吳貴貴,韓 萍,鐘素珍,謝運(yùn)昌*,朱 篤,2*

(1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西 南昌 330022;2.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江西省生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330038)

0 引言

放線菌可生產(chǎn)大量種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎且活性優(yōu)良的次級(jí)代謝產(chǎn)物,是臨床藥物開(kāi)發(fā)的重要資源[1].通過(guò)發(fā)掘放線菌所蘊(yùn)含的次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)開(kāi)發(fā)新藥物,這是治療當(dāng)前極端耐藥、抗藥性疾病的有效手段之一[2-3].目前,隨著放線菌研究的深入,一種新型的菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)掘策略——OSMAC(one strain many compounds)——應(yīng)運(yùn)而生,該策略的核心思想是通過(guò)改變菌株的培養(yǎng)條件與培養(yǎng)體系的各種參數(shù)來(lái)激活單一菌株生產(chǎn)多種次級(jí)代謝產(chǎn)物[4-6].通過(guò)提升培養(yǎng)基的鹽離子濃度開(kāi)發(fā)菌株次級(jí)代謝潛能是OSMAC策略最為簡(jiǎn)便易行的方法之一,該方法已成功運(yùn)用于放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)掘領(lǐng)域中[7].

環(huán)二肽是由2個(gè)氨基酸分子通過(guò)形成肽鍵縮合而成的最小環(huán)肽,也被稱為二酮哌嗪類化合物[8-9].環(huán)二肽的命名由每個(gè)氨基酸的3個(gè)字母縮寫(xiě)加上絕對(duì)構(gòu)型前綴組成(如Cyclo(L/D-Xaa-L/D-Yaa)).環(huán)二肽含有穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)和剛性空間構(gòu)象,具有廣泛的生物學(xué)活性,是目前臨床藥用先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[10].放線菌蘊(yùn)含豐富的環(huán)二肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物,是重要的活性環(huán)二肽發(fā)掘?qū)ο骩11].在放線菌中,環(huán)二肽的生物合成途徑主要有2大類:一類是通過(guò)非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)合成環(huán)二肽;另一類是通過(guò)特異性的環(huán)二肽合酶(cyclodipeptide synthase,CDPS)以氨酰-tRNA為底物合成環(huán)二肽[12-13].這2類環(huán)二肽合成催化酶的編碼基因也可以作為分子標(biāo)記,在放線菌菌株基因組信息的指導(dǎo)下,結(jié)合鹽脅迫等OSMAC策略,可針對(duì)性地開(kāi)發(fā)放線菌環(huán)二肽活性分子.

StreptomycesalbovinaceusDSM 40136(=NRRL B-2566)是1株來(lái)源于陸生土壤的放線菌，也稱為S.globisporusDSM 40136[14].該菌株已完成了全基因組測(cè)序分析(NCBI Accession:NZ_MUAX00000000.1).基于生物信息學(xué)軟件,對(duì)該菌株的次級(jí)代謝潛能分析發(fā)現(xiàn):該菌株具有大量的肽類次級(jí)代謝生物合成基因(簇),可用于發(fā)掘以環(huán)二肽為代表的多種肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物.本文以該菌株為研究對(duì)象,選擇常規(guī)放線菌培養(yǎng)基,通過(guò)添加海鹽對(duì)菌株進(jìn)行脅迫培養(yǎng),成功地利用含海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的M-ISP4培養(yǎng)基激活菌株生產(chǎn)出具有抗腫瘤、免疫及代謝調(diào)控活性的環(huán)二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu)[15].該環(huán)二肽的成功合成,不僅有效拓展了放線菌環(huán)二肽的開(kāi)發(fā)途徑和菌株資源庫(kù),而且為放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)掘提供了良好的借鑒與參考,有利于促進(jìn)放線菌源次級(jí)代謝產(chǎn)物的綜合開(kāi)發(fā)與利用.

