于旭華，丁美祝，謝丹，胡佩欣，梁紫堯，范龍，林琳，許銀姬

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥科，廣東 廣州 512120)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種危害健康的全球性疾病.臨床上主要表現(xiàn)為慢性咳嗽，呼吸困難或氣短、胸悶、喘息、消瘦及疲乏等癥狀.病理上則表現(xiàn)為持續(xù)的小氣道慢性炎癥，過(guò)度的氧化應(yīng)激和金屬蛋白酶表達(dá)升高，肺上皮細(xì)胞在長(zhǎng)期炎癥的刺激下逐漸衰老損傷，并形成氣道狹窄[1].目前，COPD發(fā)生的病理機(jī)制并不完全清楚.吸煙和反復(fù)的氣道感染是COPD形成的主要因素.COPD動(dòng)物模型的制備主要以香煙暴露或聯(lián)合氣道刺激物的滴注為主要手段，然而，盡管COPD以慢性氣道炎癥為主要表現(xiàn)，但在大多數(shù)動(dòng)物模型中仍表現(xiàn)為炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)升高的急性肺部炎癥[2].

為了進(jìn)一步揭示COPD慢性或亞急性氣道炎癥發(fā)生的病理表現(xiàn)和特點(diǎn)，本研究利用較長(zhǎng)時(shí)間香煙暴露(7周)，聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)氣道反復(fù)滴注以及體外實(shí)驗(yàn)，觀察和比較香煙、LPS以及二者聯(lián)合刺激對(duì)小鼠氣道免疫細(xì)胞、氧化應(yīng)激、炎癥因子表達(dá)以及氣道上皮衰老損傷的作用.從而反映和揭示吸煙聯(lián)合反復(fù)氣道感染對(duì)氣道免疫、炎癥及組織衰老的影響.

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

脂多糖(批號(hào)：113M4068V)與2-丁酸佛波醇酯(PDB，批號(hào)：P1269-10MG)均購(gòu)自Sigma公司.NucleoZOL(Macherey-Nagel,lot：1609/001)，異丙醇購(gòu)自廣州化學(xué)試劑有限公司.SYBR Premix Ex TapTMⅡ(No.RR820)試劑盒與Prime-ScriptTMRT Master Mix(No.RR036A-1)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司.Senescence β-Galactosidase Staining Kit (#9860)購(gòu)自CST公司.大前門(mén)牌過(guò)濾嘴香煙(煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg /支)購(gòu)自上海煙草集團(tuán)有限公司.主要儀器:多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Allegra X22R), PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystem)，熒光定量PCR儀(VI A7)及顯微鏡(BX61+DP720,Olympus).

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用C57雄性小鼠(合格證號(hào)：11400700313310，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，小鼠隨機(jī)分為4組，分別為假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組，熏煙聯(lián)合假手術(shù)組，假熏煙聯(lián)合LPS組，熏煙聯(lián)合LPS組，每組8只.

熏煙方法：參考Gualano等[3]的熏煙方法.將小鼠置于18 L塑料熏煙箱中進(jìn)行熏煙.每次3支香煙，2次/d，煙霧用60 mL 注射器注入熏煙箱中.于每天早上9點(diǎn)與下午3點(diǎn)分別進(jìn)行，每次1 h，每周5 d，連續(xù)7周后取材.假熏煙組小鼠每日同一時(shí)間放入同樣大小塑料箱中，但不給予香煙暴露.

LPS滴注方法：于熏煙第28、42天熏煙前1 h，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切開(kāi)氣管處皮毛，向氣管內(nèi)以微量注射器滴入10 μg LPS/30 μL PBS，完成滴注后傾斜上提小鼠軀體，輕揉按摩肺部，使LPS盡可能均勻地分布到兩肺組織中，再縫合頸部皮膚，待小鼠清醒后再次置于籠內(nèi)正常飼養(yǎng).假手術(shù)組小鼠，給予同一時(shí)間氣道滴注30 μL PBS，其余與LPS組小鼠處理相同.

1.2.2 標(biāo)本采集與處理

實(shí)驗(yàn)第47天，采用戊巴比妥鈉致小鼠安樂(lè)死，切開(kāi)皮毛充分暴露氣管，向肺內(nèi)分4次注入1.2 mL PBS，回收支氣管肺泡灌洗液約1 mL，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，分類(lèi)計(jì)數(shù)及過(guò)氧化物檢測(cè).肺組織經(jīng)液氮快速冷凍，-80 ℃低溫環(huán)境保存.

