李麗萍，馬力通,2*，楊世波

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.生物煤化工綜合利用內(nèi)蒙古自治區(qū)工程研究中心，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

淀粉質(zhì)原料[1]、糖蜜原料[2]已廣泛用于制備生物乙醇，以木質(zhì)纖維素為原料的第二代生物乙醇對(duì)實(shí)現(xiàn)碳中和目標(biāo)具有重要意義[3-4]。草本泥炭由多種草本植物殘?bào)w組成，含有豐富的纖維素、半纖維素，適合于生物乙醇的制備。張學(xué)才等[5]對(duì)酸法水解泥炭工藝及其水解液發(fā)酵制乙醇及單細(xì)胞蛋白進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酵母在泥炭水解液配制的培養(yǎng)基中繁殖力很強(qiáng)，且發(fā)酵濾液中含有乙醇。

目前，我國的泥炭礦床類型主要以富營養(yǎng)草本泥炭為主，木本泥炭為輔，蘚類泥炭次之[6]，常被用作園藝基質(zhì)[7]和有機(jī)肥料[8]。路亞楠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，酸預(yù)處理能使泥炭的比表面積顯著增大、孔隙率提高，適合微生物定殖；李珺等[10]研究發(fā)現(xiàn)，稀硫酸預(yù)處理泥炭能降解1.17%纖維素、4.44%半纖維素及9.37%木質(zhì)素；黃俊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，糖化發(fā)酵是木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵步驟，對(duì)乙醇產(chǎn)量起決定性作用。在此，作者將草本泥炭用稀硫酸預(yù)處理后，經(jīng)纖維素酶酶解、酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝，擬為乙醇生產(chǎn)提供新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

草本泥炭，取自吉林；耐高溫釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

K2Cr2O7、乙醇、硫酸、C6H12O6，分析純，天津化學(xué)試劑三廠。

高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV765型紫外可見分光光度計(jì)，上海精科。

1.2 草本泥炭酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇

將草本泥炭粉碎，過100目篩；稱取草本泥炭粉末10.0 g，按固液比1∶5(g∶mL)加入5%稀硫酸于錐形瓶中，密封后置于100 ℃水浴中加熱120 min，取出冷卻至室溫；調(diào)節(jié)pH值至4.8，加入纖維素酶3.0 g，于50 ℃下磁力攪拌8 h，然后迅速置于沸水浴中使纖維素酶失活，即得酶解液；調(diào)節(jié)酶解液pH值，加入一定量的耐高溫釀酒酵母，充分?jǐn)嚢韬?，置于一定溫度水浴中發(fā)酵一定時(shí)間，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在600 nm處吸光度，根據(jù)乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙醇體積，按下式計(jì)算酒精度(100 mL溶液中乙醇的體積，%vol)。本實(shí)驗(yàn)用酒精度反映草本泥炭酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效率。

式中：V0為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的乙醇體積，mL；c為乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，此處為0.02 g·mL-1；V為樣品溶液的體積，mL；V1為樣品溶液稀釋后的體積，mL；ρ為20 ℃時(shí)乙醇密度，此處為0.79 g·mL-1。

1.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察酵母加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)、發(fā)酵液pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)、發(fā)酵溫度(34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃、42 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(48 h、54 h、60 h、66 h、72 h)對(duì)草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酵母加量、發(fā)酵液pH值、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為考察因素，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇工藝，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酵母加量對(duì)草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

在發(fā)酵液pH值為4.0、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，考察酵母加量對(duì)酒精度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酵母加量對(duì)酒精度的影響Fig.1 Effect of yeast dosage on alcoholicity