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)方法

S.albovinaceusDSM 40136購(gòu)自德國(guó)微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ).該菌株使用M-ISP4(可溶性淀粉1%,細(xì)菌學(xué)蛋白胨0.1%,酵母提取粉0.05%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O 0.1%,(NH4)2SO40.2%,NaCl 0.1%,CaCO30.2%,pH值為7.2～7.4,固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉1.5%～2.0%)平板在28～30 ℃下進(jìn)行傳代培養(yǎng).培養(yǎng)基配置所需試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán).

1.2 菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因(簇)分析

S.albovinaceusDSM 40136菌株的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)自NCBI(Accession:NZ_MUAX00000000.1)下載.然后將編輯成FASTA格式的菌株基因組數(shù)據(jù)上傳至antiSMASH(https://antismash.secondarymetabolites.org),分析菌株含有的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的分布信息和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù).再依據(jù)比較分析結(jié)果游離相應(yīng)的基因簇序列,進(jìn)一步利用2ndfind軟件(http://biosyn.nih.go.jp/2ndfind/)和Blast軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)游離得到的基因(簇)進(jìn)行校對(duì)修訂,最終獲取菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的分布排列信息.

1.3 菌株發(fā)酵培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的分離純化

菌株的代謝產(chǎn)物分析培養(yǎng)采用250 mL三角瓶進(jìn)行,往瓶?jī)?nèi)加入50 mL M-ISP4液體培養(yǎng)基,然后添加含海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的M-ISP4液體培養(yǎng)基.在上述2種培養(yǎng)基中分別接入約1 cm2平板培養(yǎng)的菌體,在28～30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 rpm的條件下培養(yǎng)7 d.然后發(fā)酵菌液用100 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取,萃取物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器處理后溶解于2 mL甲醇中,并取樣20 μL進(jìn)行HPLC分析.

針對(duì)環(huán)二肽產(chǎn)物的分離純化,本文采用2級(jí)發(fā)酵體系.其中第1級(jí)發(fā)酵為種子發(fā)酵,將菌株接種于50 mL添加含海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的M-ISP4液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28～30 ℃、轉(zhuǎn)速200 rpm的條件下培養(yǎng)2 d;然后將50 mL種子菌液轉(zhuǎn)接于200 mL添加含海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的M-ISP4液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，繼續(xù)在28～30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 rpm的條件下培養(yǎng)6 d.最后,將菌體與發(fā)酵液上清分離,用乙酸乙酯萃取發(fā)酵上清液中的產(chǎn)物,并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器處理成萃取浸膏.

將萃取浸膏混合在正向硅膠中進(jìn)行處理，首先進(jìn)行正向柱層析，洗脫流動(dòng)相為V(MeOH)∶V(CH2Cl2)=0∶100、2∶98、4∶96、6∶94、8∶92、1∶9、2∶8、5∶5.然后將含有環(huán)二肽產(chǎn)物的流分(V(MeOH)∶V(CH2Cl2)=2∶98)進(jìn)行分子篩柱層析,并收集含有環(huán)二肽的層析流分,進(jìn)行后續(xù)制備HPLC分離,最后將獲得的化合物純品溶解于DMSO-d6中進(jìn)行1H/13C-NMR鑒定,確定為Cyclo(L-Pro-L-Leu)分子.

1.4 菌株發(fā)酵產(chǎn)物及分離純化產(chǎn)物的HPLC分析方法

HPLC分析使用的儀器為Agilent 1260 Infinity System,使用的分析柱為Prodigy ODS-2 C-18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm).檢測(cè)使用的流動(dòng)相有:A相為15%的乙腈水溶液,含0.1%的乙酸;B相為85%的乙腈水溶液,含0.1%的乙酸.分析條件是:0～20 min,0%～80%的B相;20～21 min,80%～100%的B相;21～25 min,100%的B相;25～30 min,0%的B相.流速為1 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 S. albovinaceus DSM 40136次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)潛能的分析

