劉軍輝，胡雪茹，曾婷婷，王肖宇，陳秋貝，郭恒盧，丹 宜，申永春，文富強(qiáng)

四川大學(xué)華西醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室呼吸病學(xué)研究室（成都，610041）

慢性阻塞性肺疾?。ê?jiǎn)稱慢阻肺）是一種慢性進(jìn)展性肺部疾病，不完全可逆性氣流受限為其主要特征，存在顯著的氣道炎癥、肺氣腫及肺部結(jié)構(gòu)和功能受損[1]。慢阻肺的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中香煙暴露是慢阻肺最重要的危險(xiǎn)因素，香煙煙霧可誘導(dǎo)氣道上皮釋放炎癥介質(zhì)活化炎癥細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng),活化的炎癥細(xì)胞釋放的過(guò)多應(yīng)激氧化產(chǎn)物同香煙中的氧化劑、自由基增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，繼而產(chǎn)生持續(xù)性的慢性炎癥，促使黏液高分泌、支氣管周纖維化及肺泡壁破壞是慢阻肺發(fā)生的主要病理機(jī)制[2-3]。因此對(duì)香煙誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激進(jìn)行系統(tǒng)研究有望為慢阻肺尋找到新的干預(yù)靶點(diǎn)與藥物，具有重要的臨床意義。

近年來(lái)不斷有研究顯示線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂參與了慢阻肺的發(fā)生發(fā)展[4-5]，文獻(xiàn)報(bào)道線粒體動(dòng)力學(xué)的異?？赡苁锹璺伟l(fā)病機(jī)制的一部分，但具體機(jī)制尚不明確[6]。線粒體融合和分裂處于動(dòng)態(tài)平衡中，在香煙等外界因素的刺激下，可能會(huì)導(dǎo)致線粒體融合和分裂的失衡，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變，進(jìn)而參與炎癥、氧化應(yīng)激等病理生理過(guò)程[7]。圍繞線粒體功能進(jìn)行研究與藥物研發(fā)，有望為慢阻肺的治療尋找到新的藥物。近年來(lái)越來(lái)越多的研究關(guān)注到Drp1，一種動(dòng)力蛋白家族GTP 酶，Drp1 表達(dá)增加，線粒體分裂增加，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，是介導(dǎo)線粒體分裂的主要蛋白，研究表明Drp1的高表達(dá)與炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)[8-9]。線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）是一種喹唑酮衍生物，通過(guò)阻斷Drp1在線粒體外的成環(huán)來(lái)抑制其GTP 酶活性以減少線粒體過(guò)度分裂，是一種選擇性線粒體分裂抑制劑[10]。研究顯示Mdivi-1通過(guò)抑制Drp1轉(zhuǎn)位到線粒體，減輕線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激對(duì)急性脊髓大鼠起保護(hù)作用[11]。最近研究Mdivi-1通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[12]。這些研究均提示Mdivi-1具有良好的抗炎癥、抗氧化應(yīng)激藥理學(xué)效應(yīng)，具備一定的臨床應(yīng)用前景，本研究擬探索Mdivi-1對(duì)香煙誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥和氧化應(yīng)激是否具有保護(hù)作用，并探討其相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型及分組

實(shí)驗(yàn)采用江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供的雄性、清潔級(jí)C57BL/6J 小鼠（8～10 周齡，體重20～25 g）。實(shí)驗(yàn)小鼠共分為4組，對(duì)照組小鼠不做任何處理；藥物對(duì)照組小鼠僅在腹腔注射Mdivi-1；單純熏煙組僅接受香煙熏煙；實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射Mdivi-1后再接受香煙熏煙，該組小鼠熏煙前半小時(shí)腹腔注射給藥1次，給藥劑量50 mg/kg，每次熏煙75 min，每天熏煙2次，每周5 d，熏煙裝置為經(jīng)鼻自動(dòng)熏煙裝置，連續(xù)熏煙4周后腹腔注射1%苯巴比妥（50 mg/kg）處死小鼠后收集樣本[13]。本研究符合善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 肺泡灌洗液收集及細(xì)胞計(jì)數(shù)

夾閉小鼠右氣管下段，置入小鼠專用留置針，注入0.5 mL冰PBS，觀察到左肺完全膨脹，說(shuō)明灌洗液已經(jīng)進(jìn)入左肺，停留3～5 s 后，低速緩慢回抽，回收至少90%灌洗液，此操作重復(fù)3 次。將收集的肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）在4 ℃、1000 g 條件下離心5 min，離心后得到的細(xì)胞沉淀進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)。

