王艷珍，陳 亮

(武漢大學生命科學學院，湖北 武漢 430072)

腫瘤是一種生長不受控制的組織，不同類型的腫瘤機理差異很大，但幾乎所有的腫瘤細胞都具有若干共同特征，包括持續(xù)增殖、防止細胞凋亡和基因組不穩(wěn)定等[1]。DNA復制調(diào)控異常和DNA損傷會造成復制壓(replication stress)，是基因組不穩(wěn)定的來源，也是癌前細胞和癌細胞的重要特征[2]。相較于正常細胞，腫瘤細胞在DNA的復制過程中會出現(xiàn)復制起始(replication origin)紊亂、S期檢查點(checkpoint)異常、復制叉暫停(replication fork stalling)等現(xiàn)象[2]，并具有增殖速度快、細胞周期短、復制潛力無限等特征。因此，靶向DNA復制調(diào)控抑制腫瘤細胞增殖成為近年來腫瘤治療的重要手段，多種相關(guān)小分子藥物已進行臨床試驗并取得了較好的研究成果。作者在簡單介紹DNA復制及其調(diào)控機制的基礎(chǔ)上，闡述DNA復制調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，并對DNA復制調(diào)控在腫瘤治療新方法研究中的作用進行探究，以期為腫瘤治療提供新方向。

1 DNA復制及其調(diào)控機制

完整且準確的DNA復制過程是細胞增殖和維持基因組穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)，任何延遲、阻礙或終止DNA復制的缺陷均會導致DNA復制異常。因此，DNA復制調(diào)控的每個階段都極為重要，其對防止遺傳改變的積累、維持細胞生存和組織健康具有重要意義。

1.1 DNA復制

基因組DNA復制分為起始、延伸與終止3個過程。DNA復制起始的基因組區(qū)域稱為復制起始位點，該區(qū)域能被特定蛋白質(zhì)識別并結(jié)合形成復制前復合物(pre-replication complex，pre-RC)，即為復制起始的許可(replication origin licensing)，其被激活后稱為復制起始的起火(replication origin firing)。在G1期，由復制起始識別復合物(origin recognition complex，ORC)亞基ORC1～6形成的復合體被招募組裝到復制起始位點，然后募集ATP酶和CDC6并與之結(jié)合，進而將DNA復制因子CDT1加載到復制起始位點，進一步共同募集微型染色體維持(MCM)復合物以形成pre-RC[3]。在G1期向S期轉(zhuǎn)變時，DDK和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)磷酸化多種復制因子MCM10、CDC45、treslin、GINS、TOPBP1和DNA聚合酶ε(pol ε)以促進它們募集到復制起始位點上，并直接磷酸化MCM2～7復合物，形成CDC45·MCM2～7·GINS(CMG) 復合物，激活MCM復合物的解旋酶活性，從而完成pre-IC的形成[3-4]。進入S期后，MCM復合物誘導其它復制激活相關(guān)蛋白質(zhì)如復制因子C(replication factor C，RFC)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、復制蛋白A(replication protein A，RPA)和其它DNA聚合酶的募集，將pre-IC轉(zhuǎn)化為2個含有復制體的復制叉，復制叉從激活的起點向相反方向移動完成復制起始位點的激活[3]。真核生物中參與DNA復制起始的因子列于表1。

復制起始激活后，MCM10和酸性核質(zhì)DNA結(jié)合蛋白1(acidic nucleoplasmic DNA-binding protein 1，AND-1)募集DNA聚合酶α引物酶(pol α primase)，催化合成短的核糖核酸(RNA)引物，引導DNA合成；隨著CMG解旋酶向相反方向移動，2個復制叉與polα引物酶、pol δ、pol ε和PCNA結(jié)合以促進DNA合成[5]；最后，當2個相鄰的復制叉從相反的方向相互接近時，拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(topoisomerase Ⅰ，Topo Ⅰ)和TopoⅡ會相繼釋放扭轉(zhuǎn)壓力，復制叉之間的所有蛋白組織(包括核小體)被移除，當最后一個岡崎片段的雙鏈DNA合成并連接后便完成DNA的復制終止[6]。

