程 曦，高亞琪*，劉進(jìn)峰，劉麗虹，王學(xué)偉，張 力

(1.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司 河北省阿維菌素生物技術(shù)重點實驗室，河北 石家莊 051530；2.石家莊市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，河北 石家莊 050000)

阿維菌素是阿維鏈霉菌經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的高效低毒生物殺蟲殺螨劑，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。在其發(fā)酵液含有的8種組分中，B1a組分的殺蟲效果最佳，是商品化阿維菌素的主要組分[1-2]，業(yè)內(nèi)以B1a含量作為衡量阿維菌素發(fā)酵生產(chǎn)水平的主要指標(biāo)。近年來，通過菌種改良、配方優(yōu)化及控制參數(shù)優(yōu)化來提高發(fā)酵效價，阿維菌素發(fā)酵生產(chǎn)水平大幅提升，特別是中國科學(xué)院微生物研究所運用合成生物學(xué)手段[3]，實現(xiàn)了對阿維鏈霉菌的精準(zhǔn)定位改良，B1a發(fā)酵效價達(dá)8 g·L-1，但通過增加放罐體積來提升阿維菌素發(fā)酵生產(chǎn)水平的研究報道卻很少。在阿維菌素的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，發(fā)酵液的黏度處于動態(tài)變化，50 h前發(fā)酵液黏稠，之后逐步稀化，總體表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì)，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行非牛頓流體性質(zhì)減弱，泡沫增多[4-5]，從而影響放罐體積。統(tǒng)計顯示，阿維菌素發(fā)酵放罐體積較小，約為發(fā)酵罐容積的70%，比同為放線菌的恩拉霉素、慶大霉素低 5%～10%，嚴(yán)重影響阿維菌素發(fā)酵生產(chǎn)水平的進(jìn)一步提高。

半連續(xù)發(fā)酵工藝，俗稱帶放工藝[6]，是指在分批發(fā)酵過程中放出部分含有目標(biāo)產(chǎn)物的發(fā)酵液，隨后補入相同體積的新鮮料液繼續(xù)發(fā)酵的方法。半連續(xù)發(fā)酵工藝在醋酸[7]、乙醇[8]和乳酸[9]等初級代謝產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，在次級代謝產(chǎn)物青霉素的工業(yè)生產(chǎn)中也已成熟應(yīng)用[10]，但在其它以次級代謝產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較少。除了操作復(fù)雜及容易染菌外，更重要的原因是，微生物次級代謝對發(fā)酵環(huán)境高度敏感[11]，補入新鮮料液會影響發(fā)酵環(huán)境、稀釋生物量，進(jìn)而影響發(fā)酵效率。

鑒于此，在前期研究[12]的基礎(chǔ)上，作者對阿維菌素半連續(xù)發(fā)酵中的補料工藝進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高阿維菌素生產(chǎn)水平。

1 實驗

1.1 菌種與設(shè)備

阿維鏈霉菌AV-67，河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司菌種保藏中心。

12 m3不銹鋼種子罐及發(fā)酵液制備罐(罐高4.20 m，罐直徑1.80 m，配備3層箭葉攪拌器，攪拌器直徑0.62 m)、120 m3碳鋼發(fā)酵罐(罐高9.22 m，罐直徑3.82 m，配備3層攪拌器，下層攪拌器HY(CD-6)為徑向流型半圓管結(jié)構(gòu)，中、上層攪拌器KSX(A-315)為軸向流型半圓管結(jié)構(gòu)；下層攪拌器直徑1.23 m，中、上層攪拌器直徑1.35 m；攪拌器間距2.55 m)，江蘇揚州永鋒工業(yè)設(shè)備安裝有限公司。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

(1)12 m3種子罐培養(yǎng)基(g·L-1)：淀粉25，黃豆餅粉8，酵母粉3，花生粉8，酵母膏3，氯化鈷0.02；消后體積8～9 m3。培養(yǎng)條件：溫度27～29 ℃，空氣流速350～550 m3·h-1，培養(yǎng)時間45～55 h。

(2)120 m3發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g·L-1)：黃豆餅粉25，玉米漿3，淀粉172，酵母粉10，輕質(zhì)碳酸鈣1.6，硫酸銨0.3；體積 92～93 m3。培養(yǎng)條件：溫度27～28 ℃，空氣流速2 600～2 950 m3·h-1，培養(yǎng)時間350～360 h，接種量V(種子液)∶V(發(fā)酵液)=7∶92。

(3)12 m3發(fā)酵液制備罐培養(yǎng)基(g·L-1)：淀粉200～220，黃豆餅粉16～20，酵母粉8～10，輕質(zhì)碳酸鈣1.8～2.0；消后體積 7～9 m3。培養(yǎng)條件：溫度27～28 ℃，空氣流速400～500 m3·h-1，發(fā)酵周期 40～60 h，種子液來源于培養(yǎng)100～200 h 發(fā)酵罐，接種量 1.0～1.5 m3。