1.3 BALF炎癥因子測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒對(duì)BALF 中的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（欣博盛，深圳）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）（伊萊瑞特公司，武漢）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）（伊萊瑞特公司，武漢）濃度進(jìn)行檢測(cè)，按照說(shuō)明書的步驟實(shí)施檢測(cè)。

1.4 HE染色

左側(cè)未經(jīng)灌洗的肺組織經(jīng)固定、透明、蠟浸、包埋處理，以4 μm 厚度切片，常規(guī)進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察氣道及支氣管周圍肺組織的變化，并由一名經(jīng)驗(yàn)豐富且對(duì)實(shí)驗(yàn)干預(yù)及分組未知的實(shí)驗(yàn)人員對(duì)肺部炎癥損傷進(jìn)行評(píng)分[11]。

1.5 氧化應(yīng)激水平測(cè)定

從液氮罐中取出保存好的肺組織，制成10%勻漿，按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)肺組織勻漿中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.6 生物信息分析

在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出已公開(kāi)發(fā)表的Mdivi-1作用靶點(diǎn)基因，使用基因序列分析軟件R 語(yǔ)言進(jìn)行生物信息分析，包括基因本體（Gene Ontology,GO）分析：富集出基因的生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能。信號(hào)通路分析：使用京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集基因參與的通路。

1.7 Western Blot

取出凍存于液氮罐的肺組織，提取肺組織總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），轉(zhuǎn)膜，BSA 封閉，1 h后分別加入一抗P-P-65、P-65、IκBα、P-IκBα、Drp1、Mfn2、GAPDH（1∶1000），置于4℃孵箱中孵育過(guò)夜，洗膜，并加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000）,顯影，使用灰度檢測(cè)軟件ImageJ（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA）分別測(cè)定目的蛋白、內(nèi)參蛋白灰度值。用目的條帶灰度值/GAPDH 灰度值作為該目的蛋白的相對(duì)含量，用磷酸化蛋白灰度值/總蛋白灰度值作為該磷酸化蛋白的相對(duì)含量，再用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理及分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有值都表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，費(fèi)爾希最低顯著性差異檢驗(yàn)（Fisher’s LSD）進(jìn)行多重比較。使用R語(yǔ)言（3.6.3 版本）分析數(shù)據(jù)并準(zhǔn)備圖形。P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mdivi-1 緩解香煙誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理改變及氣道炎癥評(píng)分

與對(duì)照組比較，熏煙組可見(jiàn)明顯小鼠支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔阻塞,氣道上皮細(xì)胞增生，氣道上皮增厚，然而Mdivi-1 藥物對(duì)照組未見(jiàn)上述改變明顯，給予Mdivi-1干預(yù)可緩解前述改變，并能改善香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥評(píng)分（圖1）。

圖1 Mdivi-1緩解香煙誘導(dǎo)的小鼠肺組織病理改變及氣道炎癥評(píng)分Figure 1 Mdivi-1 alleviated CS-induced histopathological changes of lung tissue in mice and scores of airway inflammation

2.2 Mdivi-1 減輕香煙誘導(dǎo)氣道炎癥細(xì)胞激活與炎癥因子釋放

與對(duì)照組比較，熏煙組小鼠BALF 中的總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)目顯著增加，給予Mdivi-1預(yù)處理顯著降低了香煙誘導(dǎo)的小鼠BALF中總細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量上升，熏煙組小鼠BALF中的巨噬細(xì)胞較對(duì)照組比較明顯上升，但是與實(shí)驗(yàn)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2）。

圖2 Mdivi-1減少香煙誘導(dǎo)的小鼠肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)Figure 2 Mdivi-1 reduced CS-induced inflammatory cell infiltration in mouse lungs

2.3 Mdivi-1減輕香煙誘導(dǎo)氣道炎癥因子釋放

小鼠在香煙暴露4 周后，BALF 中的TNF-α、IL-6及MMP-9 釋放數(shù)量較對(duì)照組顯著增加，而Mdivi-1 藥物對(duì)照組較對(duì)照組無(wú)明顯改變。Mdivi-1 預(yù)處理能顯著減少氣道內(nèi)TNF-α、IL-6 的釋放（圖3A,B），實(shí)驗(yàn)組MMP-9 較熏煙組有下降趨勢(shì)，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。

