唐 敏，楊開宇，張賽男，陳利英，劉 洋,2,3，張雪梅,2,3，齊國輝,2,3*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省核桃工程技術(shù)研究中心，河北 邢臺(tái) 054000；3.河北省(邢臺(tái))

硒是維持人體健康所必需的微量元素之一[1]，也是對(duì)植物生長發(fā)育有促進(jìn)作用的微量元素[2]，參與構(gòu)成多種抗氧化酶活性的中心，如谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶等，在體內(nèi)抗氧化過程中發(fā)揮重要作用[3]，適量的硒元素可以提高人體免疫力，延緩衰老，降低心血管疾病的發(fā)生，缺硒將導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，如克山病、大骨節(jié)病等[4]。硒元素在人體內(nèi)不能合成，只能通過外界食物吸收[5]，因此，富硒農(nóng)產(chǎn)品成為人們最理想的補(bǔ)硒途徑。近年來，人們對(duì)富硒農(nóng)產(chǎn)品的研究也越來越多，開發(fā)了富硒大米、富硒茶葉等多種農(nóng)產(chǎn)品。

硒在調(diào)控植物生長發(fā)育、改善農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)、抗氧化方面的作用引人注目，有關(guān)硒在蘋果[6]、葡萄[7]中的表現(xiàn)等方面研究得較多，研究發(fā)現(xiàn)噴施適量的硒肥能夠改善葡萄果實(shí)品質(zhì)，提高產(chǎn)量和果實(shí)硒含量[8]；硒還能緩解重金屬對(duì)植物的毒害[9]，硒元素的施入可以改變鎘脅迫下水稻植株的亞細(xì)胞分布，降低鎘的活性化學(xué)形態(tài)和增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)，從而減輕鎘脅迫對(duì)水稻的影響[10]。核桃(Juglansregia)作為人們經(jīng)常食用的養(yǎng)生堅(jiān)果，具有極高的營養(yǎng)和醫(yī)療保健價(jià)值[11-12]，深受人們喜愛。李財(cái)運(yùn)等[13]研究了葉面噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)薄殼山核桃果實(shí)品質(zhì)以及礦質(zhì)元素的影響，表明硒元素促進(jìn)薄殼山核桃果實(shí)發(fā)育與生長，影響種仁中營養(yǎng)元素的累積。但是硒對(duì)植物的促進(jìn)作用體現(xiàn)在量的控制上，即低濃度促進(jìn)、高濃度抑制[14]。有研究表明，適量的硒濃度能促進(jìn)蘿卜生長，提高產(chǎn)量，過量則會(huì)抑制其生長，還可能出現(xiàn)病變[15]，并且超過人體吸收的適宜濃度，硒元素也會(huì)對(duì)人體造成毒害，因此篩選出富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)最適硒施用濃度尤為重要。而且葉面噴硒是提高果實(shí)硒含量、改善果實(shí)品質(zhì)合理且有效的施肥方法[16]，可以提高硒元素的利用率。有關(guān)硒對(duì)核桃影響的研究還較少，尤其是硒對(duì)核桃種仁抗氧化酶活性的影響鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)核桃葉片噴施不同濃度的亞硒酸鈉，研究其對(duì)核桃種仁抗氧化酶活性及果實(shí)品質(zhì)的影響，探究核桃的最佳施硒量，為進(jìn)一步研究硒調(diào)控核桃生理機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于河北省臨城縣河北綠嶺果業(yè)有限公司核桃示范基地，該地位于太行山南段東麓臨城縣的丘陵地區(qū)，海拔80～135 m，年平均日照時(shí)間2 653 h，年平均氣溫13.0 ℃，土壤類別為褐土，土層厚度多在40～100 cm，土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%左右，pH為7.7～7.9，土壤硒含量為0.12 mg/kg，屬于低硒土壤[17]。試材為樹齡15 a的‘綠嶺’(‘Lvling’)核桃，株行距為3 m×5 m，試驗(yàn)園區(qū)排灌水條件良好，管理水平較高，無嚴(yán)重病蟲害發(fā)生，樹體健壯，生長和結(jié)果正常。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020年進(jìn)行，選擇長勢(shì)一致的15年生‘綠嶺’核桃90株，進(jìn)行葉面噴硒肥試驗(yàn)。硒肥采用分析純亞硒酸鈉，于核桃坐果初期、果實(shí)速生期、果實(shí)硬核期噴施3次，每株均勻噴施2.5 kg質(zhì)量濃度為40、80、120、 160、200 mg/L的亞硒酸鈉溶液，以噴施2.5 kg清水為對(duì)照(CK)。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，5株為1小區(qū)，3次重復(fù)，小區(qū)間至少隔1株樹作為保護(hù)株，試驗(yàn)樹生長期均不噴施其他葉面肥，其他管理照常。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