1.3 測定方法

1.3.1 生物量的測定

精確量取50 mL發(fā)酵液于250 mL三角瓶中，加入適量助濾劑，置于水浴鍋中，升溫至約95 ℃，維持3～5 min；抽濾，濾餅用適量熱水洗滌后于102 ℃烘干至恒重，降至室溫稱重(W2，g)。按式(1)計算生物量(g·L-1)：

生物量=(W2-W0-W1)×20

(1)

式中：W0為濾布質(zhì)量，g；W1為助濾劑質(zhì)量，g；20為換算系數(shù)。

1.3.2 B1a效價的測定

精確量取2 mL發(fā)酵液于50 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲浸提10～20 min，用甲醇定容，過濾，進(jìn)行HPLC分析。記錄峰面積，采用外標(biāo)法按式(2)計算B1a 效價(μg·mL-1)：

(2)

色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃，流動相甲醇-水(體積比9∶1)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長246 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.4 半連續(xù)發(fā)酵中補料工藝的優(yōu)化

阿維菌素是阿維鏈霉菌生長繁殖到一定階段才開始合成的，其發(fā)酵培養(yǎng)過程經(jīng)歷生長期、穩(wěn)定期和產(chǎn)素期。在阿維菌素的工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)過程中，通常50 h時測定起步效價(200～300 μg·mL-1)，之后阿維菌素合成速率逐步加快，且效價幾乎呈線性升高[13]。發(fā)酵罐放罐時(批號記作Fn)，放出培養(yǎng)(300±20) h的第Fn+1批或第Fn+2批體積分?jǐn)?shù)5%的發(fā)酵液，然后補入相同體積培養(yǎng)40～60 h的發(fā)酵液繼續(xù)培養(yǎng)至放罐，考察半連續(xù)發(fā)酵中補入發(fā)酵液對放罐效價和生物量的影響，并比較放罐效價與回歸效價的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 補入發(fā)酵液對放罐效價的影響

在阿維鏈霉菌AV-67發(fā)酵產(chǎn)阿維菌素的過程中，50 h 時測定起步效價，在發(fā)酵培養(yǎng)289 h時放出4 m3(體積分?jǐn)?shù) 5%)發(fā)酵液，同時補入相同體積的培養(yǎng)47 h的發(fā)酵液繼續(xù)培養(yǎng)至放罐，效價隨培養(yǎng)時間的變化趨勢見圖1。

圖1 效價隨培養(yǎng)時間的變化趨勢Fig.1 Change trend of titer with culture time

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，效價升速很快，達(dá)到24.34 μg·mL-1·h-1；僅在補入發(fā)酵液的289 h至311 h時間段內(nèi)，效價升速明顯減慢，僅為20.14 μg·mL-1·h-1。這可能與補入發(fā)酵液的稀釋作用有關(guān)。

根據(jù)補入發(fā)酵液前289 h的效價與培養(yǎng)時間的線性回歸曲線(圖 2)，計算351 h時回歸效價為7 464 μg·mL-1，較放罐效價(7 673 μg·mL-1)低209 μg·mL-1。后續(xù)試驗也重復(fù)了這一現(xiàn)象，即發(fā)酵罐放罐后補入相同體積的發(fā)酵液不會對放罐效價造成負(fù)影響。這是由于，補入發(fā)酵液中的菌絲體本身具有次級代謝能力，能立刻進(jìn)行阿維菌素的生物合成；此外，補入發(fā)酵液除了減輕代謝產(chǎn)物的抑制、保持菌體活力外，由于其碳氮比高，為后期阿維菌素的生物合成提供了更多能量支持，有利于效價的持續(xù)快速提升。在不影響培養(yǎng)周期的前提下，補入發(fā)酵液增加了放罐體積、提高了放罐效價，進(jìn)而提高了罐批產(chǎn)量。

圖2 補入發(fā)酵液前效價對培養(yǎng)時間的線性回歸曲線Fig.2 Linear regression curve of titer with culture time before adding fermentation broth

2.2 補入發(fā)酵液對放罐生物量的影響

阿維菌素發(fā)酵過程中，除了控制黏度、pH值等理化指標(biāo)外，還應(yīng)該對生物量、菌絲形態(tài)等生物指標(biāo)進(jìn)行控制。生物量主要與培養(yǎng)基配方特別是氮源含量有關(guān)[14]，也與空氣流量等有關(guān)。連續(xù)統(tǒng)計7批次半連續(xù)發(fā)酵罐批的放罐生物量和效價，結(jié)果見圖3。