圖3 Mdivi-1減少香煙誘導(dǎo)的小鼠肺泡灌洗液炎癥因子釋放Figure 3 Mdivi-1 reduced CS-induced release of inflammatory cytokines in the BALF

2.4 Mdivi-1減輕香煙誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)

香煙暴露4周后,小鼠肺組織SOD活性顯著低于對(duì)照組，MDA 水平顯著高于對(duì)照組，Mdivi-1 預(yù)處理能顯著增強(qiáng)SOD活性，減低CS誘導(dǎo)的MDA水平的升高（圖4A,B）。

圖4 Mdivi-1緩解香煙誘導(dǎo)的小鼠肺內(nèi)氧化應(yīng)激Figure 4 Mdivi-1 alleviated CS-induced oxidative stress in mouse lungs

2.5 生物信息分析

共檢索到Mdivi-1 的潛在作用基因100 個(gè)，GO 分析富集生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、生物學(xué)過(guò)程（BP）、分子功能（MF）及KEGG 信號(hào)通路富集到主要通路見(jiàn)圖5，其中富集到的生物學(xué)過(guò)程有線粒體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、線粒體自噬及凋亡，富集到的主要的信號(hào)通路有Tnf、Mtor、Ampk、Adipocytokine及Nod-Like受體信號(hào)通路。

圖5 Mdivi-1潛在作用基因GO分析和KEGG分析富集氣泡圖Figure 5 GO and KEGG analysis of Mdivi-1 affected genes

2.6 Mdivi-1抑制了香煙誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活

KEGG 分析富集到了Tnf 信號(hào)通路，它包括NFκB、JNK、MARK等信號(hào)通路[14]，此部分實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖沁x擇其中NF-κB 通路進(jìn)行驗(yàn)證。小鼠香煙暴露4 周后顯示：香煙誘導(dǎo)NF-κB 通路蛋白P-65，IκBα 的磷酸化水平升高，P-P-65/P-65 及P-IκBα/IκBα 相對(duì)定量升高。Mdivi-1預(yù)處理明顯抑制香煙誘導(dǎo)P-65及IκBα蛋白的磷酸化（圖6）。

圖6 Mdivi-1抑制香煙誘導(dǎo)小鼠肺組織內(nèi)NF-κB的激活Figure 6 Mdivi-1 inhibited cigarette smoke-induced activation of NF-κB in mouse lungs

2.7 Mdivi-1改善香煙誘導(dǎo)的線粒體功能障礙

小鼠香煙暴露4周后顯著降低了肺組織線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)，增加了線粒體分裂蛋白Drp1的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體功能障礙，而給予Mdivi-1 預(yù)處理可減輕此現(xiàn)象（圖7）。

圖7 Mdivi-1改善香煙誘導(dǎo)小鼠肺組織線粒體功能障礙Figure7 Mdivi-1 improved cigarette smoke-induced mitochondrial dysfunction

3 討論

本實(shí)驗(yàn)探討了線粒體分裂抑制劑Mdivi-1 在香煙誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥及氧化應(yīng)激模型中的作用及其相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mdivi-1可顯著改善香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)制探索顯示Mdivi-1預(yù)處理可抑制香煙誘導(dǎo)的p-65及IκBα磷酸化，從而抑制NF-κB信號(hào)通路激活，并且Mdivi-1預(yù)處理可下調(diào)線粒體分裂蛋白Drp1 的表達(dá),上調(diào)線粒體形態(tài)融合蛋白Mfn2 表達(dá)以改善線粒體功能，為探索Mdivi-1 在以慢阻肺為代表的慢性氣道炎癥性疾病中的運(yùn)用提供了新的探究證據(jù)。