通過(guò)將菌株的全基因組序列上傳至開(kāi)源生物信息學(xué)分析平臺(tái)antiSMASH,發(fā)現(xiàn)菌株具有24個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇(見(jiàn)表1).其中與環(huán)肽(包括環(huán)二肽)相關(guān)的NRPS類生物合成基因簇至少有6個(gè),這說(shuō)明菌株具有較高的肽類次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)掘前景.但菌株內(nèi)部的分析結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)CDPS類生物合成基因簇,這表明在菌株中可能不存在利用氨酰-tRNA直接合成環(huán)二肽的生物合成途徑.

2.2 S. albovinaceus DSM 40136的鹽脅迫培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物生產(chǎn)激活

針對(duì)菌株的分析結(jié)果,篩選放線菌可用的各類發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株,并進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析,同時(shí)在相同的培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的海鹽進(jìn)行菌株的脅迫培養(yǎng).從M-ISP4和M-ISP4+3%海鹽的培養(yǎng)代謝產(chǎn)物HPLC的對(duì)比分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn):菌株能夠在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的海鹽脅迫下激活生產(chǎn)一個(gè)新產(chǎn)物,且該產(chǎn)物信號(hào)保留時(shí)間為13～14 min(見(jiàn)圖1).

表1 Streptomyces albovinaceus DSM 40136次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的分析結(jié)果

(i)M-ISP4培養(yǎng)基;(ii)M-ISP4+3%海鹽;*為新產(chǎn)物信號(hào).

用5 L含海鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的M-ISP4培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大規(guī)模培養(yǎng)，富集萃取產(chǎn)物，并進(jìn)行化合物的分離純化，獲得約6 mg白色粉末的目標(biāo)產(chǎn)物純品.

2.3 Cyclo(L-Pro-L-Leu)的結(jié)構(gòu)鑒定

通過(guò)NMR分析(見(jiàn)圖2和圖3),目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征數(shù)據(jù)如下:

1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δH:4.20(1H,t,J=8.0 Hz,H-6),4.01(1H,dd,J=5.6,6.4 Hz,H-9),3.39(2H,m,H-3),2.15(1H,m,H-5a),1.94(1H,m,H-5b),1.85(2H,m,H-4),1.81(2H,m,H-10),1.38(1H,m,H-11),0.87(3H,d,J=6.4 Hz,H-12),0.86(3H,d,J=6.4 Hz,H-13).

13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δC:170.5(C,C-1),166.7(C,C-7),58.5(CH,C-6),52.7(CH,C-9),44.9(CH2,C-3),37.8(CH2,C-10),27.5(CH2,C-5),24.1(CH,C-11),22.9(CH2,C-4),22.5(CH3,C-12),22.0(CH3,C-13).

圖2 Cyclo(L-Pro-L-Leu)的1H NMR分析圖

圖3 Cyclo(L-Pro-L-Leu)的13C NMR分析圖

通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果對(duì)比，將目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確定為具有抗腫瘤、免疫及代謝調(diào)控等多種活性的環(huán)二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu)[15].結(jié)果進(jìn)一步證明該菌株含有合成該環(huán)二肽分子的功能基因，可用于后續(xù)生物合成及代謝工程研究與開(kāi)發(fā).

3 結(jié)論

本文通過(guò)鹽脅迫策略成功激活了S.albovinaceusDSM 40136生產(chǎn)環(huán)二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu).研究結(jié)果表明:鹽脅迫是一項(xiàng)切實(shí)可靠的OSMAC發(fā)掘策略，且可用于陸生放線菌菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā).此外，本文發(fā)掘了1株可生產(chǎn)具有良好生物學(xué)活性的環(huán)二肽Cyclo(L-Pro-L-Leu)的菌株，該菌株可用于后續(xù)環(huán)二肽生物合成機(jī)制研究與代謝工程改造，促進(jìn)放線菌菌株資源的綜合研究與利用.