張 成，王小燕△，王賢榮*，段一凡*，張 敏，施大偉，朱 躍，宋炎峰，柴子涵，李 嵐

(1.南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.木犀屬植物栽培品種國際登錄中心，江蘇 南京 210037)

桂花(Osmanthusfragrans)作為我國十大傳統(tǒng)名花之一，同時擁有罕見的雄全異株繁育系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，雄性和兩性桂花在花芽分化的早期并無差異，但在分化后期，兩性株的兩個心皮愈合發(fā)育成1個完整的雌蕊，而雄株的兩個心皮未能愈合，最終導致雌蕊敗育[1-2]。在桂花完成花芽分化之后的開花階段，雄性和兩性桂花花瓣的脫落情況差異顯著。雄性桂花的花瓣在末花期大量脫落，而兩性桂花花瓣脫落較少，甚至基本不脫落。由于雄性桂花花瓣脫落且方便采收，因此雄性品種桂花通常用于食品、藥品和香精等產(chǎn)品的開發(fā)；而兩性桂花能夠產(chǎn)生種子，通常被用于播種繁殖，選育變異的新品種。

光合特性可以直接反映植物的生長發(fā)育狀態(tài)，因此越來越多的研究者將光合特性用作監(jiān)測植物在不同處理或脅迫下生長發(fā)育的主要生理指標[3-4]。植物的內(nèi)源激素種類繁多，參與生長發(fā)育的各個階段。在花器官發(fā)育的復雜調控過程[5-6]中，6-BA能夠促進鈍葉柃(Euryaobtusifolia)雄性器官的發(fā)育，而茉莉酸甲酯(MeJA)能使歐洲油菜(Brassicanapus)提前開花，但同時會引起花絲變短，導致雄性不育[7-8]。桂花在花芽分化階段完成性別分化，然而雄性和兩性桂花花瓣的脫落情況差異顯著，并且缺乏花期階段基礎的生理數(shù)據(jù)。本研究比較雄性和兩性桂花在不同花期的光合及內(nèi)源激素含量的變化規(guī)律，為評價雄性和兩性桂花生長適應性及其生理生態(tài)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為南京林業(yè)大學校園內(nèi)正常生長的雄性(male,代號M)及兩性(hermaphroditic，代號H)桂花，2020年9—10月依據(jù)開花狀態(tài)，分別在初花期(少量開放、多數(shù)半閉合狀態(tài))、盛花期(開放量大于80%)和末花期(盛花期后2～3 d，且有陸續(xù)落花)進行光合測量并采集用于激素測定的花部組織材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同花期光合生理特性的測定

選取生長狀況良好，無病蟲害的雄性和兩性桂花各4株，選取每株樹冠不同方向中上部8片健康成熟的葉片，分別在初花期、盛花期和末花期天氣晴朗的9:00—12:00，利用Li-6400XT(LI-COR，美國)便攜式光合作用測量系統(tǒng)進行光合作用的測量，在光合有效輻射強度800 μmol/(m2·s)、樣品室CO2流速為500 μmol/s的條件下，記錄植株凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)及飽和水汽壓差(Vpdl)等光合指標[9-10]。

1.2.2 不同花期花部組織激素含量的測定

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)對生長素(IAA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和玉米素核苷(ZRs)5種植物激素含量進行測定，每個花期的雄花和兩性花均重復3次。稱取新鮮的不同花期雄性和兩性桂花各1 g，加2 mL樣品提取液，在冰浴下研磨成勻漿，4 ℃冰箱中提取4 h，3 500 r/min離心10 min, 取上清液。沉淀中加1 mL提取液，攪勻， 4 ℃冰箱中再提取1 h，離心，合并上清液并記錄體積。上清液過C-18固相萃取柱，過柱后的樣品轉入10 mL離心管中，真空濃縮干燥或用氮氣吹干，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容，搖勻后用于激素含量測定。具體測定方法參照Zhao等[11]進行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

參照文獻[12-13]，計算如下指標：光合作用葉片的水分利用率(EWUE)=Pn/Tr，氣孔限制值(LS)=(1-Ci/Ca)×100%(Ca為參比室CO2濃度)，葉片羧化速率(CE)=Pn/Ci。采用Excel 2016處理數(shù)據(jù)，利用SPSS 24.0分析光合參數(shù)相關性，用Origin 2018作圖。

