黃曉妹,王洪偉,韓貞艷,韋秋園,黃素靜

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科，海南 ?？?570100）

子癇前期（preeclampsia，PE）作為一種臨床常見的妊娠期并發(fā)癥，嚴(yán)重影響母嬰健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一［1］。迄今為止，PE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。既往研究［2］顯示：胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)不足是導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈功能障礙并最終形成PE的主要原因。研究［2］顯示：滋養(yǎng)層細(xì)胞的高增殖和高侵襲特性與腫瘤細(xì)胞具有一定的相似性，探究腫瘤相關(guān)分子在滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲中的作用可能對(duì)闡明PE發(fā)生機(jī)制具有積極意義。

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸且不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA序列。lncRNAs通過基因印跡、組蛋白修飾、染色體重塑、選擇性剪切和細(xì)胞周期控制等作用在表觀、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與機(jī)體的病理生理過程［3］。位于7號(hào)染色體上的lncRNA胃癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1（lncRNA gastric carcinoma high expression transcript 1，lncRNA GHET1）是一種已被證實(shí)能夠上調(diào)胃癌、肝癌、前列腺癌及宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）等能力進(jìn)而促進(jìn)疾病進(jìn)展的lncRNA［4］。對(duì)于其能否通過影響滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲能力而參與PE的進(jìn)展及其相關(guān)作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討lncRNA GHET1在PE患者胎盤組織中表達(dá)及其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞侵襲等行為的影響及其作用機(jī)制，以期為lncRNA GHET1可能成為治療及改善PE的潛在控制靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇2018年10月—2019年10月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的孕產(chǎn)婦30例作為研究對(duì)象。根據(jù)謝興等主編的第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］將研究對(duì)象分為正常對(duì)照孕產(chǎn)婦組（正常組）15例和PE孕產(chǎn)婦組（PE組）15例。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有孕產(chǎn)婦均為陰道分娩；②所有孕產(chǎn)婦年齡均在20～35歲；③所有研究對(duì)象均為自然單胎受孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)原發(fā)性高血壓或肝、腎、心、腦、糖尿病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等；②孕期使用激素類藥物或并發(fā)胎盤早剝及前置胎盤等妊娠并發(fā)癥；③既往有早產(chǎn)、宮內(nèi)死胎和胎兒染色體異常等不良分娩史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3 細(xì)胞、主要試劑和儀器人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/SVneo（HTR-8細(xì)胞）（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）。RPMI-1640（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（杭州天航生物科技有限公司），100 U·mL－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素雙抗混合液（美國(guó)Sigma公司），過表達(dá)lncRNA GHET1和陰性對(duì)照序列pcDNA 3.1載體質(zhì)粒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），Lipofectamine 3 000和TRIzol（美 國(guó)Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR ExScript RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA試劑盒和PI/RNase細(xì)胞周期流式檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），HE染色試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（北京索萊寶科技有限公司），CCK-8試 劑 盒、小 鼠 抗E-鈣 黏 蛋 白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、磷酸化糖原合成酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase 3β，p-GSK3β）和β-連 環(huán) 蛋 白（β-catenin）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗細(xì)胞性骨髓細(xì)胞瘤病病毒癌基因（cellularmyelocytomatosis viral oncogene，c-Myc）、細(xì)胞周期 素D1（cyclinD1）和GAPDH（美 國(guó)Cell Signaling Technology公司），Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD Biosciences公司）。Transwell小室（8 μm）（美國(guó)Millipore公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.4 2組研究對(duì)象胎盤組織處理孕產(chǎn)婦分娩中胎盤娩出后立即收集全層胎盤組織約20～40 g，置于冰上迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。無菌生理鹽水充分清洗血污后，將胎盤組織分為2部分，一部分固定于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行HE染色，以觀察2組胎盤組織的形態(tài)表現(xiàn)；另一部分置于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 HTR-8細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組HTR-8細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和1%青-鏈霉素DMEM-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，常規(guī)使用1%胰蛋白酶進(jìn)行消化生長(zhǎng)融合至80%HTR-8細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后，使用Lipofectamin 3 000轉(zhuǎn)染試劑將過表達(dá)lncRNA GHET1和陰性對(duì)照序列pcDNA3.1載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HTR-8細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后更換為含10%FBS的DMEM-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將HTR-8細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)）、lncRNA GHET1組（轉(zhuǎn)染過表達(dá)lncRNA GHET1質(zhì)粒）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列質(zhì)粒）。