于2020年8月下旬果實(shí)成熟期采集果實(shí)，每小區(qū)采集30個(gè)果，部分樣品取仁保存于-80 ℃冰箱中，用于抗氧化酶活性的測(cè)定，其余脫青皮，洗凈，晾干，用于堅(jiān)果性狀及內(nèi)在品質(zhì)測(cè)定。

堅(jiān)果縱、橫、側(cè)徑的測(cè)定：用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺逐個(gè)測(cè)量堅(jiān)果的徑長。單果質(zhì)量的測(cè)定：用稱重法測(cè)定隨機(jī)抽取的20個(gè)果質(zhì)量，然后求均值。出仁率的測(cè)定：從核桃初樣中，隨機(jī)抽取樣品20個(gè)，逐個(gè)取仁，用精度為0.01 g的天平稱取仁質(zhì)量和堅(jiān)果質(zhì)量，計(jì)算仁質(zhì)量與堅(jiān)果質(zhì)量之比，換算百分?jǐn)?shù)，精確到0.01。

出仁率=(樣品中所取仁質(zhì)量/樣品堅(jiān)果總質(zhì)量)×100%。

(1)

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定[18]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測(cè)定[18]；過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫法測(cè)定[18]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定[18]；脂肪含量采用索式抽提法測(cè)定[19]；總蛋白質(zhì)含量采用硫酸-過氧化氫消煮，凱氏定氮儀測(cè)定[20]；可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法測(cè)定[21]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定[21]；硒元素含量采用硝酸-高氯酸消煮，原子熒光分光光度計(jì)測(cè)定[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用 Excel 2010 和 DPS 7.5、SPSS 21.0等軟件統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)，采用 Duncan 新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度亞硒酸鈉對(duì)核桃種仁抗氧化酶活性及MDA含量的影響

葉面噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液后，種仁抗氧化酶活性及MDA含量如圖1所示。由圖1可知，噴施亞硒酸鈉溶液，促進(jìn)了種仁SOD活性提高，隨著亞硒酸鈉溶液濃度的提高，種仁SOD活性呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，均顯著高于CK，噴施亞硒酸鈉質(zhì)量濃度40、80、120、160、200 mg/L,各處理較CK分別提高28.05%、30.49%、46.34%、50.61%、61.59%，噴施質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)種仁SOD活性最高，達(dá)到2.65 U/(g·min)；隨著亞硒酸鈉溶液濃度的提高，種仁POD活性呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，在噴施質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為9.30 U/(g·min)；噴施質(zhì)量濃度大于80 mg/L后，POD活性降低，當(dāng)噴施質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，POD活性最低，顯著低于CK，說明低濃度亞硒酸鈉促進(jìn)POD活性提高，高濃度則產(chǎn)生抑制作用；噴施不同濃度亞硒酸鈉后，各處理種仁CAT活性均高于CK，噴施質(zhì)量濃度為120 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為246.98 U/(g·min)，顯著高于CK和其他處理，較CK提高104.89%，與POD活性作用效果類似，低濃度亞硒酸鈉促進(jìn)CAT活性提高，高濃度產(chǎn)生抑制作用；噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液后，各處理下種仁MDA含量均低于CK，質(zhì)量濃度為120 mg/L時(shí)，MDA含量最低，為2.27 μmol/g，顯著低于對(duì)照和200 mg/L處理下的含量，質(zhì)量濃度超過120 mg/L后，MDA含量逐漸上升。

不同小寫字母代表各處理間0.05水平差異顯著。The different lowercase letters represent significant differences at the 0.05 level.圖1 噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液核桃種仁抗氧化酶活性及丙二醛含量Fig.1 Kernel antioxidant enzyme activities and malondialdehyde contents of walnut kernels by spraying different concentrations of sodium selenite solutions