1.2.3 體質(zhì)量記錄

每天熏煙或滴注LPS前稱(chēng)小鼠體質(zhì)量，體質(zhì)量記錄時(shí)間點(diǎn)為第0天，每周三和周日，以及滴注LPS前及之后連續(xù)3 d.

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)

將BALF靜置1 h，以3 000 r/min離心10 min后去上清液，加入500 μL的紅細(xì)胞裂解液，混勻靜置2 min 后以2 500 r /min離心5 min.棄上清液混勻取20 μL用Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù).其他的混懸液均勻涂于載玻片上，經(jīng)固定、H&E染色后進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)，計(jì)算巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等各類(lèi)細(xì)胞所占的百分比.

1.2.5 氣道灌洗液細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)定

檢測(cè)方法參照課題組之前的研究方法[4].進(jìn)行2-丁酸佛波醇酯誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激測(cè)定，選用不透光96孔板，每孔加入50 μL細(xì)胞混懸液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光測(cè)定，每孔測(cè)定1 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán).過(guò)氧化物含量=(測(cè)定值-空白值)/50 μL 細(xì)胞數(shù)×1 000.

1.2.6 RT-qPCR法檢測(cè)肺組織細(xì)胞因子

提取肺組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按TaKaRa擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格按照流程操作，檢測(cè)各組肺組織中細(xì)胞因子，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

使用微型凝膠裝置(BioRad)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)SDS-PAGE分離20 μg樣品，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.在稀釋比例為1∶1 000的Ⅰ抗4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜，常溫下孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗1 h，Ⅱ抗稀釋比例為1∶1 000，以β-actin為內(nèi)參照，用BioRad顯影儀進(jìn)行暗室中顯影，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.最后用Image lab軟件分析目的蛋白相對(duì)灰度值.

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer Sequence of RT-qPCR

1.2.8 香煙提取物的制備和細(xì)胞培養(yǎng)

將大前門(mén)香煙連接裝有25 mL DMEM培養(yǎng)基的制備裝置中，以3 mL/s的速度吸煙，并使煙霧通過(guò)培養(yǎng)基.吸煙10 s后，休息20 s，然后進(jìn)行下一次吸煙，直至吸完1支香煙[5].用0.22 μm過(guò)濾器滅菌，并確定最終溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%.最后，將香煙提取物(cigarette smoke extract,CSE)溶液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%.

將A549細(xì)胞種入24孔板，于每天8，14，20點(diǎn)分別給予質(zhì)量濃度10 μg/mL LPS或 PBS刺激1 h，之后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CSE或DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，共48 h.

1.2.9 β-gal 染色實(shí)驗(yàn)

根據(jù)β-gal 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，先用固定液固定細(xì)胞，經(jīng)PBS沖洗后，將配置的含有X-gal底物的stain buffer加入24孔板內(nèi)，避光37 ℃孵育12 h.在光學(xué)顯微鏡下，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)及比例.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0軟件分析，所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用One-way ANOVA 方法，用LSD進(jìn)行兩兩檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧及LPS氣道滴注對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量減輕情況如圖1.假熏煙小鼠氣道滴注生理鹽水后，體質(zhì)量未見(jiàn)明顯下降.與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)小鼠相比，假熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注小鼠在第30天，體質(zhì)量輕度下降1.8%(P>0.05)，在第44天，體質(zhì)量下降更加明顯6.08%(P<0.05).與假熏煙小鼠比較，熏煙小鼠體質(zhì)量明顯下降平均5.54%(P<0.05).與熏煙聯(lián)合假手術(shù)組小鼠比較，熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注小鼠在第28和42天后，體質(zhì)量未發(fā)生明顯變化(P>0.05).

1)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.051)Compared with sham+vehicle mice，P<0.05圖1 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on body weight of mice

2.2 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠BALF細(xì)胞數(shù)量的影響

BALF細(xì)胞數(shù)量如圖2.與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組小鼠相比，假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)與巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增加(P<0.01), 中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05); 熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)與巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)，中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05).與熏煙聯(lián)合假手術(shù)組小鼠相比，假熏煙聯(lián)合LPS組BALF細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)；熏煙聯(lián)合LPS組BALF細(xì)胞總數(shù)明顯增加(P<0.05)，中性粒細(xì)胞數(shù)與淋巴細(xì)胞有增多的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05).