1.6 HE染色觀察2組研究對(duì)象胎盤組織病理形態(tài)表現(xiàn)將2組研究對(duì)象的胎盤組織樣本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm厚切片，二甲苯和梯度酒精脫蠟至水，隨后使用蘇木素染色5 min，水洗1 min，氨水返藍(lán)，伊紅染色2 min，再次進(jìn)行酒精脫水和二甲苯透明，最后封片、鏡檢。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative，RT-qPCR）法檢測(cè)2組研究對(duì)象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平使用TRIzol提取胎盤組織和滋養(yǎng)層細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取RNA的純度及濃度后，按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火/延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。25 μL RT-qPCR反應(yīng)體 系：引 物10 pmol，2×SYBR ExScript kit試劑10 μL，模板3 μL，ddH2O 10 μL。RT-qPCR引物：lncRNA GHET1，F(xiàn) 5′-CCCCACAAATGAAGACACT-3′，R 5′-TTCCCAACACCCTATAAGAT-3′；GAPDH，F(xiàn) 5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，R 5′-AAGATGGTGATGGGCTTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算2組研究對(duì)象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1mRNA表達(dá)水平。

1.8 CCK-8法檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞增殖率HTR-8細(xì)胞按每孔5×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)12、24和48 h后加入10 μL CCK-8試劑，孵育3 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)的吸光度（A）值。其中以各組0 h時(shí)的A值為對(duì)照組A值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組A值－對(duì)照組A值）/對(duì)照組A值×100%。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率取HTR-8細(xì)胞，4℃預(yù)冷PBS緩沖液輕輕洗滌，胰蛋白酶常規(guī)消化，300 g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，500 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞后加入－20℃預(yù)冷70%乙醇溶液3.5 mL，4℃固定過夜。PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，按照細(xì)胞周期流式檢測(cè)試劑盒說明書方法加入500 μL PI/RNase染色液，4℃避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀分析各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率，實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.10 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞侵襲能力常規(guī)消化轉(zhuǎn)染后HTR-8細(xì)胞，將重懸于不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基中各組HTR8細(xì)胞按每孔5×104個(gè)接種于包被Martrigel基質(zhì)膠的Transwell小 室 中，Transwell上 室 加 入600 μL含15%FBS常規(guī)RPMI-1640培養(yǎng)液。每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出上室，PBS緩沖液洗滌2次，濕棉簽擦拭小室上層未穿出細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS緩沖液洗滌2次，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，并計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)，代表細(xì)胞侵襲能力。上述實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.11 Western blotting法檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞中c-Myc、cyclinD1、GSK3β、p-GSK3β、E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平采用RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑提取各組HTR-8細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量后，每組取約40 μg蛋白樣品于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。室溫下，5%脫脂奶粉封閉1 h，4℃抗體孵育過夜，包括E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、GSK3β（1∶800）、p-GSK3β（1∶800）、β-catenin（1∶1 000）、c-Myc（1∶800）、cyclinD1（1∶800）和GAPDH（1∶2 000）。次日，室溫下用過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋1∶5 000）孵育1 h。滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組研究對(duì)象年齡、分娩孕周、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、血壓、24 h尿蛋白、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量及胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平，各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖率、不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率、侵襲細(xì)胞數(shù)及各組HTR-8細(xì) 胞 中c-Myc、cyclinD1、E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋 白 表 達(dá) 水 平 及p-GSK3β/GSK3β比值均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間樣本均數(shù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組研究對(duì)象臨床資料正常組與PE組孕產(chǎn)婦 的 臨 床 資 料 中 年 齡 ［（30.31±3.06） 和（27.89±4.11）歲］、孕周［（37.12±0.40）和（35.26±0.81）周）、產(chǎn)前BMI［（22.19±1.30）和（23.11±0.84）kg·m－2］、新 生 兒 體 質(zhì) 量［（2 930.67±554.83）和（2 670.02±689.77）g］比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比 較，PE組患者 收縮壓［（112.33±2.58）和（156.10±7.09）mmHg］、舒 張 壓［（74.03±3.28）和（94.22±1.01）mmHg］及24 h尿蛋白水 平［（0.00±0.00）和（0.48±0.17）g·L－1］均明顯升高（P＜0.01），胎盤質(zhì)量［（525.17±63.30） 和 （410.73±59.10）g］ 明 顯 降 低（P＜0.01）。