2.2 不同濃度亞硒酸鈉對(duì)核桃果實(shí)品質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)核桃產(chǎn)量及外在品質(zhì)的影響

葉面噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液后，核桃產(chǎn)量及果實(shí)外在品質(zhì)如表1所示。由表1可知，隨著亞硒酸鈉溶液濃度的增加，核桃堅(jiān)果產(chǎn)量也隨之提高，但處理間差異不顯著；葉面噴施亞硒酸鈉溶液，促進(jìn)了核桃單果質(zhì)量的提高，隨著亞硒酸鈉溶液濃度的增加，這種促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)然后減弱，當(dāng)噴施質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200 mg/L時(shí)，單果質(zhì)量較CK分別提高1.19%，4.14%，4.54%，6.85%，5.89%，亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為160 mg/L時(shí)，單果質(zhì)量最大，為13.42 g；噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液，各處理間種仁出仁率無顯著差異；堅(jiān)果橫徑、縱徑均在噴施質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)達(dá)到最大，分別為33.86 mm和40.79 mm，堅(jiān)果側(cè)徑在噴施濃度為160 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為33.81 mm，顯著高于CK；亞硒酸鈉溶液質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，果形指數(shù)最大，但各處理間無顯著性差異。

表1 噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液后核桃堅(jiān)果產(chǎn)量及外在品質(zhì)

2.2.2 對(duì)核桃堅(jiān)果內(nèi)在品質(zhì)的影響

葉面噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液后，核桃果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)如表2所示，由表2可知，噴施亞硒酸鈉溶液，促進(jìn)了種仁可溶性糖的累積，隨著亞硒酸鈉溶液濃度的增加，這種促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)然后減弱。當(dāng)噴施質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200 mg/L時(shí)，可溶性糖含量較CK分別提高2.51%、6.03%、21.11%、17.59%、12.56%，當(dāng)噴施質(zhì)量濃度為120 mg/L時(shí)，可溶性糖含量最高，達(dá)到2.41%，顯著高于CK；種仁淀粉含量在噴施質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)達(dá)到最高，為0.88%，該處理顯著高于CK和其他處理，當(dāng)噴施濃度為200 mg/L時(shí)，淀粉含量低于CK；噴施亞硒酸鈉溶液，促進(jìn)了種仁可溶性蛋白的累積，隨著亞硒酸鈉溶液濃度的增加，這種促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)然后減弱，當(dāng)噴施質(zhì)量濃度為40、80、120、160、200 mg/L時(shí)，可溶性蛋白含量較CK分別提高7.14%、18.57%、20.00%、20.00%、4.29%；噴施亞硒酸鈉溶液，促進(jìn)了種仁總蛋白質(zhì)的累積，在噴施質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為23.09%，顯著高于CK及其他處理；種仁脂肪含量在噴施質(zhì)量濃度為120 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為70.70%，較CK增加3.26%；噴施亞硒酸鈉溶液提高了種仁內(nèi)硒含量，各處理均顯著高于CK，種仁硒含量隨著亞硒酸鈉溶液質(zhì)量濃度的提高而增加，含量為0.10～0.16 mg/kg，達(dá)到了富硒堅(jiān)果行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[23]，在噴施質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為0.16 mg/kg，但是上升速率由快變慢。

表2 噴施不同濃度亞硒酸鈉溶液后核桃堅(jiān)果內(nèi)在品質(zhì)

2.3 硒與抗氧化酶活性、MDA含量以及果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)性分析

核桃種仁硒元素含量與種仁抗氧化酶活性、MDA含量以及果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，在抗氧化酶活性指標(biāo)中，種仁硒元素含量與果實(shí)SOD活性呈極顯著正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為0.96，隨著種仁內(nèi)硒含量的增加，種仁SOD活性增強(qiáng)，表明硒元素促進(jìn)種仁抗氧化性增強(qiáng)；種仁硒元素含量與果實(shí)MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.87，隨著種仁內(nèi)硒含量的增加，種仁MDA含量降低，表明硒元素促進(jìn)種仁抵御外界逆境損傷，減少M(fèi)DA的累積；在果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)中，種仁硒元素含量與產(chǎn)量、單果質(zhì)量、縱徑、可溶性糖含量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.89、0.92、0.91、0.77，與橫徑、側(cè)徑呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.82、0.81，隨著種仁內(nèi)硒含量的增加，果實(shí)品質(zhì)有所提升。

