期表達量最高相一致，說明了CiDFR在薄殼山核桃酚類代謝中非常活躍，發(fā)揮重要作用。

LAR基因以單拷貝或多拷貝存在，而翻譯后的LAR酶屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族和PIP家族[25]。筆者克隆獲得的CiLAR蛋白中包含典型的苯(基)香豆素芐基醚還原酶的結構域，證明屬于短鏈脫氫/還原酶超家族成員。LAR直接催化無色花青素(黃烷-3,4-二醇)轉化為兒茶素(C)和沒食子兒茶素(GC)[6]，其表達量的高低與兒茶素的含量直接相關。Li等[26]將玉米(Zeamays)中的 Lc(leafcolour)轉錄因子轉入蘋果植株中發(fā)現(xiàn)轉基因植物中LAR的表達量升高，且兒茶素大量積累。在轉LAR基因煙草中，外源LAR基因的過量表達并沒有使原花青素和兒茶素積累增加[27]。在模式植物擬南芥中未發(fā)現(xiàn)LAR，并只能合成表兒茶素[28-29]。大量研究表明，LAR基因具有很強的組織和時空表達的特異性。對金蕎麥(Fagopyrumdibotrys)根莖不同生長發(fā)育階段中LAR基因的表達量和類黃酮含量進行檢測發(fā)現(xiàn)，LAR與類黃酮的積累有關，但在營養(yǎng)生長階段LAR的表達量和類黃酮的積累與在生殖生長階段表現(xiàn)卻不同[30]。在葡萄種子和果皮中，兒茶素的含量與LAR基因表達量會隨著果實的發(fā)育呈現(xiàn)一致的規(guī)律性變化[31]。在筆者的研究中，CiDFR在薄殼山核桃種仁發(fā)育過程中呈現(xiàn)升高—降低—升高的趨勢，并與兒茶素和沒食子酸呈現(xiàn)顯著正相關，進一步說明LAR與兒茶素的合成緊密相關。

表兒茶素和表沒食子兒茶素(epicatechin gallate, EGC)分別是花青素還原酶(ANR)的直接產物。本研究預測的CiANR保守結構域與CiDFR基本類似，說明ANR與DFR結構與功能類似，這與擬南芥中的結果一致[10-11]。Xie等[32]將蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的MtANR基因和PAP1基因轉入煙草體內進行共表達，煙草葉片中兩個基因均有表達，兒茶素和表兒茶素含量增加。超量表達茶樹CsANR基因，轉基因煙草體內黃烷增加而花青素減少，花色變白[33]，說明表兒茶素與花青素的合成存在競爭關系，ANR的高表達會導致花青素含量減少而表兒茶素或原花青素含量增加。此外，ANR基因在不同時期表達量也有差異。葡萄的花和果實在發(fā)育的過程中，VvANR基因表達量呈現(xiàn)升高趨勢，原花青素積累，但在果實成熟的時候幾乎檢測不到VvANR基因的表達[34]。在轉錄層面上，CiANR的表達趨勢與CiDFR一致，其在種仁發(fā)育中期(95～105 d)表達量到達峰值，之后急劇下降。

CiDFR與CiANR基因在兒茶素代謝過程中的密切相關性經關聯(lián)分析也得到了印證，兩者與酚類代謝物含量變化相關性較強，而CiLAR基因與酚類代謝物含量變化的相關性較弱。在金花茶(Camelliapetelotii)的研究中表明，DFR與LAR在兒茶素代謝過程中密切相關，并且在不同苯丙氨酸添加量處理下，DFR與LAR表達量變化均與總兒茶素含量變化呈顯著正相關關系[35]。而本研究的結果與之不同，CiLAR與CiDFR的相關性較差，與種仁中兒茶素的變化趨勢也不一致。種仁中兒茶素的含量在酚類物質中最多，且在種仁發(fā)育中期最高，之后快速降低至較低值[3]。CiLAR基因的表達量在種仁發(fā)育的中期(95 d)及后期(155 d)均出現(xiàn)一個高峰，前者可能與兒茶素的大量合成有關，而后者說明CiLAR基因極有可能除了在兒茶素的合成途徑中發(fā)揮作用外，還在其他酚類物質的合成過程中發(fā)揮重要作用，這有待今后進行進一步研究。