香煙中的有毒顆粒物引起慢性氣道炎癥，是慢阻肺重要的發(fā)病機(jī)制，炎癥引起氣道及肺結(jié)構(gòu)的破壞及重塑，導(dǎo)致不可逆的氣流受限[2，15-16]。炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-18 及MMP-9 通過(guò)激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、輔助性Th1、Th17 淋巴細(xì)胞，在炎癥的觸發(fā)和擴(kuò)大起了關(guān)鍵作用[2,15-16]。中性粒細(xì)胞是香煙誘導(dǎo)氣道炎癥的重要效應(yīng)細(xì)胞，中性粒細(xì)胞也可以釋放多種促炎介質(zhì)，包括細(xì)胞因子、趨化因子和氧化劑，并可通過(guò)釋放內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式和髓過(guò)氧化物酶驅(qū)動(dòng)的亞硝酸鹽，誘導(dǎo)慢阻肺病人下氣道的細(xì)胞損傷[17]。本實(shí)驗(yàn)給予Mdivi-1 干預(yù)可顯著抑制香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥因子釋放（TNF-α、IL-6）和炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）數(shù)目增加，表明Mdivi-1 改善了香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)。在本研究中，雖然沒(méi)有觀察到Mdivi-1顯著降低BALF 中的巨噬細(xì)胞，但是仍觀察到了其下調(diào)趨勢(shì)，巨噬細(xì)胞在氣道炎癥中處重要位置，巨噬細(xì)胞分泌多種趨化因子和細(xì)胞因子，如TNF-α，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子，促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞的遷移[18-19]。既往的研究表明MMP-9可能與氣道炎癥與粘液高分泌有關(guān)，在慢阻肺的發(fā)病機(jī)制中具有一定的作用[20-21]，Mdivi-1 干預(yù)組MMP-9水平較熏煙組雖然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是仍具有較明顯的下降趨勢(shì)。這些結(jié)果提示Mdivi-1 與氣道炎癥之間調(diào)控關(guān)系可能是復(fù)雜的，還需更深層次的研究其調(diào)控機(jī)制。

氧化應(yīng)激在慢阻肺的發(fā)病機(jī)制起了重要作用[22]，氧化應(yīng)激尤其是線粒體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA 的修飾，進(jìn)而影響其功能，最終可導(dǎo)致細(xì)胞損傷及凋亡[5，22]。在本研究中，SOD 的活性及MDA 作為衡量氧化應(yīng)激指標(biāo)，給予Mdivi-1 干預(yù)可減輕香煙誘導(dǎo)的SOD 活性降低和MDA 積累，結(jié)果表明Mdivi-1改善了香煙誘導(dǎo)的氣道氧化應(yīng)激反應(yīng)，其抗氧化的效能使其具有治療氣道炎癥性疾病的潛能。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示Mdivi-1 在小鼠體內(nèi)發(fā)揮了抗炎及抗氧化作用，為尋找Mdivi-1在香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥與氧化應(yīng)激模型中潛在作用機(jī)制，本研究在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Mdivi-1作用靶點(diǎn)，對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行生物信息分析，GO富集的生物過(guò)程為線粒體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、凋亡、線粒體自噬等。香煙可誘導(dǎo)線粒體分裂及碎片化，線粒體結(jié)構(gòu)及功能異常，與慢阻肺發(fā)病密切相關(guān)[23-24]。本次GO 分析富集了線粒體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)這一生物過(guò)程提示Mdivi-1 通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體結(jié)構(gòu)參與香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥及氧化應(yīng)激。本次研究再次證實(shí)，在香煙構(gòu)建的小鼠氣道炎癥及氧化應(yīng)激模型中Drp1表達(dá)上調(diào)，Mfn2表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明香煙促進(jìn)線粒體的分裂，線粒體分裂可進(jìn)一步損傷線粒體功能及介導(dǎo)炎癥。給予Mdivi-1 干預(yù)后可上調(diào)Mfn2 表達(dá)及下調(diào)Drp1 表達(dá)以促進(jìn)線粒體融合，從而維持線粒體功能，改善氧化應(yīng)激，降低炎癥反應(yīng)。本次KEGG分析富集了Tnf信號(hào)通路，我們選擇其中的NF-κB通路進(jìn)行驗(yàn)證，并證實(shí)NF-κB通路可能參與了Mdivi-1 調(diào)控香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng)的進(jìn)程，從側(cè)面印證了本次生物信息分析的可靠性。需要注意的是，本研究有一定的局限性，比如僅有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，未在體外探討Mdivi-1 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路及線粒體功能的作用，未對(duì)其他富集的信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證等，未來(lái)還需要更多的研究進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié)論

Mdivi-1 可能通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路激活及改善線粒體功能對(duì)香煙誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥與氧化應(yīng)激起到保護(hù)作用。Mdivi-1 有可能是治療香煙誘導(dǎo)的氣道炎癥性疾病比如慢阻肺的新藥物。

（利益沖突：無(wú)）