2 結果與分析

2.1 不同花期桂花主要光合參數(shù)變化趨勢

對雄性和兩性桂花的初花期、盛花期和末花期進行光合作用的測定，結果見圖1。根據(jù)圖1可知，雄性桂花的凈光合速率在3個階段均低于兩性桂花的。雄性桂花凈光合速率(Pn)呈先下降再上升的趨勢，兩性桂花凈光合速率在初花期為最高，隨著花期的推移逐漸降低(圖1A)。雄性和兩性桂花的氣孔導度(Gs)均呈先下降后上升的變化趨勢，且末花期的氣孔導度均大于初花期(圖1A)。胞間CO2濃度(Ci)與蒸騰速率(Tr)的變化趨勢一致，均隨著花期的推移而逐漸上升，在末花期達到最高峰；初花期和盛花期雄性桂花的胞間CO2濃度高于兩性桂花，但兩性桂花從盛花期到末花期階段內(nèi)，胞間CO2濃度快速升高，最終在末花期超過雄性桂花的含量(圖1B)。蒸騰速率和胞間CO2濃度變化趨勢一致，都隨著花期的推進而不斷升高，但與胞間CO2濃度不同的是，兩性桂花的蒸騰速率在不同花期均高于雄性桂花的(圖1B)。

圖1 雄性和兩性桂花在不同花期光合作用主要參數(shù)變化趨勢Fig.1 Trends of main photosynthetic parameters of male and hermaphroditic Osmanthus fragrans at different flowering stages

2.2 不同花期桂花凈光合速率與蒸騰速率變化

經(jīng)相關性分析(表1)可知，不同花期雄性桂花的凈光合速率與氣孔導度變化趨勢一致，且平均相關性系數(shù)為0.634 3，達到極顯著正相關(P< 0.01)；與雄性桂花類似，兩性桂花在不同花期的凈光合速率與氣孔導度也呈正相關，說明氣孔導度是影響桂花凈光合速率的一個主要因子；此外，兩性桂花在不同花期的凈光合速率與水汽壓差呈極顯著負相關，平均相關性為-0.481 3 (P< 0.01)。雄性和兩性桂花的蒸騰速率與氣孔導度和胞間CO2濃度都呈正相關，表明更大的氣孔導度和更高的胞間CO2濃度會加速桂花葉片水分的蒸騰。值得注意的是，雄性桂花的凈光合速率與胞間CO2濃度在初花期和末花期為極顯著負相關，而兩性桂花的凈光合速率與胞間CO2濃度在初花期和盛花期分別為顯著正相關和顯著負相關。并且雄性和兩性桂花的蒸騰速率與飽和水汽壓差的相關性在末花期也截然相反。

表1 雄性和兩性桂花凈光合速率、蒸騰速率與環(huán)境因子的相關性

2.3 不同花期桂花的水分利用率、氣孔限制值和葉片羧化速率

凈光合速率與蒸騰速率的比值即為水分利用率(EWUE)，雄性和兩性桂花的蒸騰速率隨著花期的推進呈不斷上升趨勢，凈光合速率整體呈下降趨勢，因此水分利用率在花期內(nèi)逐漸降低；兩性桂花末花期蒸騰速率迅速升高，所以導致末花期兩性桂花水分利用率低于雄性桂花的(表2)。

表2 雄性和兩性桂花的水分利用率、氣孔限制值及葉片羧化速率

不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)。Different lowercase letters showed significant differences(P < 0.05).圖2 雄性和兩性桂花在不同花期的5種激素含量Fig.2 The five hormones content in male and hermaphroditic O. fragrans at different flowering stages

在初花期和盛花期兩性桂花的胞間CO2濃度低于雄性桂花，所以這兩階段的氣孔限制值(LS)高于雄性桂花；但在末花期，兩性桂花的胞間CO2濃度迅速升高，甚至超過雄性桂花的胞間CO2濃度，此時兩性花的氣孔限制值迅速降低至35.94%，低于雄花的42.22%。因此推測，不同花期的胞間CO2濃度是影響氣孔限制值的關鍵因素。胞間CO2濃度越低，氣孔限制值越大，能夠進入氣孔的CO2減少，光合作用降低。葉片羧化速率(CE)是凈光合速率和胞間CO2濃度的比值。在3個花期內(nèi)，兩性桂花的凈光合速率不斷降低，且胞間CO2濃度持續(xù)升高，因此兩性桂花的葉片羧化速率從初花期到末花期一直降低。但由于兩性花的凈光合速率在不同花期持續(xù)高于雄性桂花，因此在整體上，兩性桂花的葉片羧化速率高于雄性桂花。