表3 硒與抗氧化酶活性、MDA含量以及果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)性分析

2.4 硒對(duì)核桃種仁抗氧化酶活性及果實(shí)品質(zhì)的主成分分析

以測(cè)定的17個(gè)指標(biāo)為依據(jù)，應(yīng)用主成分分析法綜合評(píng)價(jià)噴施不同濃度亞硒酸鈉對(duì)核桃種仁抗氧化酶活性及果實(shí)品質(zhì)的影響，結(jié)果見表4。由表4可知，共提取出4個(gè)特征值大于1的主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到97.613%，說明提取的4個(gè)主成分能夠代表硒元素影響核桃綜合性狀的97.613%，因此可以選取前4個(gè)成分作為供試核桃綜合性狀的主成分。

主成分表達(dá)式用Y=aX表示，a為因子載荷量。第1主成分的函數(shù)表達(dá)式為：

Y1=0.320X1-0.099X2+0.113X3-0.246X4+0.323X5+0.308X6+0.115X7+0.308X8+0.292X9+0.289X10+0.002X11+0.299X12-0.044X13+0.189X14+0.212X15+0.264X16+0.311X17。

(2)

第1主成分的特征值為9.250，貢獻(xiàn)率為54.411%，其中SOD活性、產(chǎn)量、可溶性糖含量、橫縱側(cè)徑、單果質(zhì)量、脂肪、總蛋白質(zhì)和種仁硒含量在此主成分上有較高的載荷，說明這些是評(píng)價(jià)核桃綜合性狀的第1重要指標(biāo)。

第2主成分的函數(shù)表達(dá)式為：

Y2=-0.040X1+0.462X2+0.363X3-0.255X4-0.076X5+0.031X6-0.058X7-0.157X8-0.055X9-0.085X10+0.276X11+0.059X12+0.467X13+0.381X14-0.284X15+0.107X16+0.090X17。

(3)

第2主成分的特征值為3.827，貢獻(xiàn)率為22.512%，其中淀粉含量、可溶性蛋白含量、POD、CAT活性在此主成分上有較高的載荷，這些是評(píng)價(jià)核桃綜合品質(zhì)的第2重要指標(biāo)。

第3主成分的函數(shù)表達(dá)式為：

Y3=0.085X1-0.046X2-0.373X3-0.019X4-0.028X5+0.159X6-0.486X7-0.073X8+0.256X9+0.142X10+0.489X11-0.219X12+0.247X13-0.066X14+0.211X15-0.282X16+0.146X17。

(4)

第3主成分的特征值為2.406，貢獻(xiàn)率為14.154%，其中MDA含量、果形指數(shù)在此主成分上有較高的載荷，這些是評(píng)價(jià)核桃綜合品質(zhì)的第3重要指標(biāo)。

第4主成分的函數(shù)表達(dá)式為：

Y4=0.114X1+0.262X2+0.192X3-0.163X4+0.096X5-0.202X6+0.472X7+0.082X8+0.168X9-0.350X10+0.240X11-0.127X12-0.002X13-0.303X14+0.389X15-0.316X16+0.087X17。

(5)

第4主成分的特征值為1.111，貢獻(xiàn)率為6.537%，其中出仁率在此主成分上有較高的載荷，是評(píng)價(jià)核桃綜合品質(zhì)的第4重要指標(biāo)。

根據(jù)主成分表達(dá)式計(jì)算各處理主成分得分，最后計(jì)算各品種的綜合得分，C=0.544 11Y1+0.225 12Y2+0.141 54Y3+0.065 37Y4，計(jì)算結(jié)果見表5。由表5的綜合評(píng)價(jià)結(jié)果可知：葉面噴施120 mg/L亞硒酸鈉，核桃的綜合性狀表現(xiàn)最好，排名第1。

表4 亞硒酸鈉處理下各性狀因子載荷矩陣和貢獻(xiàn)率

表5 不同濃度亞硒酸鈉處理下主成分得分和綜合得分

3 討 論

硒與抗氧化酶活性、MDA含量以及果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)性分析表明，硒元素與核桃種仁抗氧化酶活性提高和果實(shí)品質(zhì)改善具有顯著相關(guān)。