2.2 2組研究對(duì)象胎盤組織病理形態(tài)表現(xiàn)HE染色結(jié)果顯示：正常組胎盤組織絨毛發(fā)育良好，絨毛內(nèi)血管密度豐富，可見少量鈣化灶和合體結(jié)節(jié)。與正常組比較，PE組胎盤組織的絨毛發(fā)育不良，數(shù)量減少，絨毛內(nèi)及間質(zhì)血管分布紊亂，血管壁出現(xiàn)纖維素樣壞死，鈣化區(qū)域及絨毛上的合體結(jié)節(jié)增加。見圖1。

圖1 2組研究對(duì)象胎盤組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×200）Fig.1 Pathomorphology of placenta tissue of subjects in two groups(HE,×200)

2.3 2組研究對(duì)象胎盤組織和各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平RT-qPCR結(jié) 果顯示：與正常組比較，PE組患者胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖2。與對(duì)照組比較，GHET1組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），陰性對(duì)照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 2組研究對(duì)象胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of lncRNA GHET1 mRNA in placenta tissue of subjects in two groups

圖3 各組HTR-8細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1 mRNA表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of lncRNA GHET1 mRNA in HTR-8 cells in various groups

2.4 各組HTR-8細(xì)胞增殖率CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，培養(yǎng)24和48 h時(shí)GHET1組HTR-8細(xì)胞增殖率明顯升高（P＜0.05），陰性對(duì)照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8法檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞增殖率Fig.4 Proliferation rates of HTR-8 cells in various groups detected by CCK-8 method

2.5 各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，GHET1組HTR-8細(xì)胞中G1期細(xì)胞百分率明顯降低（P＜0.05），S期細(xì)胞百分率明顯升高（P＜0.05），陰性對(duì)照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期HTR-8細(xì)胞百分率Fig.5 Percentages of HTR-8 cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

2.6 各組HTR-8細(xì)胞侵襲能力Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組（102個(gè)±11個(gè)）比較，GHET1組HTR-8細(xì)胞中侵襲細(xì)胞數(shù)（114個(gè)±27個(gè)）明顯升高（P＜0.05），陰性對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)（97個(gè)±19個(gè)）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫，×100）Fig.6 Invasion of HTR-8 cells in various groups detected by Transwell chamber experiment(Crystal violet,×100)

2.7 各組HTR-8細(xì)胞中c-Myc、cyclinD1、E-cadherin、Vimentin和β-catenin蛋白表達(dá)水平及p-GSK3β/GSK3β比值Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組細(xì)胞比較，GHET1組HTR-8細(xì)胞中c-Myc、cyclinD1蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05），陰性對(duì)照組HTR-8細(xì)胞中c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見 圖7。與 對(duì) 照 組 比 較，GHET1組HTR-8細(xì) 胞 中E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；陰性對(duì)照上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖8。與對(duì)照組比較，GHET1組HTR-8細(xì)胞中 β-catenin蛋白表達(dá)水平和p-GSK3β/GSK3β比 值 均 明 顯 升 高（P＜0.05），陰性對(duì)照組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖9。

圖7 Western blotting法檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of cell cycle-related proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

圖8 Western blotting法檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A)和直條圖（B)Fig.8 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of EMT-related proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

圖9 Western blotting法檢測(cè)各組HTR-8細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖（A)和直條圖（B)Fig.9 Electrophoregram(A)and histogram(B)of expressions of Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins in HTR-8 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