在發(fā)酵過程中，酵母可以將發(fā)酵液中的還原糖轉(zhuǎn)化為乙醇[12]。由圖1可知，隨著酵母加量的增加，酒精度先升高后降低；當(dāng)酵母加量為0.05%時(shí)，酒精度為1.86%vol，此時(shí)酵母不能充分利用發(fā)酵液中的糖分，即對(duì)草本泥炭的利用率較低；當(dāng)酵母加量增至0.15%時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為2.42%vol；當(dāng)酵母加量繼續(xù)增至0.25%時(shí)，酒精度降至1.99%vol，這是由于，過量的酵母會(huì)導(dǎo)致菌種老化[13]。因此，酵母加量以0.15%較為適宜。

2.1.2 發(fā)酵液pH值對(duì)草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

在酵母加量為0.15%、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，考察發(fā)酵液pH值對(duì)酒精度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液pH值對(duì)酒精度的影響Fig.2 Effect of pH value of fermentation broth on alcoholicity

在發(fā)酵過程中，適宜的pH值有助于酵母的繁殖[14]。由圖2可知，隨著發(fā)酵液pH值的增大，酒精度逐漸降低；當(dāng)發(fā)酵液pH值為4.0時(shí)，酒精度最高，為2.87%vol；當(dāng)發(fā)酵液pH值為6.0時(shí)，酒精度降至2.01%vol。表明當(dāng)酸性環(huán)境逐漸減弱時(shí)，過高的發(fā)酵液pH值會(huì)使酵母活性降低，不利于乙醇的合成[15]。因此，發(fā)酵液pH值以4.0較為適宜。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

在酵母加量為0.15%、發(fā)酵液pH值為4.0、發(fā)酵時(shí)間為48 h的條件下，考察發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcoholicity

發(fā)酵溫度是發(fā)酵過程中最重要的影響因素，溫度過低不利于酵母的繁殖，溫度過高會(huì)導(dǎo)致酵母死亡[16]。由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為38 ℃時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為3.14%vol；當(dāng)發(fā)酵溫度升至42 ℃時(shí)，酒精度迅速降至2.64%vol。這是由于，較高的發(fā)酵溫度使酵母細(xì)胞活力下降，導(dǎo)致還原糖利用不完全，乙醇產(chǎn)量降低[17]。因此，發(fā)酵溫度控制在38 ℃較為適宜。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響

在酵母加量為0.15%、發(fā)酵液pH值為4.0、發(fā)酵溫度為38 ℃的條件下，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcoholicity

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酒精度先迅速升高后緩慢降低；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，發(fā)酵未完成，酒精度為2.97%vol；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長至60 h時(shí)，酒精度達(dá)到最高，為3.62%vol；繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間至72 h時(shí)，酒精度降至3.39%vol。這是由于，發(fā)酵時(shí)間過長，雜菌形成優(yōu)勢(shì)菌群，不利于酵母的繁殖[18]，且部分乙醇轉(zhuǎn)化為酯類物質(zhì)，導(dǎo)致酒精度降低[19]。因此，發(fā)酵時(shí)間控制在60 h較為適宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，最佳工藝組合為A1B1C2D1，即酵母加量0.15%、發(fā)酵液pH值4.0、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時(shí)間54 h。此外，由極差分析可知，各因素對(duì)酒精度影響的大小順序?yàn)椋篊>D>A>B，即發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>酵母加量>發(fā)酵液pH值，其中發(fā)酵溫度對(duì)草本泥炭發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響最大。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證

將10.0 g草本泥炭粉末經(jīng)稀硫酸預(yù)處理和纖維素酶酶解后，在酵母加量為0.15%、發(fā)酵液pH值為4.0、發(fā)酵溫度為38 ℃、發(fā)酵時(shí)間為54 h的最佳發(fā)酵工藝下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酒精度達(dá)到3.82%vol，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)的最佳預(yù)測(cè)值3.6759%vol，說明正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵工藝可行。

3 結(jié)論

將草本泥炭用稀硫酸預(yù)處理后，經(jīng)纖維素酶酶解、酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的發(fā)酵工藝為：酵母加量0.15%、發(fā)酵液pH值4.0、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時(shí)間54 h，在此條件下，酒精度可達(dá)到3.82%vol。