表1 真核生物中參與DNA復制起始的因子

1.2 DNA復制調(diào)控機制

DNA復制過程由眾多調(diào)控因子相互作用共同維持，包括細胞周期及其檢查點調(diào)控、DNA復制與轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)控、多聚ADP-核糖基化修飾機制等。

1.2.1 細胞周期及其檢查點調(diào)控

細胞周期蛋白(cyclin)、CDKs和CDK抑制因子(CDK inhibitors，CKIs)是參與細胞周期調(diào)控的主要因子。CDKs與不同周期表達的細胞周期蛋白相結(jié)合，其中CDK4是G1期重要分子，細胞周期蛋白D1能將其激活，導致細胞從G1期加速進入S期。林宇靜等[7]發(fā)現(xiàn)，在瘢痕癌中細胞周期蛋白D1和CDK4的表達量升高，導致細胞快速增殖，從而誘發(fā)癌癥。在G2晚期和M早期，細胞周期蛋白A與CDK1結(jié)合后使細胞向M期進入。CKIs會抑制細胞周期蛋白與CDKs結(jié)合，導致細胞周期無法正常運行。因此，細胞周期蛋白、CDKs、CKIs之間的相互協(xié)調(diào)是保證細胞周期正常運行的關(guān)鍵。

細胞周期檢查點是監(jiān)測細胞周期主要事件的順序、完整性和保真度的機制。在檢測到DNA損傷后，毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變基因(ATM)和ATM/Rad3相關(guān)蛋白基因(ATR)可以將信號傳導至整個通路的核心——CHK1；ATR磷酸化激活CHK1，后者磷酸化CDC25，形成ATR-CHK1-CDC25通路，加速CDC25的泛素化降解，最終使細胞周期停滯[8]；ATM亦可以通過磷酸化CHK1的Ser317位點激活整個信號通路[9]。在發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷(double-strand breaks，DSBs)時，ATM-CHK2-CDC25信號通路激活不同的細胞周期檢查點，對DNA損傷進行修復，使細胞周期進程發(fā)生阻滯[10-11]。

1.2.2 DNA復制與轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)控

DNA的復制和轉(zhuǎn)錄都是細胞內(nèi)高頻的生物學過程，二者共用DNA模板，并且早期DNA復制和轉(zhuǎn)錄都發(fā)生在活性染色質(zhì)區(qū)域，可能導致轉(zhuǎn)錄-復制沖突(transcription-replication conflicts，TRCs)，破壞基因組穩(wěn)定性和細胞活性，是癌細胞的標志[2]。細胞如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄-復制沖突仍是待闡明的生物學問題，清楚的是細胞依賴多種機制避免或解決沖突。

復制叉的移動方向和轉(zhuǎn)錄的延伸方向一致所造成的沖突稱為同向(co-directional，CD)的轉(zhuǎn)錄-復制沖突，反之稱為反向(head-on，HO) 的轉(zhuǎn)錄-復制沖突[12]，其中，HO-TRCs對細胞危害更大，會造成染色體缺失、重組和細胞死亡[13]。為減少HO-TRCs，細菌基因組傾向于將一些必要且高頻轉(zhuǎn)錄的基因與復制同向進行[14]。在哺乳動物細胞中，早期復制起始發(fā)生在開放的染色質(zhì)區(qū)域并且與轉(zhuǎn)錄延伸相互排斥，中頻轉(zhuǎn)錄的基因組區(qū)域通常與高復制起始頻率相關(guān)，而在高頻轉(zhuǎn)錄的基因組區(qū)域中檢測到的復制起始事件非常少[13-14]。復制起始因子激活之前在染色質(zhì)上的重新分布是減少HO-TRCs的另一種機制，在果蠅中，MCM復合物的基因組分布受轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)域富集，但在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域減少[15]。RNA聚合酶Ⅱ促進MCM復合物重新分配在非轉(zhuǎn)錄區(qū)域，避免轉(zhuǎn)錄區(qū)域早期DNA復制的起始[14]。Gros等[15]發(fā)現(xiàn)，在酵母中， G1期加載在轉(zhuǎn)錄終止上的MCM復合物在終止位置突變后被RNA聚合酶重新定位到新轉(zhuǎn)錄區(qū)域之外。在S期，真核生物將基因組中復制區(qū)劃分出來，因此，DNA復制與轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)控機制發(fā)生在DNA復制過程的不同區(qū)域、不同時間[16]。