圖3 生物量與效價的關(guān)系Fig.3 Relationship between biomass and titer

由圖3可知，7批次半連續(xù)發(fā)酵罐批的生物量在46～48 g·L-1之間，平均生物量為46.9 g·L-1，平均效價為7 491 μg·mL-1，且在此范圍內(nèi)生物量與效價無明顯相關(guān)性。這可能與測定方法有關(guān)，本研究采用的測定方法不能消除死亡菌體對測定結(jié)果的影響。表明，放罐后補入培養(yǎng)40～60 h的發(fā)酵液，不會影響放罐生物量。

2.3 連續(xù)化驗證

某發(fā)酵車間月度8批次放罐效價和單罐產(chǎn)量見圖4。

圖4 試驗組和對照組效價、單罐產(chǎn)量的對比Fig.4 Comparison of titer and yield of single tank between test group and control group

2.4 討論

2.4.1 發(fā)酵液培養(yǎng)罐

研究表明，阿維鏈霉菌遺傳穩(wěn)定性較差[15]，工業(yè)化生產(chǎn)阿維菌素通常采用二級發(fā)酵工藝。標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)備配置為小容積的種子罐和大容積的發(fā)酵罐，原設(shè)計發(fā)酵罐與種子罐數(shù)量比為2∶1。由于阿維菌素發(fā)酵周期長達(dá)15 d，而種子罐培養(yǎng)周期僅2～3 d，導(dǎo)致種子罐出現(xiàn)一定程度的空置，而且隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，種子罐的空置率更高。如果將種子罐作為發(fā)酵罐使用，由于發(fā)酵周期長、泡沫多、放罐體積小，導(dǎo)致產(chǎn)量低、生產(chǎn)效率不高。 為實現(xiàn)產(chǎn)能最大化，將空置的種子罐作為發(fā)酵液培養(yǎng)罐，用于補充半連續(xù)發(fā)酵罐批發(fā)酵液，相當(dāng)于將種子罐發(fā)酵周期由350～360 h縮短至40～60 h，種子罐利用率相應(yīng)提高了6～7 倍。

2.4.2 發(fā)酵液菌絲形態(tài)

與發(fā)酵罐的種子(來源于種子罐)不同，補入半連續(xù)發(fā)酵罐批發(fā)酵液的種子來源于培養(yǎng)100～200 h發(fā)酵罐，所以不需特別制備，來源方便。而且相關(guān)研究[12]也表明，該時期菌絲體具有菌絲生長與產(chǎn)物合成同時進(jìn)行的混合型發(fā)酵特征，補入半連續(xù)發(fā)酵罐后，能夠立刻合成阿維菌素。培養(yǎng)40 h的補入發(fā)酵液菌絲鏡檢照片(圖 5a)顯示 ，菌絲體原生質(zhì)飽滿、亞甲基藍(lán)染色深、菌絲長；而發(fā)酵罐后期的菌絲(圖 5b)呈現(xiàn)明顯的原生質(zhì)匱乏、亞甲基藍(lán)染色淺、 斷菌絲多、菌體活力缺乏。表明，發(fā)酵罐放罐后補入新鮮發(fā)酵液(即更有活力的菌絲體)，有利于發(fā)酵效價的提高。

圖 5 培養(yǎng)40 h的補入發(fā)酵液菌絲(a)及發(fā)酵罐后期菌絲(b)的鏡檢照片(16×100)Fig.5 Microscopic images of mycelia in added fermentation broth cultured for 40 h(a) and mycelia in fermentation tank at later stage(b)(16×100)

2.4.3 循環(huán)半連續(xù)發(fā)酵工藝

阿維菌素發(fā)酵液總體表現(xiàn)為非牛頓流體性質(zhì)。在阿維鏈霉菌發(fā)酵進(jìn)程中，菌絲形態(tài)有所變化，發(fā)酵液的非牛頓流體性質(zhì)逐步減弱，發(fā)酵液稀化，泡沫逐漸增多。特別是華北地區(qū)夏季空氣相對濕度大(60%～70%)，盡管完善壓縮空氣制造設(shè)備的除水設(shè)施，但受限于氣液分配定律，壓縮空氣相對濕度還是明顯高于冬季(20%～30%)。夏季發(fā)酵液液位上升更快，嚴(yán)重時發(fā)酵培養(yǎng)至120 h就需放出部分發(fā)酵液，以防止“逃液”。在這一過程中，可將放出的發(fā)酵液補入半連續(xù)發(fā)酵罐，放罐效價不受影響，即為循環(huán)半連續(xù)發(fā)酵工藝。同時研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵后期發(fā)酵液補入發(fā)酵前期罐時，放罐效價較低； 而當(dāng)發(fā)酵前期發(fā)酵液補入發(fā)酵后期罐時，放罐效價卻不受影響，從側(cè)面反映了發(fā)酵后期補入更具活力的菌絲體有益于發(fā)酵效價的提高。

3 結(jié)論