2.3 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響

與假手術(shù)聯(lián)合假熏煙組小鼠對(duì)比，假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠及熏煙聯(lián)合LPS小鼠氣道灌洗液細(xì)胞過(guò)氧化物的產(chǎn)生均明顯增多(P<0.01).與熏煙組小鼠相比，假手術(shù)聯(lián)合LPS組與熏煙聯(lián)合LPS組小鼠過(guò)氧化物產(chǎn)出率明顯增加(P<0.05).與假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠相比，熏煙聯(lián)合LPS組小鼠氣道過(guò)氧化物產(chǎn)出速率輕度下降，無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05)(圖3).

2.4 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞因子及金屬蛋白酶mRNA表達(dá)影響

與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組相比，假熏煙聯(lián)合LPS組的小鼠肺臟組織IL-6 mRNA表達(dá)量明顯上升(P<0.05)，熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織MMP12表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與熏煙聯(lián)合假手術(shù)組相比，假熏煙聯(lián)合LPS組的小鼠肺臟組織IL-6表達(dá)量也明顯上升(P<0.01)，熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織MMP12表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠相比，熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織中IL-6表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).MMP12表達(dá)量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4).

1)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.05；2)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.01；3)與熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.05；4)與熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.01. A：灌洗液細(xì)胞總數(shù)，B：巨噬細(xì)胞總數(shù)，C：中性粒細(xì)胞總數(shù)，D：淋巴細(xì)胞總數(shù).1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05; 2) Compared with sham+vehicle group, P<0.01; 3) Compared with CS +vehicle group, P<0.05; 4) Compared with CS +vehicle group, P<0.01. A：Total number of the cells, B：Macrophages, C：Neutrophils, D： Lymphocytes.圖2 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及計(jì)數(shù)的影響Fig.2 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on number of BALF cells

1)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.05；2)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.01；3)與熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.05.

2.5 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠肺組織P16、P21表達(dá)的影響

與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組比較，熏煙聯(lián)合LPS組的小鼠肺臟組織P16和P21表達(dá)量均升高，其中，P16升高3.32倍(P>0.05), P21升高4.35倍(P<0.05).熏煙聯(lián)合假手術(shù)組和假熏煙聯(lián)合LPS組小鼠肺組織P16和P21表達(dá)輕度升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)(圖5).

2.6 香煙提取物及LPS對(duì)氣道上皮β-半乳糖苷酶活性的影響

與空白組比較，CSE+LPS組β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯高于空白組(P<0.01)，CSE處理組(P<0.01)和 LPS處理組(P<0.05)(圖6).

1)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.05；2)與熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.01；3)與假熏煙+LPS組比較，P<0.05. A：全肺組織中 IL-6的mRNA表達(dá)，B：全肺組織中 TNF-α 的mRNA表達(dá)，C：全肺組織中 IL-1β的mRNA表達(dá)，D：全肺組織中 MMP12的mRNA表達(dá).1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05; 2) Compared with CS +vehicle group, P<0.01; 3) Compared with sham+ LPS group, P<0.05. A：Expression of IL-6 mRNA in whole lung cytokines，B：Expression of TNFa mRNA in whole lung cytokines，C：Expression of IL-1beta mRNA in whole lung cytokines，D：Expression of MMP12 mRNA in whole lung cytokines圖4 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞因子及金屬蛋白酶MMP12表達(dá)的影響Fig.4 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on cytokines and MMP12 expression in lung tissues

1)與假熏煙+假手術(shù)組比較，P<0.05. A：P21,P16 條帶示意圖, B：P16蛋白相對(duì)表達(dá)量，C：P21蛋白相對(duì)表達(dá)量.1)Compared with sham+vehicle group, P<0.05. A：Representative bands of P16 and P21, B： Relative protein expression of P16, C：Relative protein expression of P21.圖5 香煙暴露7周及LPS氣道滴注對(duì)小鼠肺組織P16和P21蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of cigarette exposure for 7 weeks combined with LPS airway instillation on p-16 and p-21 expression in lung tissues