1.2.3 多聚ADP-核糖基化修飾機制

多聚ADP-核糖基化是由多聚ADP-核糖聚合酶(PARPs)催化和轉(zhuǎn)移的動態(tài)可逆翻譯后修飾。PARP1是PARPs家族主要成員，負責約90%多聚ADP-核糖基(poly-ADP-ribose，PAR)的修飾[17]。PARPs介導煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中的ADP-核糖基(ADP-ribose，ADPR)以單個或多個形式與底物蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基發(fā)生共價連接反應形成單ADP-核糖基化(mono ADP-ribosylation，MARylation)和多聚ADP-核糖基化(poly-ADP-ribosylation,PARylation)[18]。PAR修飾調(diào)控細胞內(nèi)多種生物學過程，包括復制、DNA修復、轉(zhuǎn)錄、代謝、應激和免疫反應等[19-20]。

研究報道，PARPs活性在復制叉處[21]和新復制的染色質(zhì)區(qū)域中[22]增強。PARP1與參與DNA復制的多種蛋白質(zhì)如pol α、pol δ、解旋酶、拓撲異構(gòu)酶和PCNA相互作用并刺激其活性[23-24]，且這些蛋白很多被PAR修飾，表明PARP1可能作為傳感器調(diào)控復制叉進程，或通過直接與復制蛋白結(jié)合催化其形成PAR來調(diào)控[23]。Hanzlikova等[24]發(fā)現(xiàn)，S期DNA復制位點檢測到的PAR信號在未連接的岡崎片段產(chǎn)生，可能作為單鏈斷裂修復的“備用”機制，促進岡崎片段連接。PARP1還可調(diào)控復制壓下DNA復制叉的延伸速率，抑制PARP1可反轉(zhuǎn)小分子藥物對復制叉進程的抑制[25-26]。在未受干擾的細胞中，PARPs的抑制或敲除不僅導致復制叉延伸速率的加快，并檢測到復制起始之間的距離增大[27]，進一步驗證PAR修飾對復制叉和復制起始的調(diào)控作用。

另外，ADP-核糖基化活性也有助于PARP1修復DNA損傷和維持基因組穩(wěn)定性。作為DNA損傷應答(DNA damage response，DDR)中的信號傳感器，PARP1與DNA單鏈斷裂 (single-stranded DNA breaks，SSBs)、DNA缺口或DSBs結(jié)合，發(fā)生結(jié)構(gòu)變化并激活其催化功能，在自身和鄰近蛋白進行PAR修飾，促進如X-線修復交叉互補基因1(X-ray repair cross complementing group1，XRCC1) 等DNA修復因子的募集，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)并促進DNA損傷修復[28]。由于PAR修飾在多種DNA損傷中的修復作用，PARPs抑制劑的潛在抗腫瘤作用逐步被揭示并在臨床治療中被應用。

2 DNA復制調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用

2.1 腫瘤的特點與形成原因

人類腫瘤形成是一個多步發(fā)展的過程[29]，受物理、化學、生物等因素誘導?；蚪M不穩(wěn)定性是驅(qū)動腫瘤發(fā)展并獲得基因突變和選擇性生長的重要因素[30]。例如某些環(huán)境化合物分子與DNA形成加合物，有可能造成特定腫瘤抑制基因或原癌基因突變和DNA復制壓，促使細胞癌化并持續(xù)增殖。