2.4 不同花期桂花的激素含量測定結果分析

利用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對雄性和兩性桂花5種植物激素進行測定(圖2)。整體來看，在兩性桂花中含量最高的激素為脫落酸(ABA)，雄花和兩性花不同花期的平均含量分別為124.75和90.72 ng/g，表明ABA在桂花的花期中發(fā)揮重要作用；含量最低的激素為赤霉素(GA3)，雄花和兩性花不同花期的平均含量分別為3.16和2.72 ng/g。雄花和兩性花的生長素(IAA)含量在不同花期差異變化不大，雄花IAA的平均含量略高于兩性花的含量，分別為22.88和19.39 ng/g。雄花的茉莉酸(JA)含量在不同花期均顯著高于兩性花，并且在雄花中，隨著花期的延長，JA的含量逐漸升高，并在末花期達到最高峰；雄花的玉米素核苷酸(ZRs)含量在花期的變化表現(xiàn)為先上升在下降的趨勢，而兩性花的ZRs含量則一直升高。

3 討 論

植物在長期的演化過程中為適應各種復雜的環(huán)境因素，逐漸出現(xiàn)了性別分化。而性別分化之后，同種植物不同性別的個體在生長特征、生理生化特性以及基因表達等方面均存在差異[14-16]。桂花為雄全異株繁育系統(tǒng)，同時擁有雄性和兩性植株，筆者對能直接反映植物生長發(fā)育狀態(tài)的光合特性以及體現(xiàn)植物基礎生理特征的內(nèi)源激素含量進行測定研究。結果表明，氣孔導度與凈光合速率呈正相關，并且決定了通過氣孔進入細胞參與光合作用的CO2的量[17]，所以兩性桂花的氣孔導度、凈光合速率與葉片羧化速率在不同花期均大于雄性桂花。這是因為雄性桂花葉片通過光合作用積累的物質與能量只需要滿足花瓣和花藥的發(fā)育，但兩性桂花同時也需要為后續(xù)果實的發(fā)育積累更多的物質與能量。因此，兩性桂花在末花期階段，蒸騰速率和胞間CO2濃度快速增加，導致兩性桂花水分利用率變低，葉片羧化速率變慢，此時凈光合速率減慢，只需為后續(xù)果實的發(fā)育提供保障。在3個花期中，兩性桂花的氣孔導度與ABA含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，整體呈正相關； 這與前人研究結果一致[18-19]，即ABA作為內(nèi)源激素能夠調控氣孔開度，并且在末花期，ABA含量的上升對果實的發(fā)育起著積極作用。

5種激素含量的測量結果表明，雄性和兩性桂花GA3的含量在測量的5種激素中均為最低，IAA的含量在不同花期變化不顯著，因此本研究推測，GA3與IAA兩種激素在不同性別桂花的花期中可能起到的調控作用較小。此外，在兩種性別的桂花中平均含量最高的激素為ABA，前人研究表明外源ABA處理能夠加快牡丹(Paeoniasuffruticosa)和芍藥(Paeonialactiflora)的衰老進程[20-21]，而雄性桂花ABA的含量始終高于兩性桂花的，并且在雄花初花期至末花期的過程中呈現(xiàn)上升趨勢，在末花期達到峰值；與ABA的表達模式類似，雄性桂花JA的含量高于兩性桂花的，并且隨著花期的進行，JA的含量不斷升高。在擬南芥中，JA的含量誘導H2O2的積累及衰老相關基因的表達升高，最終導致葉片衰老[22-23]。因此，筆者結合前人研究[24]，推測雄花中ABA和JA的大量積累可能與雄花花瓣的衰老和大量脫落相關。ZRs與ABA、JA的表達趨勢不同，ZRs在兩性花中不斷累積。已有研究表明ZRs在花芽分化期間含量呈上升趨勢，能夠促進桂花的花芽分化[25]，結合本次研究花期中ZRs的變化趨勢，筆者推測ZRs能夠促進細胞分裂，并在開花之后果實的發(fā)育過程中也發(fā)揮積極的作用。