1)與空白組比較，P<0.01； 2)與CSE組比較，P<0.01；3)與LPS組比較，P<0.05

3 討論

吸煙合并感染是COPD的常見(jiàn)原因.香煙煙霧中含有多種有害物質(zhì)，目前被公認(rèn)為是許多肺部炎癥性疾病發(fā)生和發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素[6-7].LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的一種成分，可以刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞等合成釋放一系列促炎因子，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生.因此香煙煙霧刺激聯(lián)合LPS氣道滴注常作為誘導(dǎo)慢阻肺急性加重的動(dòng)物模型的重要手段[8-9].然而慢性阻塞性肺病表現(xiàn)為慢性肺部炎癥伴有全身消瘦、系統(tǒng)性慢性炎癥等特征，并常伴有反復(fù)感染.為了揭示熏煙和反復(fù)感染對(duì)肺部慢性炎癥狀態(tài)及組織修復(fù)狀態(tài)的影響，本研究運(yùn)用7周香煙熏煙暴露聯(lián)合兩次LPS氣道滴注模擬吸煙聯(lián)合反復(fù)感染的狀態(tài)，并在LPS滴注1周后，觀察小鼠體質(zhì)量、氣道炎癥及組織衰老的病理表現(xiàn).

在急性感染的過(guò)程中，體質(zhì)量下降往往代表了系統(tǒng)炎癥的發(fā)生，熏煙導(dǎo)致小鼠體重下降.其原因?yàn)椋阂皇菬熿F對(duì)氣道的長(zhǎng)期刺激導(dǎo)致氣道炎癥的發(fā)生，從而促進(jìn)了小鼠的新陳代謝，增加能量消耗導(dǎo)致體重下降; 二是尼古丁通過(guò)刺激神經(jīng)受體、影響激素分泌和脂肪代謝，抑制食欲等減輕體重[9].非熏煙小鼠在第28天氣道滴注LPS后，體重在第29、30天輕度下降，可能與炎癥刺激后食欲抑制有關(guān)；在第42天，小鼠再次滴注LPS后，第43、44天體重下降較明顯，說(shuō)明肺部二次受到刺激后，小鼠全身炎癥更加明顯.熏煙小鼠在第28和42天，氣道滴注LPS后，與熏煙但未接受LPS氣道滴注小鼠相比，體重變化無(wú)明顯差異.這可能與尼古丁本身具有食欲抑制作用有關(guān)[11]，也表明香煙暴露可能具有緩解氣道炎癥的作用.

持續(xù)的氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是COPD的重要特征.相比于假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組，假熏煙聯(lián)合LPS組BALF細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增多，而中性粒細(xì)胞數(shù)量輕度升高，說(shuō)明LPS氣道滴注1周后，進(jìn)入以巨噬細(xì)胞逐漸增多為主的亞急性炎癥或慢性炎癥階段.與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組比較，熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞總數(shù)明顯增多，中性粒細(xì)胞輕度升高，但細(xì)胞總數(shù)和巨噬細(xì)胞數(shù)目略低于假熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組小鼠，說(shuō)明香煙對(duì)氣道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)有一定抑制作用, 其機(jī)制可能與香煙抑制AP-1的激活有關(guān)[12].

有研究表明，LPS與香煙煙霧共同誘導(dǎo)的BALF中總白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量都會(huì)顯著增加[13].這與本研究結(jié)果矛盾，其原因可能與香煙作用時(shí)間和劑量有關(guān).

過(guò)度的氧化應(yīng)激和促炎因子及金屬蛋白酶的表達(dá)是COPD的另一特征.細(xì)胞過(guò)氧化物的大量產(chǎn)生是細(xì)胞發(fā)揮免疫作用、殺滅微生物的重要途徑.本實(shí)驗(yàn)中假熏煙聯(lián)合LPS滴注組與熏煙聯(lián)合LPS滴注組BALF的過(guò)氧化物產(chǎn)出率明顯高于假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組以及熏煙聯(lián)合假手術(shù)組，表明在LPS的誘導(dǎo)下，氣道免疫細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，有利于吞噬細(xì)胞對(duì)外源病原體的清除，而熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組BALF過(guò)氧化物水平較假熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組小鼠稍低，說(shuō)明熏煙可能導(dǎo)致氣道免疫細(xì)胞的功能障礙[14].