2.2 DNA復制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用

DNA復制異常體現(xiàn)在持續(xù)復制、復制叉停滯和崩潰、DNA損傷及DDR異常、檢查點和細胞周期失活、DNA損傷修復錯誤、復制重啟錯誤等。這些異常是推動腫瘤發(fā)展和基因組不穩(wěn)定的重要因素。腫瘤細胞具有無限的復制潛力，并規(guī)避復制異常缺陷。例如細胞周期調(diào)控機制在人類腫瘤中經(jīng)常失調(diào)，導致腫瘤細胞周期蛋白的異常激活。研究[31]表明，失調(diào)的CDKs誘導非計劃性增殖和基因組不穩(wěn)定性，DNA損傷和有絲分裂檢查點的改變經(jīng)常導致CDKs活性增強，從而驅(qū)動腫瘤細胞周期進程。核心細胞周期機制內(nèi)的遺傳損傷導致其過度激活，在大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并且腫瘤細胞中組成性有絲分裂信號傳導和對抗有絲分裂信號的缺陷反應導致細胞惡性增殖[32-33]。

DNA損傷修復機制在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用。鑒于腫瘤細胞形成多種DNA損傷及基因組不穩(wěn)定性，其生存更依賴DDR途徑。但與正常細胞不同的是，大多數(shù)腫瘤細胞會失去一個或多個DDR途徑或能力，從而導致對剩余途徑的更大依賴[34]。近年來，腫瘤的靶向治療被更多地應用到臨床，更多靶向DNA復制的小分子藥物也被應用到臨床。

3 DNA復制調(diào)控在腫瘤治療新方法研究中的作用

3.1 腫瘤的靶向治療

分子生物學和腫瘤生物學的進步極大地改變了腫瘤治療方式，從傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療到靶向治療、免疫治療和微創(chuàng)治療等，不斷涌現(xiàn)出新的治療方法。其中分子靶向治療是一種利用靶向特定致病分子的藥物進行治療的手段，具有快速有效和便于推廣的優(yōu)勢。理想靶點的識別對于靶向療法的成功開發(fā)至關(guān)重要，腫瘤細胞特異性基因/蛋白是常見靶標[35]。通過了解腫瘤特定分子靶點的生理學特征，可以確定抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在分子策略。復制起始異常、DNA損傷、腫瘤特異性DNA修復缺陷等正常細胞的差異性特征，為腫瘤的分子靶向治療提供了新方向。

3.2 利用DNA復制起始開發(fā)腫瘤治療新方法

靶向DNA復制起始是腫瘤治療的重要方向。DNA復制起始蛋白常在腫瘤細胞中高表達，而在非增殖正常細胞中不表達或低表達。因此，DNA復制起始蛋白可能成為腫瘤治療的潛在靶點，如靶向細胞分裂周期7(cell division cycle 7，CDC7)激酶[36-39]可有效且特異性殺傷腫瘤細胞，其作用機制為：在抑制CDC7后，正常細胞能夠利用細胞周期檢查點將細胞停滯在G1/S期交界處并暫停DNA復制，而腫瘤細胞由于缺失細胞周期檢查點依賴的基因，進入S期后沒有足夠復制起始位點的激活而造成DNA復制異常，最終造成腫瘤細胞死亡。目前，多家生物制藥公司已啟動CDC7藥物開發(fā)計劃并進入早期臨床試驗[40-41]。Feng等[42]運用靶向3個人類DNA復制起始基因hCdc6、hMcm2和hCdc45的反義寡核苷酸和siRNA分子，顯著降低靶基因產(chǎn)物的mRNA和蛋白質(zhì)水平，并阻止了DNA復制和細胞增殖，導致p53陽性和陰性腫瘤細胞凋亡，而不會導致正常細胞死亡。另有研究表明，抑制復制起始蛋白CDT1p活性的雙核蛋白片段可以抑制DNA復制和細胞增殖，并導致腫瘤細胞凋亡[43]，siRNA對ORC6p(起始蛋白ORC的一個亞基)的基因沉默導致細胞周期失調(diào)，包括有絲分裂阻滯和多核細胞出現(xiàn)[44]，進一步證明抑制復制起始蛋白活性的小分子是潛在的抗腫瘤藥物。