胎盤結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致的胎盤組織灌注減少是PE患者胎盤組織最明顯的病理特征，而滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤組織和功能維持的主要細(xì)胞，其對(duì)胎盤 組 織 的 發(fā) 育 和 形 成 具 有 重 要 作 用［1-2］。研 究［3，6］顯示：在PE表達(dá)失調(diào)的lncRNA可通過調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞功能而參與影響PE的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果表明：過表達(dá)lncRNA GHET1可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞侵襲，具有改善PE發(fā)生進(jìn)展的作用。

LncRNA GHET1被認(rèn)為是胃癌特異性lncRNA之一，研究［4］顯示：lncRNA GHET1作為一種新型的致癌lncRNA，廣泛參與促進(jìn)包括胃癌、肝癌、前列腺癌和骨肉瘤等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胃癌中，利用小干擾RNA下調(diào)腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GHET1表達(dá)能通過降低細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子c-Myc、cyclinD1和周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）等蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞阻滯于G1期，并抑制其增殖、遷移和侵襲能力［7-8］。在肝癌中，高表達(dá)的lncRNA GHET1能夠通過靶向調(diào)控激活轉(zhuǎn)錄因子1 mRNA和蛋白表達(dá)水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT［9］。在骨肉瘤中，敲除lncRNA GHET1能通過下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路減弱腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［10］。而滋養(yǎng)層細(xì)胞作為一種類似腫瘤細(xì)胞的特殊類型細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞具有一定程度的相似性。研究［11］表明：滋養(yǎng)層細(xì)胞的EMT能力是其對(duì)蛻膜組織及子宮侵襲的基礎(chǔ)。EMT是細(xì)胞表型的一種轉(zhuǎn)化過程，其主要表現(xiàn)為表皮細(xì)胞標(biāo)記物黏附分子E-cadherin表達(dá)降低和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和Vimentin等表達(dá)上調(diào)。在EMT過程中細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞間黏附能力降低，細(xì)胞極性喪失［12］。在滋養(yǎng)層細(xì)胞上表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低和Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，即細(xì)胞出現(xiàn)EMT轉(zhuǎn)化［13-14］，其有利于胚胎成功著床和胚胎的正常形成。本研究結(jié)果顯示：PE組患者胎盤組織中l(wèi)ncRNA GHET1表達(dá)水平較正常組明顯降低，過表達(dá)lncRNA GHET1能夠明顯促進(jìn)滋養(yǎng)層HTR-8細(xì)胞侵襲和EMT能力，與LI等［15］的研究結(jié)果一致，提示lncRNA GHET1能夠促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力。研究［16-17］證實(shí)：PE患者胎盤組織異常可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。因此，本研究進(jìn)一步探究lncRNA GHET1對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果顯示：過表達(dá)lncRNA GHET1可通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-Myc與cyclinD1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展及增殖活性，與其在胃癌細(xì)胞中的作用類似［7-8］。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、發(fā)育、增殖及和凋亡等生物學(xué)過程的重要途徑，也是參與影響多個(gè)器官或系統(tǒng)形成的重要機(jī)制［18-19］。國(guó)內(nèi)學(xué)者李慧等［20］研究發(fā)現(xiàn)：Wnt/β-catenin信號(hào)通路的失活導(dǎo)致滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲和增殖能力減弱。ZHANG等［21］研究證實(shí)：與正常胎盤組織比較，PE患者胎盤組織中Wnt/β-catenin信號(hào)通路種相關(guān)蛋 白p-GSK3β、β-catenin、c-Myc和cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路參與PE的進(jìn)展。此外，lncRNA GHET1同 樣 也能通 過Wnt/β-catenin信 號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為［10，22］。因此，本研 究檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：過表達(dá)lncRNA GHET1能上調(diào)GSK3β磷酸化水平和β-catenin蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，lncRNA GHET1在PE患者胎盤組織中表達(dá)較正常孕產(chǎn)婦明顯下調(diào)，過表達(dá)lncRNA GHET1可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路來促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞侵襲和EMT能力。