IL-6，TNF-α，IL-1β是氣道急性炎癥反應(yīng)的標(biāo)志分子.而IL-6是最早升高的炎癥標(biāo)記物.當(dāng)感染或組織損傷發(fā)生時(shí)，IL-6由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞迅速產(chǎn)生，并通過(guò)激活免疫急性反應(yīng)，有助于清除感染源和修復(fù)受損組織[15].本研究表明，與假熏煙聯(lián)合假手術(shù)組相比，假熏煙聯(lián)合LPS滴注組小鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)明顯升高，TNF-α、IL-1β mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變，說(shuō)明假熏煙聯(lián)合LPS滴注組小鼠肺組織處于急性或亞急性炎癥階段，而熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注組小鼠肺部IL-6無(wú)明顯升高，IL-1β輕度升高(P>0.05)，說(shuō)明熏煙聯(lián)合LPS氣道滴注可能比單純LPS氣道滴注小鼠更早進(jìn)入慢性炎癥階段.也有研究表明，在煙霧刺激基礎(chǔ)上加以LPS的刺激會(huì)導(dǎo)致漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量降低，其分泌細(xì)胞因子與腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6和Toll 樣受體(toll-like receptors，TLR)等促炎因子的水平均降低[16].MMP12由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是促進(jìn)彈性蛋白降解的一種金屬蛋白酶.MMP12的超表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，并存在于各種炎癥反應(yīng)[17].MMP12的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致病理性細(xì)胞外基質(zhì)降解和過(guò)度的氣道重塑，促進(jìn)一些急性和慢性肺部疾病的宿主免疫炎癥反應(yīng)并參與肺氣腫的形成[18-20].與假熏煙聯(lián)合LPS滴注組相比，熏煙聯(lián)合LPS滴注組的MMP12表達(dá)量明顯上升，表明熏煙可能會(huì)加重LPS誘導(dǎo)的氣道重塑.

肺上皮的功能衰退是COPD的另一特征，其機(jī)制可能與細(xì)胞衰老有關(guān).細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性明顯升高，可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志物，而P21以及P16是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，它們的表達(dá)水平與細(xì)胞衰老的反映相關(guān)[21].Yue等[22]研究表明，LPS可以促進(jìn)肺上皮細(xì)胞衰老，增加β-gal活性，其作用依賴(lài)于蛋白P53.P16和P21是P53基因下游最重要的基因之一，它的表達(dá)增加多是由于響應(yīng)各種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激，以阻止細(xì)胞周期，確?；虻姆€(wěn)定性[23].Cottage等[25]研究表明，在CS誘導(dǎo)的肺上皮衰老模型中，MMP12顯著上調(diào)[24].P16的敲除可以減少香煙煙霧誘導(dǎo)的肺組織MMP12及細(xì)胞因子的表達(dá)，減少肺組織的衰老和肺氣腫的形成.

本實(shí)驗(yàn)表明香煙提取物聯(lián)合LPS的反復(fù)刺激，明顯增加A549細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性，并且其活性明顯高于單純LPS或香煙提取物刺激，說(shuō)明香煙煙霧聯(lián)合LPS的反復(fù)刺激明顯促進(jìn)了上皮細(xì)胞的衰老.與此同時(shí)，各組小鼠肺組中P16和P21的表達(dá)趨勢(shì)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一致.這進(jìn)一步證實(shí)了香煙煙霧聯(lián)合LPS反復(fù)刺激可加劇氣道上皮的衰老，并提示可能與P53信號(hào)通路相關(guān).

綜上所述，香煙煙霧聯(lián)合LPS反復(fù)刺激可誘導(dǎo)氣道炎癥和氧化應(yīng)激，且其程度低于單純LPS反復(fù)刺激，符合慢性/亞急性炎癥改變；但香煙煙霧聯(lián)合LPS反復(fù)刺激明顯加劇了氣道上皮細(xì)胞衰老，且衰老標(biāo)志物明顯高于單純LPS反復(fù)刺激組.因此，香煙煙霧促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞衰老，并不依賴(lài)于炎癥的加劇，可能與P53信號(hào)通路相關(guān)，且有待進(jìn)一步研究.本研究揭示了7周香煙暴露聯(lián)合LPS反復(fù)滴注誘導(dǎo)的肺部慢性/亞急性炎癥動(dòng)物模型中氣道上皮明顯衰老的病理表現(xiàn)，對(duì)于揭示COPD發(fā)生病理機(jī)制具有重要意義.