3.3 利用DNA復制應激開發(fā)腫瘤治療新方法

DNA復制應激是導致腫瘤基因組不穩(wěn)定的主要因素之一[45-46]。許多腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene，TSG)的突變都會引發(fā)DNA復制應激并激活ATR、CHK1和酪氨酸激酶WEE1等以確保復制叉的穩(wěn)定和修復，并防止異常復制的基因組進入有絲分裂M期[47-48]。因此，抑制DNA復制應激和修復DNA損傷是提高腫瘤治療效果的途徑之一。

很多腫瘤細胞G1檢查點失調(diào)，使其依賴于由ATR-CHK1通路調(diào)控的S/G2檢查點。除調(diào)節(jié)細胞周期檢查點外，ATR-CHK1在復制應激時能夠保護細胞免受DNA損傷、穩(wěn)定停滯的復制叉、防止其崩潰和DSB形成、控制補償性起始位點的激活并促進同源重組[49-50]，這些特性使其成為治療干預的潛在目標。目前，靶向ATR和CHK1的抑制劑已經(jīng)分別進入臨床Ⅱ期和Ⅰ期。DNA復制應激時CHK1還可以激活WEE1，使其抑制CDK1，從而將細胞阻滯在G2/M過渡期，靶向WEE1的抑制劑AZD1775也已進入臨床Ⅱ期[45]。此外，更多在DNA復制應激中起調(diào)控作用的蛋白抑制劑也不斷涌現(xiàn)，包括TopoⅠ和TopoⅡ抑制劑、烷化劑和鉑化合物等。

3.4 PARPi在腫瘤治療中的應用

PARPs抑制劑(PARPi)是以合成致死的理念被用于BRCA1/2突變的腫瘤治療[51]。BRCA1和BRCA2是介導DNA雙鏈斷裂后同源重組(homologous recombination，HR)修復的關(guān)鍵蛋白，BRCA1/2突變同時抑制PARPs即同時阻斷單鏈修復和HR修復對腫瘤細胞致死，為PARPi的理論基礎(chǔ)。此外，PARPs參與并調(diào)控許多DNA損傷修復的過程包括DNA單鏈斷裂(SSB)、雙鏈斷裂(DSB)、堿基切除修復(BER)和核苷酸切除修復(NER)等[45]，而腫瘤細胞更依賴PARPs的修復作用，因此，PARPi在腫瘤治療方面的應用潛力巨大。

目前，有4種PARPi(奧拉帕利、盧卡帕利、尼拉帕利和他拉唑帕利)已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準，主要用于治療卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等，還有很多PARPi正處于不同的臨床試驗階段，以治療更多依賴PARPs的腫瘤。PARPi除單藥使用外，與化療或放療聯(lián)合亦能提高腫瘤細胞化療或者放療的敏感性，并一定程度上克服了耐藥性，如PARPi與ATR、血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、CDKs、WEE1、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)等激酶抑制劑聯(lián)用均表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抗腫瘤作用。PARPi自上市以來顯著改善了部分腫瘤的治療現(xiàn)狀，使患者受益。因此，尋找更適合PARPi使用的腫瘤生物標志物、優(yōu)化PARPi聯(lián)合治療方案、克服耐藥性以及降低毒副作用已成為腫瘤治療的研究熱點。

4 展望

DNA復制失調(diào)是腫瘤基因組不穩(wěn)定的主要驅(qū)動因素，靶向DNA復制的藥物成為腫瘤治療的重要手段。目前這些藥物的設(shè)計主要是針對腫瘤細胞相對于正常細胞表現(xiàn)出的脆弱性，如腫瘤細胞更加依賴某些DDR通路或DNA復制起始和細胞周期調(diào)控的蛋白。因此，找到腫瘤細胞更多的補償性DDR通路和腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵性脆弱點將為腫瘤治療提供更多可能。