噴施亞硒酸鈉在一定程度上促進(jìn)了葉片和果實(shí)內(nèi)SOD、POD、CAT活性提高，減少了MDA累積，增強(qiáng)了核桃植株的抗氧化性，這與有關(guān)葡萄[24]、番茄[25]方面的研究結(jié)果一致，這是因?yàn)槿~面噴施亞硒酸鈉后，在植物體內(nèi)將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，有機(jī)硒主要以含硒蛋白的形式存在，如谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶等，這些含硒蛋白協(xié)同其他酶共同作用，協(xié)調(diào)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，通過增加抗氧化酶含量和提高酶活性，促進(jìn)植株抗氧化能力增強(qiáng)，清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基。段詠新等[26]在研究硒元素在大蒜體內(nèi)的生物富集及抗氧化作用中表明，噴施一定的外源硒后，大蒜體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種含硒蛋白，能提高大蒜的抗氧化能力。

適量的硒元素可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，但當(dāng)硒濃度達(dá)到一定值時(shí)，生長發(fā)育就會(huì)受到抑制[27]。Hartikainen等[28]以黑麥草為試驗(yàn)材料得出，硒具有雙重作用：在低質(zhì)量濃度下硒可作為抗氧化劑，抑制脂質(zhì)過氧化，而在較高質(zhì)量濃度下，硒可作為促氧化劑，增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累。本試驗(yàn)中，亞硒酸鈉質(zhì)量濃度大于120 mg/L后，POD活性降低，說明低質(zhì)量濃度亞硒酸鈉促進(jìn)抗氧化酶活性提高，高濃度則起抑制作用；噴施質(zhì)量濃度為160 mg/L的種仁CAT活性顯著高于200 mg/L的處理，亞硒酸鈉質(zhì)量濃度超過120 mg/L后，MDA含量逐漸上升，質(zhì)量濃度超過160 mg/L后，單果質(zhì)量、可溶性蛋白含量開始降低等，同樣說明低濃度促進(jìn)核仁內(nèi)含物質(zhì)的累積，高濃度則起抑制作用。適量的亞硒酸鈉可改善核桃果實(shí)的外觀品質(zhì)以及內(nèi)在品質(zhì)，本試驗(yàn)研究表明，適量的硒元素可提高核桃單株產(chǎn)量，顯著提高單果質(zhì)量、橫徑、縱徑、側(cè)徑等外觀指標(biāo)，提高種仁可溶性糖、可溶性蛋白、總蛋白質(zhì)、脂肪含量，改善了核桃果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)，這是由于硒元素能提高葉片光合色素含量和葉片質(zhì)量，促進(jìn)作物光合作用，從而獲得更多產(chǎn)量和更高的品質(zhì)，高濃度硒會(huì)抑制作物光合作用，果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)就會(huì)降低[29-30]，這與賈莉芳等[31]的結(jié)果一致。王清華等[32]對(duì)冬棗噴施了不同濃度的亞硒酸鈉，得出了類似的結(jié)論，當(dāng)硒的質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)，是對(duì)冬棗最合適的施硒濃度；慈琰雨[33]對(duì)蘋果的研究表明，葉面噴硒顯著增加了‘紅將軍’果實(shí)的可溶性固形物含量，有效改善果實(shí)品質(zhì)，對(duì)提高果實(shí)品質(zhì)具有積極意義。同時(shí)，葉面噴施亞硒酸鈉可顯著提高核桃種仁內(nèi)硒含量，與在梨樹[34]、獼猴桃[35]、桃[36]樹上施用外源硒肥結(jié)果一致，并且隨著亞硒酸鈉濃度的升高，種仁內(nèi)硒含量也逐漸升高，上升速度逐漸變慢，可能即將達(dá)到硒耐受度。

適量的噴施亞硒酸鈉，可提高核桃種仁抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA累積，增強(qiáng)核桃植株的抗氧化性，改善核桃果實(shí)的外觀品質(zhì)以及內(nèi)在品質(zhì)。利用主成分分析綜合評(píng)價(jià)可知：葉面噴施120 mg/L亞硒酸鈉，核桃的綜合性狀表現(xiàn)最好。